A descelularização de órgãos inteiros produz andaimes biológicos naturais que podem ser usados para medicina regenerativa. A descrição de um modelo de regeneração pulmonar de primatas não humanos em que pulmões inteiros são descelularizados e depois semeados com células-tronco adultas e células endoteliais em um biorreator que facilita a circulação vascular e a ventilação em meio líquido é apresentada.
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Artigo de método
Descelularização e recelularização pulmonar de primatas não humanos usando um biorreator especializado de órgãos grandes
Neste artigo
Resumo
Resumo
Há um número insuficiente de pulmões disponíveis para atender às necessidades atuais e futuras de transplante de órgãos. A regeneração bioartificial de tecidos é uma alternativa atraente ao transplante clássico de órgãos. Essa tecnologia utiliza a matriz extracelular biológica natural (MEC) de um órgão como um andaime no qual células autólogas ou células-tronco / progenitoras podem ser semeadas e cultivadas de forma a facilitar a regeneração do tecido original. A ECM natural é isolada por um processo chamado descelularização. A descelularização é realizada tratando os tecidos com uma série de detergentes, sais e enzimas para obter a remoção eficaz do material celular, deixando a ECM intacta. Estudos realizados utilizando descelularização e subsequente recelularização de pulmões de roedores demonstraram sucesso marginal na geração de tecido semelhante a um pulmão capaz de troca gasosa in vivo. Embora ofereçam uma prova de conceito essencial, os modelos de roedores não são diretamente traduzíveis para uso humano. Os primatas não humanos (NHP) oferecem um modelo mais adequado para investigar o uso da produção de órgãos bioartificiais para eventual uso clínico.
Os protocolos para alcançar a descelularização completa dos pulmões adquiridos do macaco rhesus NHP são apresentados. Os pulmões acelulares resultantes podem ser semeados com uma variedade de células, incluindo células-tronco mesenquimais e células endoteliais. O manuscrito também descreve o desenvolvimento de um sistema de biorreator no qual pulmões de macacos semeados por células podem ser cultivados sob condições de estiramento mecânico e tensão fornecidas pela ventilação com pressão negativa, bem como perfusão pulsátil através da vasculatura; Essas forças são conhecidas por direcionar a diferenciação ao longo das linhagens pulmonar e endotelial, respectivamente. São fornecidos resultados representativos de descelularização e semeadura celular.
Introdução
A bioengenharia de tecidos e órgãos é uma adição atraente ao campo da medicina regenerativa. A criação de órgãos "cultivados em laboratório" adequados para transplante em pacientes para substituir a funcionalidade de órgãos doentes é altamente desejável para atender à demanda atual e futura por necessidades de transplante. Os princípios da engenharia de tecidos giram em torno da semeadura dos tipos de células desejados, ou seus progenitores, em um andaime que suporta a forma do tecido projetado, ao mesmo tempo em que fornece os fatores de crescimento apropriados e as condições de cultura necessárias para imitar os processos de desenvolvimento ou regenerativos. Embora os andaimes sintéticos tenham sido usados para engenharia de tecidos, a matriz extracelular natural (MEC) pode ser a melhor fonte de andaimes específicos de órgãos para esse fim. A descelularização de órgãos inteiros é um processo que permite a remoção de células, deixando intactos os aspectos químicos e estruturais da MEC nativa. O andaime de matriz acelular resultante pode ser usado como uma plataforma na qual as células regenerativas podem ser semeadas e cultivadas in vitro1,2.
Vários modelos de descelularização pulmonar e subsequente recelularização de roedores foram desenvolvidos para estudar a viabilidade dessa tecnologia3-6. Embora ofereçam uma prova de conceito essencial, os modelos de roedores não são diretamente traduzíveis para as necessidades clínicas humanas. Um estudo recente apontou que as respostas genômicas à lesão traumática (e inflamação relacionada) não se correlacionam bem entre camundongos e humanos; Essas descobertas levantam questões sobre a validade do uso de camundongos como modelos para processos bioquímicos tão complexos em humanos7. Os modelos de primatas não humanos (NHP) oferecem a vantagem de se assemelhar muito à biologia dos humanos nos níveis genômico, anatômico e fisiológico e permitem uma manipulação mais flexível para maior extrapolação para uso humano. O macaco rhesus tem sido usado em uma variedade de aplicações pré-clínicas e é um excelente modelo para estudar engenharia de tecidos8-11. Recentemente, descrevemos a descelularização bem-sucedida de pulmões de macacos rhesus (Macacca mulatta) utilizando um procedimento que tem impacto mínimo na MECpulmonar 12. A descelularização pulmonar é realizada tratando o tecido consecutivamente com quatro soluções de descelularização compostas por detergentes, sais e enzimas com lavagem intermitente com água deionizada (dH2O) e PBS. Otimizamos esse procedimento modificando um protocolo originalmente descrito por Price et al.4 Uma variedade de técnicas histológicas e analíticas de proteínas foi usada para caracterizar os componentes das matrizes acelulares resultantes em relação aos pulmões nativos dos macacos.
