Resgate de Vírus da Doença de Newcastle recombinante de cDNA

Resumo

O vírus da doença de Newcastle (NDV) tem sido extensivamente estudada nos últimos anos de forma a desenvolver novos vectores para a vacinação e a terapia, entre outros. Estes estudos têm sido possível devido às técnicas para resgatar vírus recombinante a partir do cDNA, tais como aqueles aqui descrita.

Resumo

O vírus da doença de Newcastle (VDN), o membro protótipo do gênero Avulavirus da família Paramyxoviridae ^1, é um não-segmentado, negativo-sentido, de fita simples, envolto vírus RNA (Figura 1) com potenciais aplicações como um vetor para a vacinação e tratamento de doenças humanas. Exploração em profundidade dessas aplicações só se tornou possível após o estabelecimento de técnicas de genética reversa para resgatar vírus recombinantes de plasmídeos que codificam seus genomas completos como cDNA ^2-5. ADNc viral pode ser convenientemente modificado, in vitro, utilizando procedimentos de clonagem padrão para alterar o genótipo do vírus e / ou para incluir novas unidades de transcrição. Resgate de tais vírus geneticamente modificados fornece uma ferramenta valiosa para entender os fatores que afetam vários estágios da infecção, bem como permite o desenvolvimento e aperfeiçoamento de vetores para a expressão e entrega de antígenospara a vacinação e terapia. Aqui nós descrevemos um protocolo para o resgate de NDVs recombinantes.

Introdução

O vírus da doença de Newcastle (VDN), um paramyxovirus aviária pertencente ao gênero Avulavirus ^1, é um agente zoonótico economicamente relevante e, portanto, amplamente pesquisados ​​e vigiado, o que pode afetar gravemente a avicultura em todo o mundo. Embora não seja um patógeno humano, NDV também tem sido minuciosamente estudados para além do campo veterinário tanto como um modelo paramyxovirus e, devido às suas propriedades muito interessantes, oncolíticos naturais ^6. Pesquisa sobre NDV beneficiaram com o desenvolvimento de técnicas de genética reversa para, não-segmentadas vírus de RNA de sentido negativo de fita simples, primeiro ....

Protocolo

1. Preparação de células de mamíferos (Figura 4A, Dia 1)

Dividir HEp-2 ou células A549 no dia anterior transfeco em placas de 6 poços. Densidade das células deve atingir 80-90% de confluência no dia seguinte. Normalmente, um prato de 100 mm confluentes podem ser divididos em 8 poços (cerca de 1 x 10 ⁶ culas por po). Para cada vírus para ser resgatado, 2-4 poços diferentes devem ser incluídos, bem como dois poços adicionais para os controles pCAGGS-GFP e pCite ^GFP-18, com o objetivo de monitorar a transfecção e MVA-T7 eficiência de infecção, respectivamente.

2....

Resultados

Resgate de NDV é um procedimento bem estabelecido, realizada rotineiramente nos laboratórios que têm acesso ao cDNA completo do vírus. No entanto, a natureza estocástica intrínseca do método faz com que seja difícil de alcançar 100% de eficácia de recuperação. Monitorando as primeiras etapas do processo, em especial a eficácia de transfecção e a infecção com o MVA-T7, ajuda a identificar possíveis problemas. Figura 5A mostra transfecção padrão e a eficiência de transfecção / infecção que são suficientes.......

