Single-plantas, estéreis Microcosmos para a nodulação e crescimento da planta da leguminosa<em&gt; Medicago truncatula</em&gt; Com o rizóbio Symbiont<em&gt; Sinorhizobium meliloti</em

Resumo

Crescimento de plantas truncatula Medicago em simbiose com as bactérias fixadoras de nitrogênio meliloti Sinorhizobium em microcosmos, estéreis individuais feitas a partir de placas de laboratório padrão permite o exame freqüente de sistemas de raízes e nódulos, sem comprometer a esterilidade. As plantas podem ser mantidos em câmaras de crescimento para estes até 9 semanas.

Resumo

Bactérias simbióticas, rizóbios formar nódulos fixadores de nitrogênio nas raízes das plantas leguminosas hospedeiras compatíveis. Um dos sistemas modelo mais bem desenvolvidos para o estudo dessas interações é a planta Medicago truncatula cv. Jemalong A17 eo rizóbio bactéria Sinorhizobium meliloti 1021. Imagem repetida de raízes das plantas e de pontuação de fenótipos simbióticas requer métodos que são não-destrutivas para plantas ou bactérias. Os fenótipos simbióticas de algumas plantas e bactérias mutantes se tornam aparentes após períodos relativamente curtos de crescimento, e não necessitam de observação a longo prazo da interacção hospedeiro / simbionte. No entanto, diferenças sutis na eficiência e nódulo senescência fenótipos simbióticas que não são aparentes nos primeiros estágios do processo de nodulação exigem períodos de crescimento relativamente longo antes que eles possam ser marcado. Vários métodos têm sido desenvolvidos para o crescimento a longo prazo e observação deste par host / simbionte.No entanto, muitos destes métodos requerem rega repetidas, o que aumenta a possibilidade de contaminação por outros microrganismos. Outros métodos requerem um espaço relativamente grande para o crescimento de um grande número de plantas. O método descrito aqui, o crescimento simbiótica de M. truncatula / S. meliloti em estéreis, microcosmos uma única planta, tem várias vantagens. Plantas nestes microcosmos tem humidade e nutrientes suficientes para assegurar que a rega não é necessária para até 9 semanas, impedindo a contaminação cruzada durante a rega. Isso permite que os fenótipos de ser quantificado, que pode ser desperdiçada em sistemas de crescimento de curto prazo, tais como atrasos sutis no desenvolvimento de nódulos e nódulo senescência precoce. Além disso, as raízes e nódulos no microcosmos são facilmente visualizado através da tampa da placa, de modo que se-enraizamento das plantas por observação não é necessária.

Introdução

A interação entre a planta hospedeira leguminosa Medicago truncatula A17 ea bactéria rizóbio Sinorhizobium meliloti 1021 é um dos sistemas modelo mais tratável para o estudo do desenvolvimento de nódulos de raiz e simbiose de fixação de nitrogênio. Os genomas de ambos os parceiros simbióticas foram seqüenciados ^1,2 e ambos planta e bactéria são passíveis de manipulação genética ^3,4. Análise dos fenótipos de ambas plantas e bactérias mutantes requer a capacidade de observar as fases de desenvolvimento de nódulos e para quantificar a produtividade simbiótica com o tempo. Aqui nós descrevemos um método para a observação do desenvo....

Protocolo

Realizando os passos 1, 2, 4, 6 e numa câmara de fluxo laminar estéril, é recomendado.

1. Preparação de M. truncatula A17 Mudas

Nota: M. truncatula A17 sementes utilizadas nestes estudos são produzidos sob condições de estufa refrigerado a ~ 22 ° C, ou em uma sala de crescimento das plantas mantidas a 22-26 ° C com ~ 150-400 mmol / m ^-2 s ^-1 luz.

1. Preparar placas de germinação de sementes: use 100 milímetros placas quadradas (15 mm de profundidade) e despeje autoclavado 1,1-1,2% w / v purificado agar ¹⁰ a uma profundidade de 3-5 mm. Cada placa será u....

Resultados

A preparação e inoculação desses microcosmos placa é relativamente simples em comparação com a maioria dos outros métodos descritos na introdução. O uso desses microcosmos também permite o crescimento das plantas prolongada (até 9 semanas) sem rega ou a suplementação de nutrientes, manutenção da esterilidade de raiz, tanto fácil exame de raízes e proteção das raízes da luz, o crescimento sem restrições da parte aérea, de fácil acesso para a parte aérea para medição do comprimento, e a remoção de plantas a partir dos mic.......

Discussão

Há várias etapas do protocolo que são críticos para o sucesso: 1) A necessidade do uso de purificada, planta de célula de cultura testados agar não pode ser subestimada. Este não é crítica para plântulas de alfafa, mas que é crucial para o crescimento de M. truncatula A17. 2) É importante para germinar sobre placas de agar de mudas verticais como descrito no Passo 1. A técnica amplamente utilizada de germinação de mudas em uma superfície horizontal invertida em uma placa de 15 milímetros de profundidade ^7<.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Sigma	A7921		purificado em ágar, testado para cultura de células vegetais