Neste relatório, demonstramos um protocolo detalhado para a descelularização de pulmões de primatas não humanos e a recelularização dos andaimes pulmonares acelulares resultantes em um biorreator de grandes órgãos originalmente demonstrado por Calle et al. 13 em JoVE. Ao modificar seu protocolo original para acomodar os requisitos de tamanho, ventilação e perfusão para pulmões de animais de grande porte, a tecnologia foi movida com sucesso do modelo de roedor para o modelo de macaco rhesus. Todos os estudos apresentados neste relatório foram realizados de acordo com as políticas do Comitê Institucional de Biossegurança (IBC) em vigor no Centro Nacional de Pesquisa de Primatas de Tulane. A demonstração dessa técnica é essencial, pois a identificação de estruturas anatômicas e a manipulação física de órgãos maiores às vezes são difíceis sem visualizar as etapas do protocolo. Os estudos possibilitados por esses métodos fornecem uma base para estudos pré-clínicos essenciais em pulmões de macacos rhesus descelularizados, nos quais a recelularização com células-tronco de linhagem mesenquimal rhesus e células endoteliais microvasculares rhesus pode ser avaliada. Nossa versão desse biorreator simula o ambiente de desenvolvimento e aplica forças de estiramento e tensão mecânica em pulmões de animais de grande porte e permite a investigação da recelularização pulmonar em condições conhecidas por facilitar o desenvolvimento pulmonar e endotelial13-15.
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Protocolo
1. Descelularização pulmonar de macaco de órgão inteiro
- Preparação de soluções
- Autoclave 10-15 L de água deionizada (dH2O) em garrafas de 1-2 L.
- Prepare a "solução de Tritão" (0,1% de Triton X-100 em dH2O) misturando 1 ml de Triton X-100 em 999 ml de dH2O, mexendo em um agitador magnético. Filtrar a solução através de um aparelho filtrante de 0,22 μm. Armazene em temperatura ambiente.
- Prepare a "solução SDC" (SDC 2% em dH2O) adicionando lentamente 20 g de desoxicolato de sódio (SDC) a ~ 900 ml dH2O enquanto agita. Uma vez dissolvido o SDC, transferir a solução para uma proveta graduada e levar o volume a 1 ml com dH2O. Filtrar a solução através de um aparelho filtrante de 0,22 μm. Armazene em temperatura ambiente.
- Prepare a "solução de NaCl" adicionando 58 g de NaCl a ~ 900 ml de dH2O e mexa até dissolver completamente. Adicione dH2O a um volume final de 1 L, filtre e armazene em temperatura ambiente.
- Preparação de órgãos
- Deve-se tomar o máximo cuidado para evitar incidentes de exposição infecciosa ao trabalhar com tecidos de macacos. Coloque o seguinte equipamento de proteção individual (EPI) antes de manusear tecidos de primatas não humanos: máscara cirúrgica, protetor facial, luvas cirúrgicas, avental descartável e uma segunda camada de luvas cirúrgicas.
- Colete blocos coração-pulmão intactos da necropsia animal em PBS contendo 50 U / ml de heparina para evitar a coagulação do sangue externo.
- Com os pulmões deitados em uma bandeja de dissecação, canule a artéria pulmonar usando um conector Luer fêmea com uma farpa de tamanho apropriado. Prenda a cânula no lugar com uma braçadeira esterilizada com álcool.
- Deslize uma braçadeira estéril ao redor da traqueia, insira um conector Luer fêmea de 0.250 pol na abertura traqueal e aperte a braçadeira ao redor da farpa do conector para manter a traqueia no lugar ao redor da farpa.
- Remova o ar retido dos pulmões instilando PBS contendo 30 U / ml de heparina e 5 μg / ml de nitroprussiato de sódio (SNP). Deixar expelir a solução por recuo natural e repetir a instilação mais duas vezes. Após a terceira instilação, tampe a cânula Luer traqueal com um tampão Luer para manter a solução nos pulmões.