Discussão

Vários fatores devem ser considerados para alcançar bons resultados ao resgatar NDV. Em primeiro lugar, a construção de cDNA completo para ser usado precisa ser projetado para permitir a incorporação funcional dos novos transgenes / modificações no genoma NDV. Isso significa que, como dito acima, que as seqüências (i) end apropriado gene (GE), intergênica (IG) e de início gene (GS) estão a ser adicionado, se necessário, (ii) não existem sequências GE ou GS putativos para o estrangeiro gene, e (iii) o genoma recombinante.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
DMEM	CORNING Cellgro	10-013-CV	Qualquer fornecedor
OptiMEM	GIBCO	31985-070
Lipofectamine 2000 (LPF2000)	Invitrogen	11668-019
35% Albumina bovina (BA)	Sigma	232-936-2	Qualquer fornecedor
Tripsina-EDTA	CORNING Cellgro	25-052-CI	Qualquer fornecedor
Penicilina/Estreptomicina (PS) 100x	CORNING Cellgro	30-002-CI	Qualquer fornecedor
Soro Fetal Bovino (FBS)	Hyclone	SH30070.03	Qualquer fornecedor
Linhas celulares Células A549 (número de catálogo CRL-185), células HEp-2 (número de catálogo CRL-185), fibroblastos de embriões de galinha (número de catálogo CRL-12203) e fibroblastos de embriões de pato (número de catálogo CCL-141) são disponível na American Type Culture Collection (ATCC, 10801 University Boulevard, Manassas, VA. 20110-2209 EUA). Todas as linhagens celulares são mantidas em um 37 &graus; C incubadora com 5% de CO2 em DMEM 10% FBS, 1% PS. Ovos de galinha embrionados Ovos de galinha embrionados podem ser obtidos nos Laboratórios Charles River, Specific Pathogen Fee Avian Supply (SPAFAS) Produtos e Serviços Aviários (Franklin Commons, 106 Route 32, North Franklin, CT 06254, EUA) e são mantidos a 37 °C. A viabilidade dos embriões é avaliada com um candler de ovo. Os ovos são infectados quando atingem 8 a 10 dias de idade. Tanto a infecção quanto a colheita do fluido alantóide ocorrem em condições estéreis. Todos os ovos são autoclavados e descartados seguindo os protocolos padrão de biossegurança laboratorial. Turkey red blood glóbulos (RBC) Turkey RBC pode ser comprado na Truslow Farms (201 Valley Road, Chestertown, Md 21620, EUA) e armazenado a 4 °C. Para preparar as hemácias para o ensaio de AH, lave 5 ml do estoque comercial com 45 ml de PBS 1x em um tubo cônico de 50 ml. Centrifugue por 5 min a 1.000 rpm e descarte cuidadosamente o sobrenadante. Dilua as hemácias peletizadas 1:1.000 em PBS 1x para uma concentração final de 0,5-1,0%. As hemácias lavadas podem ser armazenadas a 4 &graus; C por vários dias. Plasmídeos As preparações de plasmídeos são obtidas com qualquer kit maxiprep disponível comercialmente seguindo o fabricante' s instruções, diluídas em ddH20 até uma concentração final de 1 μ g/μ l e armazenado a -20 ° C. A concentração e a pureza do DNA são avaliadas por espectrofotometria a 260 e 280 nm. Preparações com uma proporção 260/280 superior a 1,8 são consideradas de qualidade aceitável para o resgate. A qualidade do DNA do plasmídeo também é rotineiramente verificada por cromatografia em gel de agarose. Viruses O protocolo descrito para resgate da cepa lentogênica NDV Hitchner B1 pode ser realizado em condições de nível de biossegurança (BSL) 2. A Vaccinia Ankara modificada expressando a RNA polimerase T7 (MVA-T7) foi descrita34 e obtida do Dr. Bernard Moss. Este vírus é o crescimento em monocamadas confluentes de fibroblastos de embriões de galinha e titulado em células de mamíferos (A549 ou HEp-2). Os estoques de NDV são cultivados em ovos de galinha embrionados e titulados por IFA usando soro policlonal criado contra vírions purificados. Todo o material contaminado deve ser esterilizado com segurança e descartado de acordo com os procedimentos padrão de biossegurança. Meios e soluções de cultura de tecidos: DMEM 10% FBS 1% PS: Dulbecco' s modified Eagle' s Meio (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e Penicilina/Estreptomicina (P/S): 445 ml de DMEM, 50 ml de FBS inativado pelo calor, 5 ml de solução comercial 100x P/S. Armazenar a 4 °C. 10x Solução salina tamponada com fosfato (PBS): 80 g de NaCl, 2 g de KCl, 11,5 g de Na2HPO4,7H2O, 2 g de KH2PO4. Adicione ddH2O até 1 L. Ajuste o pH para 7,3. Esterilizar em autoclave. Armazenar em temperatura ambiente. 1x PBS: Diluir 10x PBS 1:10 com ddH2O. Esterilizar em autoclave e armazenar em temperatura ambiente. 100x Ca/Mg : 1,327 g CaCl2.2H2O, 2,133 g de MgCl2,6H2O e adicionar ddH2O até 100 ml. Autoclave e armazene em temperatura ambiente. 1x PBS/BA/PS: 50 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS) 10x em 437 ml ddH2O. Autoclave e quando resfriado à temperatura ambiente, adicione 5 ml 100x Penicilina/Estreptomicina, 3 ml 35% Bovino e 5 ml de 100x Ca/Mg. Armazene a 4 >C.