Visualizando o fluxo citoplasmático durante a cicatrização de feridas unicelulares em Stentor coeruleus

Resumo

O ciliado gigante Stentor coeruleus é um sistema clássico para estudar a regeneração e a cicatrização de feridas em células únicas. Ao obter imagens das células do Stentor simultaneamente em baixa e alta ampliação, é possível medir os fluxos citoplasmáticos antes, durante e após a ferida.

Resumo

Embora a cicatrização de feridas seja frequentemente abordada no nível de tecidos inteiros, em muitos casos as células individuais são capazes de curar feridas dentro de si mesmas, reparando a membrana celular quebrada antes que o conteúdo celular vaze. O organismo unicelular gigante Stentor coeruleus, no qual as células podem ter mais de um milímetro de tamanho, tem sido um organismo modelo clássico para estudar a cicatrização de feridas em células individuais. As células do stentor podem ser cortadas ao meio sem perda de viabilidade e podem até ser cortadas e enxertadas juntas. Mas essa alta tolerância ao corte levanta a questão de por que o citoplasma não flui simplesmente do tamanho do corte. Aqui apresentamos um método para cortar células de Stentor e, ao mesmo tempo, obter imagens do movimento do citoplasma nas proximidades do corte em alta resolução espacial e temporal. A chave para o nosso método é usar uma configuração de microscópio de "dois andares" na qual a cirurgia é realizada sob um microscópio de dissecação focado em uma câmara que é vista simultaneamente de baixo em alta resolução usando um microscópio invertido com uma lente de alta NA. Essa configuração permite um alto nível de controle sobre o procedimento cirúrgico, ao mesmo tempo em que permite o rastreamento de alta resolução do citoplasma.

Introdução

A regeneração e a cicatrização de feridas são processos biológicos importantes cujos mecanismos permanecem áreas de investigação ativa. De fato, a capacidade de curar feridas e regenerar partes danificadas é uma das características que diferencia os seres vivos dos objetos inanimados. Normalmente, acredita-se que a regeneração seja mediada pela diferenciação de células-tronco em vários tipos de células necessárias para reconstruir uma parte animal danificada ou decepada, enquanto a cicatrização de feridas é vista em termos de novas células invadindo uma ferida para reconstruir um epitélio intacto. Assim, ambos os processos parecem ser mediados por coletivos de células individuais e, portanto, parecem ser processos essencialmente multicelulares. Portanto, é potencialmente surpreendente que as células individuais sejam, em alguns casos, capazes de reparar feridas e regenerar componentes perdidos¹. A cicatrização de feridas dentro de células únicas pode envolver várias vias, incluindo actina-miosina, contração em bolsa ao redor da ferida e remendo de membrana por fusão rápida de vesículas exocitóticas^1-3. Embora muitos tipos de células sejam capazes de algum grau de cicatrização de feridas^4-6, talvez o exemplo mais dramático seja o ciliado gigante Stentor coeruelus⁷, mostrado na Figura 1. As células individuais do Stentor têm 1 mm de comprimento e são cobertas por fileiras de cílios. As células do stentor são em forma de cone com um aparelho oral, consistindo de milhares de cílios, em uma extremidade, e uma estrutura estreita de retenção na outra extremidade. O Stentor era um organismo modelo clássico para estudar a regeneração porque, se qualquer parte da célula fosse cortada, ela poderia se regenerar⁷. Por exemplo, em uma série clássica de experimentos, Thomas Hunt Morgan⁸ mostrou que uma célula Stentor poderia ser cortada ao meio e cada metade regeneraria uma célula de proporções normais em questão de horas⁸. As vias moleculares responsáveis pela regeneração em Stentor permanecem completamente desconhecidas.