- Corte o ápice do coração e irrigue os ventrículos internos com PBS-heparina-SNP para remover o sangue residual. Lacere ambos os átrios para facilitar a drenagem do circuito pulmonar após a perfusão.
- Mergulhe o bloco coração-pulmão em dH2O. Encha uma seringa de 60 ml com a solução PBS-heparina-SNP. Usando uma pinça, mergulhe a cânula arterial para que todas as bolhas de ar escapem da abertura vascular. Colocar a seringa e remover cuidadosamente o êmbolo e deixar o líquido fluir para a vasculatura.
- Remova o tampão da cânula traqueal e permita que o fluido nas vias aéreas seja expelido por recuo natural. Continue a adicionar solução de PBS-heparina-SNP à seringa conectada à cânula vascular para manter a pressão de ~ 15-20 cm H2O acima da artéria. Continue a perfusão até que o máximo de sangue possível seja removido da vasculatura pulmonar.
- Descelularização
- Dia 1: Mergulhe o bloco coração-pulmão em dH2O. Infle e perfunda o pulmão com dH2O usando seringas de 60 ml presas às cânulas traqueal e arterial submersas, respectivamente. Repita as lavagens das vias aéreas e vasculares com dH2O 4x mais para um total de cinco lavagens.
- Remova os pulmões da água e mergulhe o bloco na solução de Triton. Infle e perfunda os pulmões com solução de Triton como antes. Repetir a instilação uma segunda vez e incubar os órgãos submersos em solução de Triton durante a noite a 4 °C.
- DIA 2: Após a incubação durante a noite, remova o bloco pulmonar da solução de Tritão, lave externamente com dH2O e, em seguida, mergulhe o bloco em dH2O fresco. Repita as lavagens de dH2O 5x como na etapa 1.3.1.
- Remova os pulmões do dH2O e mergulhe em solução SDC. Encha e perfunda com a solução SDC da mesma maneira que na etapa 1.3.2. Incubar submerso em solução SDC durante a noite a 4 °C.
- DIA 3: Lavar novamente o tecido com dH2O, como indicado no ponto 1.3.1.
- Remova o tecido do dH2O e mergulhe em solução de NaCl. Inflar e perfundir com solução de NaCl da mesma forma que no passo 1.3.2. Incubar submerso em solução de NaCl por 1 hora em temperatura ambiente.
- Lave os pulmões da solução de NaCl com dH2O, como na etapa 1.3.1.
- Prepare uma "solução de DNase" fresca (30 μg / ml de DNase, 1,3 mM de MgSO4, 2,0 mM de CaCl2 em dH2O) Banhe os pulmões nesta solução e instile nas vias aéreas e na vasculatura como na etapa 1.3.2. Incube os pulmões em solução de DNase por 1 hora em temperatura ambiente.
- Prepare uma "solução PBS" fresca (1x PBS + 5x antibiótico/antimicótico). Remova os pulmões da solução de DNase e lave externamente com solução de PBS. Mergulhe os pulmões na solução de PBS e lave com esta solução cinco vezes, como na etapa 1.3.1.
- Conservar os pulmões em solução de PBS num recipiente selado durante a noite a 4 °C. No dia seguinte (DIA 4), lavar os pulmões em solução fresca e gelada de PBS cinco vezes, como no passo 1.3.1, e conservar em solução de PBS num recipiente esterilizado e selado a 4 °C até à utilização.
2. Biorreator de órgãos grandes
- Montagem e instalação de tecidos
- Monte as estruturas da alça respiratória e da alça vascular, bem como os adaptadores das cânulas traqueais e vasculares com antecedência (Figura 1). Com exceção de filtros de ar embalados estéreis e portas de seringa, autoclave todos os componentes do biorreator.
- Monte os componentes do biorreator sob uma capela de fluxo laminar de acordo com o esquema da Figura 2. Encher a câmara principal com meio de cultura que tenha sido equilibrado à atmosfera de 5% de CO2 de uma incubadora de cultura de células imediatamente antes da utilização no biorreator.
- Aplique os adaptadores das cânulas traqueais e vasculares nas cânulas pulmonares e instale os órgãos na câmara principal do biorreator, banhando os pulmões no meio de cultura e conectando os adaptadores das cânulas às portas apropriadas na tampa modificada. Uma vez conectado, fixe a tampa com firmeza e firmeza; A câmara não será aberta novamente durante a recelularização.
- Encher o reservatório traqueal com meio de cultura e afixar a tampa modificada.
- Aplique filtros de seringa estéreis de 0,22 μm, plugues Luer e portas de seringa em todas as câmaras, conforme indicado.
