Aqui descrevemos um procedimento para imagem de complexos virais em liquidez em resolução de nanômetros usando um microscópio eletrônico de transmissão.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
In situ TEM de Assembleias Biológicas em Líquido
* These authors contributed equally
Neste artigo
Aviso de errata
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Resumo
Resumo
Os pesquisadores usam regularmente microscópios eletrônicos de transmissão (TEMs) para examinar entidades biológicas e avaliar novos materiais. Aqui, descrevemos uma aplicação adicional para esses instrumentos: visualização de conjuntos virais em um ambiente líquido. Este excitante e novo método de visualização de estruturas biológicas utiliza um suporte de espécimes de base microfluidic recentemente desenvolvido. Nosso artigo em vídeo demonstra como montar e usar um suporte microfluido para imagem de amostras líquidas dentro de um TEM. Em particular, usamos partículas de rotavírus de dupla camada (DLPs) como nosso sistema modelo. Também descrevemos passos para revestir a superfície da câmara líquida com biofilmes de afinidade que amarram DLPs à janela de visualização. Isso nos permite fazer assembleias de imagem de forma adequada para a determinação da estrutura 3D. Assim, apresentamos um primeiro vislumbre de partículas subvirais em um ambiente líquido nativo.
Introdução
Um objetivo comum de biólogos e engenheiros é entender o funcionamento interno das máquinas moleculares. Os microscópios eletrônicos de transmissão (TEMs) são instrumentos ideais para visualizar esses detalhes intrincados na resolução quase atômica1-2. Para sustentar o sistema de alto vácuo de um TEM, as amostras biológicas são tipicamente incorporadas em pelíneas de gelo vítreo3, açúcares4,sais de metal pesado5, ou alguma combinação de6. Como resultado, imagens de espécimes incorporados podem revelar apenas instantâneos limitados de processos dinâmicos.
As primeiras tentativas de mante....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
1. Prepare os dispositivos de captura de afinidade16
- Limpe o nitreto de silício E-chips incubando-os em 15 ml de acetona por 2 min seguido por 15 ml de metanol por 2 min(Figura 1A). Deixe os chips secarem sob o fluxo de ar laminar.
- Incubar os chips secos em uma placa de agitação aquecida (sem mexer) durante 1,5 h a 150 °C, em seguida, deixe esfriar até a temperatura ambiente antes de usar.
- Use seringas Hamilton para compor misturas lipídicas em pequenos tubos de vidro para conter 25% de clorofórmio, 55% DLPC (1,2-dilauroyl-fosfocolina) em clorofórmio (1 mg/ml) e lipídio ni-NTA ....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
Imagens representativas de DLPs em líquido usando E-chips que foram descarregadas por brilho(Figura 3A) mostram menos DLPs em uma determinada área de visualização, presumivelmente devido à difusão, em comparação com DLPs que são enriquecidos em dispositivos affinity capture(Figura 3B). A adição de formato de urano na câmara de imagem aumenta o contraste da amostra e, consequentemente, a visibilidade de DLPs individuais na solução(Figura 3C, painel superior). Um melhor co.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
Em nosso trabalho apresentado, utilizamos a abordagem de captura de afinidade para dLPs rotavírus de tether para uma plataforma microfluida. Isso permitiu imagens in situ de complexos macromoleculares em um microambiente líquido. A abordagem de captura é significativa em relação a outras técnicas de imagem microfluidica, pois localiza espécimes biológicos na janela de imagem para negar grandes problemas difusivos que surgem durante a gravação de imagens em líquido. No entanto, uma das etap.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
A autora, Madeline J. Dukes, é funcionária da Protochips, Inc.
Agradecimentos
Os autores reconhecem o Dr. Michael J. Friedlander, Diretor do Instituto de Pesquisa Virginia Tech Carilion por incentivar nossos esforços de pesquisa. Este projeto foi apoiado por fundos de desenvolvimento para S.M.M e D.F.K. e, em parte, pela iniciativa Nano-Bio do Institute for Critical Technology and Applied Science da Virginia Tech.
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| E-chips, chip espaçador | Protochips, Inc. | EPB-52TBD | 400 μ m x 50 μ Janela M |
| E-chip, chip superior | Protochips, Inc. | EPT-45W | 400 μ m x 50 μ janela m Lipídio |
| Ni-NTA | Avanti Polar Lipids | 790404P | Forma de pó |
| DLPC (12:0) lipídio | Avanti Polar Lipids | 850335P | Forma de pó |
| Frascos volumétricos | Fisher Scientific | 20-812A; 20-812C | 1 ml; 5 ml |
| Seringas Hamilton | Hamilton Co. | 80300, 80400 | 1-10 μ l; 1-25 μ l |
| Papel de filtro Whatman #1 | Whatman | 1001 090 | 100 peças, 90 mm |
| Placas de Petri de vidro | Corning | 70165-101 | 100 mm x 15 mm |
| Pipetas de vidro Pasteur | VWR | 14673-010 | 14673-010 |
| Tubos de cultura de vidro | VWR | 47729-566 | 6 mm x 50 mm |
| Acetona | Fisher Scientific | A11-1 | 1 L |
| Metanol | Fisher Scientific | A412-1 | 1 L |
| Clorofórmio | Ciências de Microcópia Eletrônica | 12550 | 100 ml |
| Proteína A marcada com ele | Abcam, Inc. | ab52953 | Sistema |
| de água Milli-Q | EMD Millipore Corp. | Z00QSV001 | Água Ultrapura |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | 500 g |
| Equipamento | |||
| Poseidon In situ suporte de espécime | Protochips, Inc. | FEI compatível | |
| FEI Spirit BioTwin TEM | FEI Co. | Câmera | |
| CCD Eagle 2k HS | FEI Co. | 10 Å/amostragem de pixels a 30.000X | |
| Gatan 655 Estação de bombeamento a seco | Gatan, Inc. | Ponta do suporte da bomba para 10-6 range | |
| PELCO easiGlow, unidade de descarga luminescente | Ted Pella, Inc. | Modo de polaridade negativa | |
| Placa de agitação aquecida Isotemp | Fisher Scientific | Heat para 150 º C por 1,5 horas |
Referências
- Zhou, Z. H. Towards atomic resolution structural determination by single-particle cryo-electron microscopy. Curr. Opin. Struct. Biol. 18, 218-228 (2008).
- Wolf, M., Garcea, R. L., Grigorieff, N., Harrison, S. C. Subunit interactions in bovine papillom....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
Errata
Formal Correction: Erratum: In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid
Posted by JoVE Editors on 10/10/2024. Citeable Link.
This corrects the article 10.3791/50936