A capacidade das células Stentor de servir como um sistema modelo de regeneração depende da incrível capacidade dessas células de se curarem após serem cortadas. Por que o citoplasma de uma célula Stentor não vaza quando a célula é cortada? A cicatrização de feridas não se deve à contração imediata do córtex celular, pois é possível pegar duas células de Stendotor, cortá-las e depois unir as duas células cortadas em várias configurações⁷. Durante esses experimentos de enxerto, o citoplasma das duas células deve permanecer exposto, pois se funde quando as células são unidas. De alguma forma, o citoplasma é exposto o suficiente ao meio circundante para permitir o enxerto, mas ainda assim não flui para fora da célula. O citoplasma do Stentor é suficientemente elástico para simplesmente não fluir mesmo quando um grande orifício é feito na membrana plasmática? As células aumentam a viscosidade do citoplasma localmente ao redor de uma ferida para evitar que o citoplasma flua para fora? O citoplasma é um material ativo altamente complexo^9-11, e a resposta de cicatrização de feridas com Stentor representa uma oportunidade única para estudar os fluxos citoplasmáticos e a mecânica durante a cicatrização de feridas unicelulares. No entanto, o uso de métodos cirúrgicos para induzir ferimentos em Stentor representa um desafio técnico. Para cortar uma célula de 1 mm de comprimento usando agulhas de vidro, o paradigma cirúrgico convencional, é necessário operar em baixa ampliação com longa distância de trabalho. Sob essas condições de imagem, não é possível rastrear o fluxo de citoplasma, e tudo o que se pode determinar é se o citoplasma permanece dentro da célula ou não. A verdadeira pergunta que gostaríamos de fazer é como o movimento e a viscosidade do citoplasma podem mudar durante o corte e a cicatrização. Isso requer imagens de alta resolução. Aqui apresentamos uma adaptação do protocolo de Tartar para cortar o Stentor⁷ que permite que o corte seja feito sob óptica de menor ampliação para ver toda a célula enquanto observa simultaneamente o fluxo citoplasmático em alta resolução, permitindo que este sistema seja usado como uma plataforma para explorar os mecanismos de cicatrização de feridas unicelulares.

Protocolo

1. Cultura e Coleta de Células

1. Obter células de Stentor coeruleus em lagoas naturais, conforme descrito no Tartar⁷, ou de um fornecedor comercial (ver Reagentes).
2. Manter as culturas crescendo no escuro a 20 ºC em meio Stentor Modificado (MSM), que é adaptado de receitas descritas por Tartar⁷ e De Terra¹² contendo 0,75 mM Na₂CO₃, 0,15 mM KHCO₃, 0,15 mM NaNO₃, 0,15 mM KH₂PO₄, 0,15 mM MgSO₄, 0,5 mM CaCl₂, e NaCl 1,47 mM.
3. Complemente o meio MSM com uma fonte de carbono, adicionando presas vivas ao meio. Cultive culturas de meio Chlamydomonas reinhardtii TAP usando métodos de cultura padrão¹³. Antes da alimentação, lave as células de Chlamydomonas em MSM. Alimente 300 ml de culturas de Stentor ~ 3 x 10⁷ células de Chlamydomonas 2-3x por semana.
4. Colete células de Stentor para cirurgia usando uma pipeta. O stentor tende a ancorar no fundo e nas laterais da placa de cultura e, portanto, para coletar células, agite a cultura borbulhando ar através de uma ponta de pipeta até que as células comecem a se desprender e nadar livremente.
5. Capture células natatórias usando uma pipeta equipada com uma ponta de diâmetro largo para evitar o cisalhamento das células.
6. Lave as células coletadas em MSM fresco.

2. Preparação de Ferramentas para Microcirurgia

1. Segure duas hastes de agitação de vidro sobre um bico de Bunsen ou outra chama até que as pontas comecem a derreter.
2. Toque as extremidades das duas hastes juntas para que o vidro fundido se funda.
3. Depois de criar uma pequena gota de vidro derretido entre as duas hastes, remova-as do fogo, deixe esfriar por 1-2 segundos e, em seguida, separe-as para fazer uma quebra limpa. Idealmente, o vidro se soltará em fios finos e quebrará suavemente à medida que o vidro esfria, resultando em uma agulha de aproximadamente 1-2 cm de comprimento com ponta fina na extremidade (Figura 2).
4. Se a agulha resultante estiver abaixo do ideal, as pontas podem ser quebradas em resíduos de vidro e as hastes podem ser reutilizadas.

