O labirinto de água radial de oito braços foi projetado para avaliar o desempenho da referência e da memória de trabalho simultaneamente, exigindo que os sujeitos usem dicas extra-labirinto para localizar plataformas de fuga e corrige as limitações observadas em projetos de labirintos de braço radial terrestres.
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Artigo de método
Uso de um labirinto de água radial de oito braços para avaliar a memória de trabalho e de referência após lesão cerebral neonatal
Neste artigo
Resumo
Resumo
A memória de trabalho e de referência é comumente avaliada usando o labirinto de braço radial terrestre. No entanto, esse paradigma requer pré-treinamento, privação de alimentos e pode introduzir confusão de pistas de cheiro. O labirinto de água radial de oito braços foi projetado para avaliar o desempenho da referência e da memória de trabalho simultaneamente, exigindo que os sujeitos usem dicas extra-labirinto para localizar plataformas de fuga e corrige as limitações observadas em projetos de labirintos de braços radiais terrestres. Especificamente, os sujeitos são obrigados a evitar os braços usados anteriormente para fuga durante cada dia de teste (memória de trabalho), bem como evitar os braços fixos, que nunca contêm plataformas de fuga (memória de referência). Reentradas em braços que já foram usados para fuga durante uma sessão de teste (e, portanto, a plataforma de fuga foi removida) e reentradas em braços de memória de referência são indicativas de déficits de memória de trabalho. Alternativamente, as primeiras entradas em braços de memória de referência são indicativas de déficits de memória de referência. Usamos esse labirinto para comparar o desempenho de ratos com lesão cerebral neonatal e controles simulados após a indução de hipóxia-isquemia e mostrar déficits significativos na memória de trabalho e de referência após onze dias de teste. Este protocolo pode ser facilmente modificado para examinar muitos outros modelos de dificuldade de aprendizagem.
Introdução
A memória de trabalho (MT) corresponde a um domínio cognitivo crítico necessário para a representação de objetos ou lugares durante o comportamento direcionado a um objetivo1. Alternativamente, a memória de referência (RM) é necessária para representações temporalmente estáveis desses objetos ou lugares. A memória de trabalho e de referência tem sido avaliada há muito tempo em roedores usando paradigmas de labirinto de braço radial terrestre2,3. No entanto, essas tarefas freqüentemente requerem pré-treinamento, pois os ratos não estão predispostos a correr espontaneamente no labirinto. Isso pode aumentar significativamente o tempo necessário para concluir um experimento e pode interferir em projetos longitudinais sensíveis ao tempo. Outras limitações do labirinto terrestre de oito braços incluem requisitos para privação de alimentos e dificuldade em controlar as mudanças nos sinais de cheiro deixados no labirinto após cada tentativa. Muitas dessas limitações foram superadas usando o paradigma do labirinto aquáticode Morris 4, no entanto, historicamente, esses projetos foram limitados a testar a memória de referência e o aprendizado espacial (exceções5-9). O labirinto de água radial de oito braços é uma versão modificada do labirinto radial terrestre de oito braços, que tem sido usado para avaliar a memória de referência e de trabalho em ratos e camundongos5-7. Em contraste com os labirintos terrestres tradicionais, o labirinto de água radial de oito braços não requer privação de comida, minimiza possíveis pistas de cheiro confusas e utiliza a motivação dos sujeitos para escapar como um meio eficaz de avaliar o trabalho e o aprendizado de referência e a memória simultaneamente, sem a necessidadede pré-treinamento 5-7.
Uma aplicação para esse paradigma é testar déficits de memória de trabalho após lesão cerebral neonatal. Pesquisas em humanos mostraram que bebês prematuros com risco de lesão cerebral apresentam déficits de memória de trabalho mais tarde na vida10,11. A lesão cerebral neonatal pode ser modelada em roedores induzindo hipóxia/isquemia (HI) no início do desenvolvimentopós-natal 12-15. Mais importante, os déficits de aprendizagem espacial e memória de trabalho encontrados em bebês de risco são paralelos em roedores que usam o labirinto de água do braço radial, tornando-o um modelo robusto para o estudo de tais deficiências8,9. O labirinto de água radial de oito braços também permite a quantificação simultânea de referência e memória de trabalho, tornando-o ideal para a comparação de indivíduos com lesão cerebral e não feridos em modelos sensíveis ao tempo (ou seja, durante viúvas de desenvolvimento discretas) ou para projetos longitudinais contrabalançados.