- Conecte o reservatório da traqueia à câmara principal por meio do aparelho de loop respiratório. Conecte o tubo do loop respiratório conforme indicado.
- Aspirar o ar do tubo utilizando as portas da seringa e uma seringa de 60 ml equipada com uma agulha de 18 G; deslocar a direcionalidade das torneiras de 3 vias para direcionar o fluxo de líquido para a seringa.
- Mova as câmaras de biorreatores seladas e conectadas contíguamente com órgãos instalados para uma incubadora de cultura de tecidos para equilibrar temperatura e gás. Ventile os pulmões usando uma bomba de seringa conectada à câmara principal a ~ 1 "respiração" completa a cada 2 min e perfunda a vasculatura através da bomba peristáltica a aproximadamente 10 ml / min por um total de ~ 30 min.
- Semeadura das vias aéreas
- Prepare suspensões de células a serem semeadas nas vias aéreas na densidade celular desejada (o volume dependerá do tamanho do órgão).
- Encha os pulmões com a suspensão celular injetando suavemente através da porta da seringa conectada à torneira de três vias no circuito respiratório.
- Mantenha os pulmões estaticamente a 37 °C, 5% de CO2 durante a noite, sem vias aéreas ou perfusão vascular para permitir que as células se liguem à matriz pulmonar descelularizada.
- Após a incubação durante a noite, reinicie o programa padrão de ventilação das vias aéreas e cultive os órgãos por 3-7 dias (ou outra duração desejada).
- Semeadura vascular
- Prepare suspensões de culturas de células endoteliais como acima para semeadura de células das vias aéreas.
- Transfira a suspensão celular para o reservatório de semeadura endotelial que contém uma pequena barra de agitação magnética.
- Altere a direcionalidade do caminho do fluxo da câmara principal para o reservatório de semeadura endotelial girando a válvula na torneira posicionada na tubulação que conecta esses dois compartimentos e semeie as células endoteliais gradualmente enquanto agita suavemente usando a bomba peristáltica.
- Quando a semeadura estiver completa (ou seja, o volume da suspensão de células endoteliais estiver esgotado no reservatório de semeadura endotelial), interrompa a perfusão e incube estaticamente por ~ 4-6 horas. Reinicie a perfusão vascular com meio da câmara principal a uma taxa de ~ 10 ml / min (ou pressão desejada, se monitorada).
- Cultura por 3-7 dias com perfusão vascular contínua.
3. Solução de problemas e abordagens alternativas
- Canulação traqueal: As suturas podem ser usadas no lugar de uma braçadeira para manter a cânula Luer no lugar se a traqueia for muito pequena. Uma conexão Luer fêmea de 1/4 de polegada atua como uma cânula suficiente para uma ampla gama de diâmetros de traqueia.
- Remoção de sangue por perfusão da artéria pulmonar: Como os tecidos são coletados de animais cadavéricos, os microtrombos são comuns e impedem que algumas áreas do leito capilar pulmonar sejam completamente limpas de sangue residual. Durante a descelularização, no entanto, esses pequenos vasos tornam-se permeáveis e os reagentes de descelularização lisam e degradam eficientemente esses coágulos. A perfusão de pré-descelularização deve ser realizada para limpar o máximo de sangue possível, mas não é necessário remover todos os vestígios de sangue do parênquima.
- Expulsão de fluidos dos pulmões: Os pulmões dos macacos retêm um forte recuo natural ex vivo, mesmo quando inflados com fluidos. Durante a descelularização, no entanto, as células são lisadas e liberam materiais (incluindo DNA) que aumentam a viscosidade dos fluidos instilhos, tornando-os mais difíceis de expelir. A incubação durante a noite a 4 °C, enquanto submersa no fluido instilho, é geralmente suficiente para permitir que os pulmões expulsem completamente o fluido viscoso. Em alternativa, deixar expelir dos pulmões o máximo de líquido possível e, em seguida, proceder à instilação das soluções subsequentes; A adição de detergentes e lavagens com água deionizada geralmente facilita a remoção dos fluidos viscosos e permite que a descelularização prossiga com eficiência.
- Adição de antibióticos às soluções detergentes: Antibióticos e antimicóticos podem ser adicionados às soluções de lavagem com água deionizada, bem como às soluções detergentes; no entanto, a penicilina/estreptomicina precipita na presença de desoxicolato de sódio, e esses precipitados podem interferir nos processos de descelularização e lavagem. Além disso, a presença de antibióticos / antimicóticos não é necessária durante a descelularização, pois os detergentes usados nessas concentrações são capazes de lisar e matar micróbios. Após a descelularização, o enxágue e o armazenamento com solução de PBS (contendo 5x penicilina/estreptomicina/anfotericina B) são suficientes para evitar a maior parte da contaminação.