3. Células de montagem para microcirurgia e observação (cirurgia normal)

1. Prepare uma câmara quadrada com paredes de vaselina usando um carimbo de borracha quadrado revestido com vaselina e pressionado sobre uma lamínula de vidro.
2. Adicione MSM contendo 2% de metilcelulose ao quadrado de vaselina.
3. Coloque a lamínula em um adaptador de plástico, o que permite que a lamínula seja colocada em um microscópio com um suporte de lâmina padrão (Figura 3).
4. Adicione células lavadas da etapa 1.6 ao MSM mais metilcelulose para impedir a motilidade das células do Stentor para que permaneçam no lugar durante a cirurgia.
5. Organize as células na metilcelulose de modo que fiquem uniformemente espaçadas e sejam empurradas para perto o suficiente da superfície da lamínula para estarem em foco durante a imagem.

4. Imagem de alta resolução da cicatrização de feridas em stentor vivo

Para obter imagens simultâneas de uma célula Stentor em alta resolução enquanto a corta cirurgicamente sob baixa ampliação, construa um microscópio de "dois andares" com um escopo de dissecação conectado à cabeça da ocular do osciloscópio invertido para que ele seja focado na parte superior da lâmina enquanto o osciloscópio invertido é focado por baixo da lâmina.

1. Coloque um slide no osciloscópio invertido (use um Zeiss Axiovert 200M ou um Olympus IX80).
2. Remova o corpo do microscópio de dissecação de seu suporte e determine a posição aproximada acima da ocular do microscópio invertida para colocar o escopo de dissecação para permitir que a lâmina seja visualizada em baixa ampliação.
3. Modifique uma caixa de papelão para ter a mesma espessura que o espaçamento desejado entre a cabeça da ocular do osciloscópio invertido e o escopo de dissecação e, em seguida, prenda no osciloscópio invertido usando fita de laboratório que pode ser facilmente removida quando o experimento for concluído. Ajuste a espessura da caixa de acordo com a configuração exata da cabeça da ocular do microscópio invertido e no tamanho do microscópio de dissecação para que a amostra fique no campo de visão sem a necessidade de mover o escopo de dissecação depois de conectado.
4. Segurando o escopo de dissecação contra a caixa, mova-o até que o slide esteja em foco e, em seguida, prenda na caixa novamente usando fita adesiva. A configuração final é mostrada na Figura 4.
5. Células de imagem através de escopo invertido usando óptica DIC e uma lente objetiva de ar 20X. Use um condensador DIC de longa distância de trabalho para fornecer espaço suficiente para realizar a microcirurgia de cima.
6. Adquira imagens a uma taxa de quadros de 2 imagens/s usando uma câmera CCD de 512 x 512
.
7. Comece a aquisição antes de começar a cortar as células para capturar o padrão de fluxo citoplasmático inicial e observe todos os estágios do processo de ferimento e cicatrização de feridas.
8. Encerre a aquisição quando a célula retomar a aparência normal e/ou a motilidade ativa, a fim de visualizar e medir os movimentos citoplasmáticos ao longo do processo de regeneração.

5. Analisando o fluxo citoplasmático durante a cicatrização de feridas

Meça o fluxo citoplasmático usando velocimetria de imagem de partículas (PIV). Esta técnica é rotineira no estudo da dinâmica dos fluidos e pode gerar campos de fluxo na ausência de partículas rastreáveis individualmente no fluido. O PIV tem sido usado para medir os fluxos de citoplasma com base na imagem de vesículas subcelulares e outras características visíveis no citoplasma por microscopia de luz transmitida¹⁴.