Neste protocolo, descrevemos os procedimentos de teste usando um labirinto de água radial de oito braços (ver Figura 1) e dados de exemplo para ratos com e sem lesão hipóxico-isquêmica neonatal. A hipóxia-isquemia (HI) foi induzida no 7º dia pós-natal após cauterização da artéria carótida comum direita e 120 min de exposição a 8% de oxigênio. Este procedimento cirúrgico tem sido amplamente utilizado para modelar patologia da prematuridade e lesão cerebral neonatal (para detalhes, consulte 12,13,16,17). Mostramos que o paradigma do labirinto aquático do braço radial revela déficits na memória de referência e nas capacidades da memória de trabalho após lesão neonatal de HI. No protocolo atual, a memória de referência é avaliada usando quatro braços específicos do labirinto de água radial de oito braços, que permanecem constantes a pistas extras do labirinto durante o teste. Esses braços nunca contêm uma plataforma de fuga, portanto, as entradas do sujeito nesses braços refletem um desempenho ruim da memória de referência e déficits no aprendizado de longo prazo. Os quatro braços restantes contêm plataformas de fuga no início do dia, no entanto, cada plataforma é removida quando o animal entra com sucesso em um braço e escapa da água5-7. Isso exige que o animal se lembre de quais braços entrou nas quatro tentativas sucessivas, aumentando a demanda de memória de trabalho à medida que cada plataforma adicional é removida. A memória de trabalho é avaliada examinando as reentradas em braços previamente usados para fuga no mesmo dia de teste ou reentradas em braços de memória de referência. Além disso, este projeto utiliza pistas extra-labirinto para localizar as plataformas de fuga que refletem o aprendizado espacial dependente do hipocampo. Este método para avaliar erros de memória de trabalho e de referência foi originalmente usado por Jarrard et al.18 e, desde então, tem sido amplamente utilizado para avaliar modelos de roedores de distúrbios neurológicos relacionados ao envelhecimento, dificuldades de aprendizagem e manipulações hormonais subsequentes5,6,7,19,20.
O objetivo principal deste paradigma é avaliar a referência e a memória de trabalho, portanto, o design do labirinto de água radial de oito braços não deve ser limitado para testar déficits devido a lesão cerebral no desenvolvimento. Em vez disso, estudos anteriores usando esse paradigma mostram que uma variedade de modelos de roedores pode ser avaliada para avaliar a patologia da aprendizagem e da memória em muitos contextos experimentais5,6,7,18,19,20.
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Protocolo
Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Rhode Island College e aderem ao Guia do National Institutes of Health para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório.
1. Configuração do labirinto
- Coloque dicas extra-labirinto claras, estáticas e salientes (formas pintadas, móveis ou outras características da sala estacionária) ao redor do labirinto.
Nota: Quaisquer pistas extra-labirinto devem permanecer no mesmo local durante o experimento. - Coloque o cubo e os braços do labirinto do braço radial em uma cuba de plástico (consulte a tabela de equipamentos, por exemplo).
Nota: O labirinto usado neste protocolo consiste em oito braços removíveis de aço inoxidável presos a oito suportes centrais afixados a uma base circular de aço inoxidável que foi pintada de preto (consulte a Figura 1 para o diagrama e as dimensões correspondentes). A cuba plástica exemplificada na Figura 1 tem um diâmetro interno de 122 cm e uma altura de 60 cm. - Encha a cuba com água aquecida à temperatura ambiente (22-26 °C)7.
- Coloque plataformas 1 cm abaixo da superfície da água nas extremidades de quatro dos oito braços.
Nota 1: Para cada sujeito, os locais das plataformas são fixados durante o teste. Independentemente da configuração, deve-se tomar cuidado para evitar a colocação das plataformas em mais de dois braços adjacentes (não mais do que duas plataformas devem estar localizadas em braços adjacentes). Não coloque uma plataforma no braço inicial.
