A descelularização de órgãos inteiros produz andaimes biológicos naturais que podem ser usados para medicina regenerativa. A descrição de um modelo de regeneração pulmonar de primatas não humanos em que pulmões inteiros são descelularizados e depois semeados com células-tronco adultas e células endoteliais em um biorreator que facilita a circulação vascular e a ventilação em meio líquido é apresentada.
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Artigo de método
Descelularização e recelularização pulmonar de primatas não humanos usando um biorreator especializado de órgãos grandes
Neste artigo
Resumo
Resumo
Há um número insuficiente de pulmões disponíveis para atender às necessidades atuais e futuras de transplante de órgãos. A regeneração bioartificial de tecidos é uma alternativa atraente ao transplante clássico de órgãos. Essa tecnologia utiliza a matriz extracelular biológica natural (MEC) de um órgão como um andaime no qual células autólogas ou células-tronco / progenitoras podem ser semeadas e cultivadas de forma a facilitar a regeneração do tecido original. A ECM natural é isolada por um processo chamado descelularização. A descelularização é realizada tratando os tecidos com uma série de detergentes, sais e enzimas para obter a remoção eficaz do material celular, deixando a ECM intacta. Estudos realizados utilizando descelularização e subsequente recelularização de pulmões de roedores demonstraram sucesso marginal na geração de tecido semelhante a um pulmão capaz de troca gasosa in vivo. Embora ofereçam uma prova de conceito essencial, os modelos de roedores não são diretamente traduzíveis para uso humano. Os primatas não humanos (NHP) oferecem um modelo mais adequado para investigar o uso da produção de órgãos bioartificiais para eventual uso clínico.
Os protocolos para alcançar a descelularização completa dos pulmões adquiridos do macaco rhesus NHP são apresentados. Os pulmões acelulares resultantes podem ser semeados com uma variedade de células, incluindo células-tronco mesenquimais e células endoteliais. O manuscrito também descreve o desenvolvimento de um sistema de biorreator no qual pulmões de macacos semeados por células podem ser cultivados sob condições de estiramento mecânico e tensão fornecidas pela ventilação com pressão negativa, bem como perfusão pulsátil através da vasculatura; Essas forças são conhecidas por direcionar a diferenciação ao longo das linhagens pulmonar e endotelial, respectivamente. São fornecidos resultados representativos de descelularização e semeadura celular.
Introdução
A bioengenharia de tecidos e órgãos é uma adição atraente ao campo da medicina regenerativa. A criação de órgãos "cultivados em laboratório" adequados para transplante em pacientes para substituir a funcionalidade de órgãos doentes é altamente desejável para atender à demanda atual e futura por necessidades de transplante. Os princípios da engenharia de tecidos giram em torno da semeadura dos tipos de células desejados, ou seus progenitores, em um andaime que suporta a forma do tecido projetado, ao mesmo tempo em que fornece os fatores de crescimento apropriados e as condições de cultura necessárias para imitar os processos de desenvolvimento ou regenerativos. Embora ....
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Protocolo
1. Descelularização pulmonar de macaco de órgão inteiro
- Preparação de soluções
- Autoclave 10-15 L de água deionizada (dH2O) em garrafas de 1-2 L.
- Prepare a "solução de Tritão" (0,1% de Triton X-100 em dH2O) misturando 1 ml de Triton X-100 em 999 ml de dH2O, mexendo em um agitador magnético. Filtrar a solução através de um aparelho filtrante de 0,22 μm. Armazene em temperatura ambiente.
- Prepare a "solução SDC" (SDC 2% em dH2O) adicionando lentamente 20 g de desoxicolato de sódio (SDC) a ~ 900 ml dH2O enquanto agita. Uma vez dissolvido o SDC, transferir a solução....
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Resultados
Os resultados apresentados abaixo representam experimentos separados nos quais os compartimentos das vias aéreas ou vasculares foram semeados com células-tronco mesenquimais derivadas da medula óssea de macaco-rufo ou com células endoteliais microvasculares derivadas do pulmão de macaco-rufo, respectivamente, que foram isoladas e caracterizadas conforme descrito anteriormente16-18.
Durante todo o processo de descelularização, os pulmões de macaco exibiram um embranquecimento progres.......
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Discussão
Os tecidos podem ser eficientemente e efetivamente descelularizados por vários métodos que empregam agentes físicos, químicos e enzimáticos12,20. Os desafios de produzir matrizes biológicas 3D a partir de grandes órgãos incluem a necessidade de grandes volumes de soluções de descelularização, equipamentos comerciais caros (ou seja , biorreatores) e uma quantidade estonteante de perturbações metodológicas necessárias para obter o produto final derivado de tecido. Nosso método fornece uma abordagem dire.......
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Divulgações
Não temos nada a divulgar.
Agradecimentos
Os autores agradecem aos editores da Tissue Engineering por permitirem que imagens de uma publicação anterior fossem utilizadas neste relatório.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Nitroprussiato de sódio | Sigma-Aldrich | 71778-25G | |
| Sal de heparina sódico | Fisher | BP2425 | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-100 | |
| Desoxicolato de sódio | Fisher | BP349-100 | |
| Cloreto de sódio | Fisher | 7647-14-5 | |
| DNase pancreática bovina | Sigma-Aldrich | DN25 | Prepare estoque, alíquota e congele |
| Sulfato de magnésio | Fisher | 10034-99-8 | |
| Cloreto de cálcio | Fisher | C614-500 | |
| PBS (sem Ca/Mg) | Gibco, Life Technologies | 10010-031 | |
| Antibiótico-Antimicótico | Gibco Life Technologies | 15240062 | |
| Cell Culture Media | |||
| Alpha MEM | Gibco Life Technologies | 12561-072 | |
| Médio 199 | Gibco Life Technologies | 11150067 | |
| Soro Fetal Bovino Premium | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| L-Glutamina 100x | Gibco Life Technologies | 25030-081 | |
| Suplemento de Crescimento de Células Endoteliais (ECGS) | ScienCell | 1052 | |
| Antibiótico-Antimicótico | Gibco Life Technologies | 15240062 | |
| Válvulas de retenção de cultura de células e semeadura de células | |||
| Cole-Parmer | EW-98553-20 | ||
| Conectores Y | Cole-Parmer | ED-30614-08 | |
| Torneiras de 3 vias | Harvard Apparatus | 721664 | |
| MasterFlex L/S 14 tubulação | Cole-Parmer | 96420-14 | |
| MasterFlex L/S 16 tubulação | Cole-Parmer | 96420-16 | |
| Bloqueio masculino Luer 1/8 in | Cole-Parmer | EW-45505-04 | |
| Fêmea Luer 1/8 in | Cole-Parmer | SI-45502-04 | |
| Macho Luer lock plug | Cole-Parmer | EW-45505-56 | |
| Portas de injeção | Medi-Dose EPS | IV2004 | |
| Tubo de látex | St. Louis Medical Suppy | HN10910 | |
| Braçadeira de mangueira | Cole-Parmer | EW-06832-02 | |
| Frasco de boca larga de 2 L | Fisher | 05-719-276 | |
| Seringas de 60 ml | Fisher | NC9035364 |
Referências
- Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nat. Med. 14, 213-221 (2008).
- Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-organ tissue....
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Reimpressões e permissões