1. Baixe o PIVLab, um pacote MATLAB para PIV, do site http://pivlab.blogspot.com/.
2. Carregue a pilha de imagens tiff para cada sequência de vídeo no programa PIV dentro do MATLAB.
3. Gere manualmente uma máscara para cada pilha de imagens para mascarar regiões dos dados brutos fora do corpo do Stentor.
4. Defina o PIVLab para usar a configuração de transformação rápida de Fourier e um tamanho de compartimento de 64 x 64 pixels, que agrupará os pixels em cada quadro em pixels quadrados maiores.
5. Execute o PIVLab para calcular correlações cruzadas entre os pixels em cada quadro com pixels próximos no próximo quadro para produzir um vetor de fluxo dependente do tempo centralizado em cada pixel compartimentado, que tem a mesma resolução de tempo que nossos dados brutos.
6. Calcule as médias de tempo da saída do campo vetorial resultante para gerar linhas de fluxo para comparação entre os dados obtidos com o Stentor antes do corte e durante a cicatrização de feridas e calcule histogramas de velocidades de fluxo (para estudar a força do fluxo) e mudança de velocidade em um determinado pixel ao longo do tempo (para estudar flutuações de fluxo).
7. Para sequências de imagens com Stentor clivado ao meio e citoplasma visivelmente vazando para o tampão circundante, calcule o fluxo total de citoplasma de volta ao corpo celular propriamente dito, multiplicando a velocidade média do fluxo pela área da seção transversal da base da bolha extracelular do citoplasma.

Resultados

Usando os protocolos descritos acima, verificou-se que o citoplasma do Stentor é notavelmente dinâmico, tanto antes quanto depois do corte. O vídeo 1 mostra o extenso fluxo de citoplasma presente em células não cortadas. Apesar de nossa expectativa original de que a capacidade de Stentor de sobreviver ao corte envolveria um enrijecimento ou gelificação do citoplasma, de fato, quando as células do Stentor são cortadas com violência suficiente para retirar o citoplasma da célula, o citoplasma permanece altamente dinâmico e consegue fluir de volta para a célula de uma forma altamente direcionada (Vídeo 2).

Além de demonstrar um grau de movimento citoplasmático anteriormente insuspeito durante a cicatrização de feridas, a alta resolução da imagem no ensaio pode ser usada para quantificar as taxas de fluxo usando velocimetria de imagem de partículas. A capacidade de fazer tais medições permitirá que o efeito dos inibidores químicos seja rigorosamente testado.

Figura 1. Morfologia de uma célula viva de Stentor. Imagem de campo escuro de uma célula viva de Stentor que foi alimentada com Chlamydomonas conforme descrito no Procedimento 1.3, visível como material verde dentro de vacúolos alimentares. O aparelho oral através do qual a célula se alimenta é visível como uma borda de cílios na parte superior da imagem. Clique aqui para ver a imagem ampliada.

Figura 2. Preparação de agulha de vidro para cirurgia. (A) A agulha é retirada da extremidade de uma haste de vidro sólido. (B) Vista de alta ampliação da ponta da agulha indicando o comprimento e a nitidez necessários para a cirurgia. Clique aqui para ver a imagem ampliada.

Figura 3. Porta-lamínulas personalizado para microcirurgia. Para permitir o acesso aberto para cirurgia, permitindo condições ideais de imagem, as células são montadas em uma lamínula em vez de uma lâmina grossa. Para permitir que a lamínula caiba na platina do microscópio, um suporte de plástico pode ser fabricado usando uma impressora 3D. O suporte tem as mesmas dimensões de uma lâmina de microscópio padrão, enquanto a depressão no meio corresponde às dimensões da lamínula. Um orifício em um canto permite que a lamínula seja retirada do suporte. Clique aqui para ver a imagem ampliada.

Figura 4. Configuração de microscópio de dois andares. Uma cabeça de microscópio de dissecação é montada na parte superior da cabeça da ocular de um microscópio invertido. A fita de laboratório permite que o aparelho seja rapidamente montado e desmontado quando o experimento for concluído. Clique aqui para ver a imagem ampliada.

Vídeo 1. Exemplo de fluxo citoplasmático observado em célula Stentor viva. Imagem de célula com objetiva de 10X com óptica de campo escuro a uma taxa de 2 quadros / seg.

Vídeo 2. Eumaging de uma célula Stentor como ela é cortada e interrompida com uma agulha de vidro. Após o corte, uma quantidade substancial de citoplasma foi retirada do corpo celular principal, mas flui rapidamente de volta para a célula.