- Remoção de ar da tubulação do biorreator: O ar é aspirado de forma eficiente da tubulação do biorreator usando uma seringa com uma agulha inserida nas portas da agulha nas torneiras de três vias. Alternativamente, 1x PBS ou meio de cultura pode ser lavado através do tubo antes de instalar os órgãos usando uma seringa conectada da mesma maneira.
- Ventilação e perfusão dos pulmões durante e após a recelularização: Embora as taxas de fluxo e os tempos listados neste relatório tenham sido suficientes para a fixação celular, bem como a ventilação líquida das vias aéreas e a perfusão vascular, esses valores devem ser determinados empiricamente pelo usuário. Os tempos de cultura também podem ser ajustados com base nas taxas de crescimento das células instiladas.
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Resultados
Os resultados apresentados abaixo representam experimentos separados nos quais os compartimentos das vias aéreas ou vasculares foram semeados com células-tronco mesenquimais derivadas da medula óssea de macaco-rufo ou com células endoteliais microvasculares derivadas do pulmão de macaco-rufo, respectivamente, que foram isoladas e caracterizadas conforme descrito anteriormente16-18.
Durante todo o processo de descelularização, os pulmões de macaco exibiram um embranquecimento progres...
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Discussão
Os tecidos podem ser eficientemente e efetivamente descelularizados por vários métodos que empregam agentes físicos, químicos e enzimáticos12,20. Os desafios de produzir matrizes biológicas 3D a partir de grandes órgãos incluem a necessidade de grandes volumes de soluções de descelularização, equipamentos comerciais caros (ou seja , biorreatores) e uma quantidade estonteante de perturbações metodológicas necessárias para obter o produto final derivado de tecido. Nosso método fornece uma abordagem dire...
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Divulgações
Não temos nada a divulgar.
Agradecimentos
Os autores agradecem aos editores da Tissue Engineering por permitirem que imagens de uma publicação anterior fossem utilizadas neste relatório.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Nitroprussiato de sódio | Sigma-Aldrich | 71778-25G | |
| Sal de heparina sódico | Fisher | BP2425 | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-100 | |
| Desoxicolato de sódio | Fisher | BP349-100 | |
| Cloreto de sódio | Fisher | 7647-14-5 | |
| DNase pancreática bovina | Sigma-Aldrich | DN25 | Prepare estoque, alíquota e congele |
| Sulfato de magnésio | Fisher | 10034-99-8 | |
| Cloreto de cálcio | Fisher | C614-500 | |
| PBS (sem Ca/Mg) | Gibco, Life Technologies | 10010-031 | |
| Antibiótico-Antimicótico | Gibco Life Technologies | 15240062 | |
| Cell Culture Media | |||
| Alpha MEM | Gibco Life Technologies | 12561-072 | |
| Médio 199 | Gibco Life Technologies | 11150067 | |
| Soro Fetal Bovino Premium | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| L-Glutamina 100x | Gibco Life Technologies | 25030-081 | |
| Suplemento de Crescimento de Células Endoteliais (ECGS) | ScienCell | 1052 | |
| Antibiótico-Antimicótico | Gibco Life Technologies | 15240062 | |
| Válvulas de retenção de cultura de células e semeadura de células | |||
| Cole-Parmer | EW-98553-20 | ||
| Conectores Y | Cole-Parmer | ED-30614-08 | |
| Torneiras de 3 vias | Harvard Apparatus | 721664 | |
| MasterFlex L/S 14 tubulação | Cole-Parmer | 96420-14 | |
| MasterFlex L/S 16 tubulação | Cole-Parmer | 96420-16 | |
| Bloqueio masculino Luer 1/8 in | Cole-Parmer | EW-45505-04 | |
| Fêmea Luer 1/8 in | Cole-Parmer | SI-45502-04 | |
| Macho Luer lock plug | Cole-Parmer | EW-45505-56 | |
| Portas de injeção | Medi-Dose EPS | IV2004 | |
| Tubo de látex | St. Louis Medical Suppy | HN10910 | |
| Braçadeira de mangueira | Cole-Parmer | EW-06832-02 | |
| Frasco de boca larga de 2 L | Fisher | 05-719-276 | |
| Seringas de 60 ml | Fisher | NC9035364 |
Referências
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Reimpressões e permissões
