Atuação Remoto magnética de micrométricas para Sondas In situ Mapping 3D de bactérias biofilme Propriedades Físicas

Summary

Este documento mostra uma metodologia original baseado na actuação remota de partículas magnéticas semeadas num biofilme bacteriano e o desenvolvimento de uma pinça magnéticos dedicados para medir in situ as propriedades mecânicas locais da matéria viva complexo construído por micro-organismos nas interfaces.

Abstract

Aderência bacteriana e crescimento em interfaces levar à formação de estruturas tridimensionais heterogéneos chamados biofilmes. As células que habitam estas estruturas são mantidas juntas por interacções físicas mediadas por uma rede de substâncias poliméricas extracelulares. Biofilme bacteriano impactar muitas atividades humanas ea compreensão de suas propriedades é fundamental para um melhor controle do seu desenvolvimento - manutenção ou erradicação - dependendo de seu resultado adverso ou benéfico. Este artigo descreve uma nova metodologia com o objetivo de medir in situ as propriedades físicas locais do biofilme que tinha sido, até agora, examinada apenas a partir de uma perspectiva macroscópica de material e homogênea. A experiência aqui descrita envolve a introdução de partículas magnéticas num biofilme em crescimento sobre as sementes de sondas locais que podem ser comandadas à distância, sem perturbar as propriedades estruturais do biofilme. Pinças magnéticas Dedicados foram desenvolvido para exercer uma força definida em cada partícula incorporada no biofilme. A instalação é montada sobre a plataforma de um microscópio, para permitir a gravação de imagens de lapso de tempo do período de puxar partícula. As trajectórias das partículas são, em seguida, extraiu-se a partir da sequência de puxar e os parâmetros locais viscoelásticas são derivados a partir de cada curva de deslocamento das partículas, proporcionando assim a distribuição 3D-espacial dos parâmetros. Ganhar insights sobre o perfil mecânico do biofilme é essencial do ponto de vista de um engenheiro de vista para fins de controle do biofilme, mas também a partir de uma perspectiva fundamental para esclarecer a relação entre as propriedades arquitetônicas e biologia específico dessas estruturas.

Introduction

Biofilme bacteriano são comunidades de bactérias associadas com superfícies biológicas ou artificiais ^1-3. Eles formam por um mecanismo de adesão-crescimento juntamente com a produção de matriz extracelular rica em polissacárido que protege e estabiliza o edifício ^4,5. Estes biofilmes não são assemblages simplesmente passivos de células aderidas a superfícies, mas organizado e sistemas biológicos complexos dinâmicos. Quando bactérias mudar de planctônicas de biofilme estilo de vida, as alterações na expressão de genes e fisiologia celular estão observada, bem como um aumento da resistência aos antibióticos e as defesas do hospedeiro imunes estan....

Protocol

1. Cultura das bactérias e preparação de suspensão

1. Escolha de uma colónia recentemente crescido a partir de uma placa de ágar Lisogenia Broth (LB), inocula-o em 5 mL de meio líquido LB contendo 100 μ g / ml de ampicilina e 7,5 μ g / ml de tetraciclina e incube-para de 5 a 6 horas a 37 ° C em uma plataforma de agitação.
2. Em seguida, adiciona-se 100 μ l de cultura bacteriana, em 5 ml de meio mínimo (M63B1) suplementado com 0,4% de glucose e as mesmas concentrações de antibiótico. Incubar durante a noite desta cultura recém diluído a 37 ° C em uma plataforma de agitação.
3. Após 16 horas de incubação, adiciona-se 100....

Results

Uma análise típica irá proporcionar a distribuição espacial dos parâmetros viscoelásticos na escala mícron sobre um biofilme viver sem perturbar o seu arranjo original. Os resultados típicos são mostrados na Figura 7, em que os valores de J ₀ - o cumprimento elástico - são dadas como uma função do eixo-z ao longo da profundidade e do eixo-y ao longo de uma dimensão lateral do biofilme. Cada ponto corresponde a um cordão que a análise da curva de fluência tem proporcionado um valor J _0.

Discussion

Esta partícula magnética semeadura e puxando experimento permitiu in situ mapeamento 3D dos parâmetros viscoelásticos de um biofilme crescendo em seu estado original. Esta abordagem revelou heterogeneidade mecânica da E. coli biofilme cultivadas aqui e deu pistas para apontar os componentes do biofilme que suportam as propriedades físicas de biofilme, o que sugere fortemente uma implicação fundamental da matriz extracelular e mais precisamente o seu grau de cross-linking.

O.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tabela 1: Reagentes e células
Partículas magnéticas	Life technologies	14307D	Partícula magnética micrométrica, 2.8 µ m de diâmetro
Ampicilina (Antibiótico)	Sigma-Aldrich	A9518
Tetraciclina (Antibiótico)	Sigma-Aldrich	87128
Cepa bacteriana MG1655gfpF	UGB, Institut Pasteur, França		Produz F pili em sua superfície, resistente à Ampicilina e tetraciclina.
Tabela 2: Capilares e tubos
Filtros para perfusão pediátrica	Prodimed-Plastimed	6932002
Capilares Quadrados Ocos	Metal Compósito	Científico 8280-100	Fabricado em vidro borossilicato. Quadrado 0,8 mm x 0,8 mm
Tubo de peróxido de silicone	VWR international	228-0512	Diâmetro 1 mm
Tubo de peróxido de silicone	VWR international	228-0700	Diâmetro 3 mm
Tabela 3: Crescimento de biofilme
Solução de caldo de lisogenia (LB)	Amresco-VWR	J106-10PK	Meio padrão usado para cultivar bactérias.
Solução M63B1	Meio mínimo padrão caseiro		usado para cultivar bactérias.
Glicose	Sigma-Aldrich	G8270	Usado para fazer meio M63B1 com 0,4% de glicose.
Tabela 4: Câmera Eletrônica
EMCCD	Hamamatsu	C9100-02
Controlador	de aquecedor Instrumentos de precisão mundial	300354
Gerador de funções	Agilent technologies	33210A
Amplificador de potência	caseiro		Dá um sinal de corrente com amplitudes de até 4 A.
Bombas de seringa	Kd Scientific	KDS-220
Obturador	Vincent Associates	Uniblitz T132
Pinças magnéticas	Feitas em		Dois pólos eletromagnéticos, cada um feito de uma bobina de cobre com 2.120 voltas de fio de cobre de 0,56 mm de diâmetro e núcleos de liga magnética macia (Supra50-Arcelor Mittal, França) em forma quadrada de acordo com o modelo mostrado em Figura 10. Os dois núcleos são montados no pólo norte voltado para o pólo sul, a fim de gerar uma força magnética em uma direção ao longo do comprimento do capilar. Consulte os detalhes da fiação da bobina em Figura 11.
Tabela 5: Óptica
Microscópio invertido	Objetiva Nikon	TE-300
S Fluor x40 (NA 0.9, WD0.3)	Nikon		Esta é uma objetiva de longa distância de trabalho que permite a observação do biofilme em profundidade.
Filtros de epifluorescência: 1) para fluorescência verde: Exc 480/20 nm; DM 495; Em 510/20  2) para fluorescência vermelha: Exc 540/25 nm; DM 565; Em 605/55	Chroma	1)#49020 2)#31002	O deslocamento de partículas após a aplicação de força é registrado usando o bloco de filtro de fluorescência vermelho.
Tabela 6: Análise de imagem
ImageJ	NIH - plug-in