Descelularização e recelularização pulmonar de primatas não humanos usando um biorreator especializado de órgãos grandes

Summary

A descelularização de órgãos inteiros produz andaimes biológicos naturais que podem ser usados para medicina regenerativa. A descrição de um modelo de regeneração pulmonar de primatas não humanos em que pulmões inteiros são descelularizados e depois semeados com células-tronco adultas e células endoteliais em um biorreator que facilita a circulação vascular e a ventilação em meio líquido é apresentada.

Abstract

Há um número insuficiente de pulmões disponíveis para atender às necessidades atuais e futuras de transplante de órgãos. A regeneração bioartificial de tecidos é uma alternativa atraente ao transplante clássico de órgãos. Essa tecnologia utiliza a matriz extracelular biológica natural (MEC) de um órgão como um andaime no qual células autólogas ou células-tronco / progenitoras podem ser semeadas e cultivadas de forma a facilitar a regeneração do tecido original. A ECM natural é isolada por um processo chamado descelularização. A descelularização é realizada tratando os tecidos com uma série de detergentes, sais e enzimas para obter a remoção eficaz do material celular, deixando a ECM intacta. Estudos realizados utilizando descelularização e subsequente recelularização de pulmões de roedores demonstraram sucesso marginal na geração de tecido semelhante a um pulmão capaz de troca gasosa in vivo. Embora ofereçam uma prova de conceito essencial, os modelos de roedores não são diretamente traduzíveis para uso humano. Os primatas não humanos (NHP) oferecem um modelo mais adequado para investigar o uso da produção de órgãos bioartificiais para eventual uso clínico.

Os protocolos para alcançar a descelularização completa dos pulmões adquiridos do macaco rhesus NHP são apresentados. Os pulmões acelulares resultantes podem ser semeados com uma variedade de células, incluindo células-tronco mesenquimais e células endoteliais. O manuscrito também descreve o desenvolvimento de um sistema de biorreator no qual pulmões de macacos semeados por células podem ser cultivados sob condições de estiramento mecânico e tensão fornecidas pela ventilação com pressão negativa, bem como perfusão pulsátil através da vasculatura; Essas forças são conhecidas por direcionar a diferenciação ao longo das linhagens pulmonar e endotelial, respectivamente. São fornecidos resultados representativos de descelularização e semeadura celular.

Introduction

A bioengenharia de tecidos e órgãos é uma adição atraente ao campo da medicina regenerativa. A criação de órgãos "cultivados em laboratório" adequados para transplante em pacientes para substituir a funcionalidade de órgãos doentes é altamente desejável para atender à demanda atual e futura por necessidades de transplante. Os princípios da engenharia de tecidos giram em torno da semeadura dos tipos de células desejados, ou seus progenitores, em um andaime que suporta a forma do tecido projetado, ao mesmo tempo em que fornece os fatores de crescimento apropriados e as condições de cultura necessárias para imitar os processos de desenvolvimento ou regenerativos. Embora ....

Protocol

1. Descelularização pulmonar de macaco de órgão inteiro

1. Preparação de soluções
   1. Autoclave 10-15 L de água deionizada (dH₂O) em garrafas de 1-2 L.
   2. Prepare a "solução de Tritão" (0,1% de Triton X-100 em dH₂O) misturando 1 ml de Triton X-100 em 999 ml de dH₂O, mexendo em um agitador magnético. Filtrar a solução através de um aparelho filtrante de 0,22 μm. Armazene em temperatura ambiente.
   3. Prepare a "solução SDC" (SDC 2% em dH₂O) adicionando lentamente 20 g de desoxicolato de sódio (SDC) a ~ 900 ml dH₂O enquanto agita. Uma vez dissolvido o SDC, transferir a solução....

Results

Os resultados mostrados abaixo representam experimentos separados nos quais os compartimentos das vias aéreas ou vasculares foram semeados com células-tronco mesenquimais derivadas da medula óssea do macaco rhesus ou células endoteliais microvasculares derivadas do pulmão rhesus, respectivamente, que foram isoladas e caracterizadas conforme descrito anteriormente^16-18.

Durante todo o processo de descelularização, os pulmões dos macacos exibiram um clareamento progressivo culminando .......

Discussion

Os tecidos podem ser eficientemente e efetivamente descelularizados por vários métodos que empregam agentes físicos, químicos e enzimáticos^12,20. Os desafios de produzir matrizes biológicas 3D a partir de grandes órgãos incluem a necessidade de grandes volumes de soluções de descelularização, equipamentos comerciais caros (ou seja , biorreatores) e uma quantidade estonteante de perturbações metodológicas necessárias para obter o produto final derivado de tecido. Nosso método fornece uma abordagem dire.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nitroprussiato de sódio	Sigma-Aldrich	71778-25G
Sal de heparina sódico	Fisher	BP2425
Triton X-100	Fisher	BP151-100
Desoxicolato de sódio	Fisher	BP349-100
Cloreto de sódio	Fisher	7647-14-5
DNase pancreática bovina	Sigma-Aldrich	DN25	Prepare estoque, alíquota e congele
Sulfato de magnésio	Fisher	10034-99-8
Cloreto de cálcio	Fisher	C614-500
PBS (sem Ca/Mg)	Gibco, Life Technologies	10010-031
Antibiótico-Antimicótico	Gibco Life Technologies	15240062
Cell Culture Media
Alpha MEM	Gibco Life Technologies	12561-072
Médio 199	Gibco Life Technologies	11150067
Soro Fetal Bovino Premium	Atlanta Biologicals	S11150
L-Glutamina 100x	Gibco Life Technologies	25030-081
Suplemento de Crescimento de Células Endoteliais (ECGS)	ScienCell	1052
Antibiótico-Antimicótico	Gibco Life Technologies	15240062
Válvulas de retenção de cultura de células e semeadura de células
	Cole-Parmer	EW-98553-20
Conectores Y	Cole-Parmer	ED-30614-08
Torneiras de 3 vias	Harvard Apparatus	721664
MasterFlex L/S 14 tubulação	Cole-Parmer	96420-14
MasterFlex L/S 16 tubulação	Cole-Parmer	96420-16
Bloqueio masculino Luer 1/8 in	Cole-Parmer	EW-45505-04
Fêmea Luer 1/8 in	Cole-Parmer	SI-45502-04
Macho Luer lock plug	Cole-Parmer	EW-45505-56
Portas de injeção	Medi-Dose EPS	IV2004
Tubo de látex	St. Louis Medical Suppy	HN10910
Braçadeira de mangueira	Cole-Parmer	EW-06832-02
Frasco de boca larga de 2 L	Fisher	05-719-276
Seringas de 60 ml	Fisher	NC9035364