Discussão

A aplicação mais importante deste método será usá-lo para determinar as vias moleculares que regulam o fluxo citoplasmático durante a cicatrização de feridas em Stentor. Uma ampla gama de inibidores químicos está disponível que têm como alvo proteínas motoras, bem como componentes do citoesqueleto. Inibidores da sinalização de cálcio também seriam prováveis candidatos. Também seria interessante remover ou reduzir os grânulos de pigmento (extrussomos) contendo o pigmento azul Stentorin, cuja liberação da célula é desencadeada sob estresse, e perguntar como a liberação exocitótica de Stentorin pode afetar o fluxo do citoplasma próximo. O pigmento pode ser esgotado usando um simples tratamento de branqueamento¹⁵ que pode ser feito imediatamente antes do corte. Não parece haver uma maneira simples de realizar o ensaio de cicatrização de feridas de forma paralela, uma vez que as células precisam ser cortadas e fotografadas uma de cada vez. Assim, usando um único microscópio, seria possível operar e medir células a uma taxa de aproximadamente 1 por 0,5 hora, de modo que durante um único dia de trabalho deveria ser possível obter pontos de dados suficientes para um único composto para determinar se ele tem um efeito estatisticamente significativo no processo. Embora o método não seja, em nenhum sentido, de alto rendimento, será absolutamente viável rastrear um conjunto selecionado de compostos candidatos específicos para algumas vias-alvo cuidadosamente escolhidas.

Uma grande limitação da abordagem atual é o método relativamente rudimentar para montar o microscópio de dois andares. Supondo que o microscópio invertido usado para imagens seja um instrumento de uso geral que outros trabalhadores precisam usar para outros fins, uma consideração importante é a facilidade com que o aparelho pode ser desmontado e remontado. Embora o método atual usando fita de laboratório seja realmente rápido e facilmente desmontável, ele requer um alinhamento cuidadoso do usuário durante a montagem a cada vez. Uma modificação importante seria, portanto, construir um suporte removível personalizado com ranhuras para a cabeça da ocular do osciloscópio invertido e o corpo do osciloscópio de dissecação. Isso deve ser fácil de fabricar usando a moderna tecnologia de impressora 3D.

Uma segunda limitação da abordagem é a dependência da imagem DIC de organelas intracelulares como marcadores de fluxo. Como a identidade dessas organelas observadas no microscópio não é conhecida atualmente, não é possível saber seu tamanho ou possíveis interações com outros componentes celulares. Portanto, pode ser vantajoso injetar traçadores extrínsecos, como esferas fluorescentes, e usá-los para rastrear o fluxo. No entanto, isso exigiria uma etapa extra - microinjeção - antes que o experimento pudesse ser feito, retardando ainda mais o ensaio.

A limitação chave final é a dependência de um único plano de imagem para aquisição de dados. A principal importância deste ensaio é que ele vai além de simplesmente perguntar se uma ferida cicatriza ou não, e permite obter uma análise detalhada do padrão de fluxo. Nesse sentido, será extremamente importante estender a imagem para imagens tridimensionais. O método atual cria imagens de um único plano focal e, portanto, quando a análise PIV é realizada, o resultado é uma fatia através do campo de fluxo tridimensional completo. Isso é informativo, mas incompleto. Ao adquirir imagens 3D em cada etapa de tempo, deve ser possível obter um campo de fluxo totalmente tridimensional. Isso será particularmente crítico para observar exatamente como o citoplasma se move nas imediações do local da ferida.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Stentor coeruleus cultura viva	Carolina Biological	131598
Methyl Cellulose, 1,500 cP	Sigma	M0387
EQUIPAMENTO:
Nome do Material	Número		da Empresa
Haste de agitação de vidro macio 5 in long	Fisher Scientific	11-380A
Prato de Cultura 4.5 em 250 ml  microscópio	Carolina Biological	741004
IX81	de vidro Olympus
Axiovert 200M microscópio invertido	Zeiss
Stemi 2000 Microscópio estereoscópico	Zeiss
Evolve 512 x 512 EMCCD Câmera	fotométrica
Plan Apo 20X objetiva	Olympus	UPLSAPO