Nota 2: As plataformas ocultas devem ser pintadas da mesma cor que a inserção do labirinto para se misturar com o fundo do labirinto.
2. Transferindo assuntos para teste
- Transfira os sujeitos do biotério para a sala de testes mantendo a ordem de teste designada.
Nota: Os animais devem ser colocados em uma gaiola opaca para ajudar a reduzir o estresse antecipatório e evitar a visualização de pistas da sala de teste. - Uma vez na sala de testes, coloque todas as gaiolas opacas do grupo 1 em uma bancada ou mesa de teste mantendo a ordem de teste.
Nota: Em um grande estudo (por exemplo, 30 indivíduos), pode ser melhor dividir os indivíduos em grupos de teste (por exemplo, 3 grupos de 10 indivíduos cada). Isso dependerá do tamanho da sua sala de testes e da viabilidade do transporte do sujeito.
3. Protocolo de tablet digital para gravação de entradas de braço de labirinto
- Abra um programa de criação de PDF no tablet digital.
- Importe todos os modelos de gravação de dados pré-salvos para assuntos no grupo 1.
Nota: Cada modelo de gravação deve ser pré-salvo e rotulado com números específicos de assunto e ensaio (por exemplo, assunto 1_trial 1, assunto 1_trial 2, etc.) com um total de quatro modelos para cada assunto (ensaios 1-4). O modelo deve ter uma representação em branco dos locais do labirinto e da plataforma, bem como um local para registrar o número do sujeito, o número do teste, o dia do teste, a plataforma de escape usada e a latência do teste (consulte a Figura 2). - Abra o modelo para o primeiro teste do seu primeiro assunto.
Nota: Este sistema também pode ser usado com modelos de papel para pesquisadores sem acesso a tablets ou programas de anotações baseados em tablets.
4. Teste de labirinto aquático de braço radial
- Se os animais forem alojados aos pares, separar os sujeitos antes da sessão de ensaio. Transfira o primeiro sujeito de teste para uma gaiola de aquecimento opaca separada.
Nota: A gaiola deve ser aquecida a 37 °C usando uma almofada de aquecimento para manter a temperatura corporal entre os ensaios. - Antes do primeiro teste de cada sujeito, confirme se o número de identificação do sujeito corresponde ao número do sujeito na folha de registro de dados e certifique-se de que as plataformas estejam posicionadas corretamente no labirinto aquático de oito braços.
- Coloque o assunto no braço inicial de frente para a parede do labirinto e inicie o cronômetro.
Nota: Este protocolo foi projetado para dois experimentadores, um para registrar os dados e outro para lidar com os sujeitos. Durante essa colaboração, a comunicação entre os experimentadores é fundamental. A confirmação dos horários de início, número de sujeitos e posicionamento adequado da plataforma antes de cada teste é essencial. - Permaneça parado durante cada tentativa em uma posição designada na sala para manter a consistência do cue durante cada tentativa.
Nota: Deve-se tomar cuidado para evitar pistas salientes enviadas (por exemplo, perfumes) durante os experimentos e os experimentadores devem usar as mesmas roupas (jalecos) todos os dias para manter a consistência das dicas. - Registre cada entrada em um braço colocando uma marca no braço correspondente no modelo de gravação no tablet digital.
Nota: Uma entrada ocorre quando os ombros de um sujeito quebram o plano de abertura do braço. - Aguarde no máximo 120 segundos para que o sujeito localize uma das quatro plataformas. Assim que o animal chegar à plataforma, pare o cronômetro, o teste está concluído.
Nota: Para manter a consistência, diz-se que um sujeito atingiu o alvo quando suas patas dianteiras estão na plataforma. - Se o sujeito não conseguir localizar a plataforma em 120 segundos, guie-o cuidadosamente até a plataforma mais próxima e deixe-o permanecer na plataforma por 10 segundos antes da remoção para garantir que o animal esteja ciente do local de destino.
- Apenas no primeiro dia, permita que o sujeito se sente na plataforma por 10 segundos após cada uma das quatro tentativas para que o sujeito possa consultar as dicas espaciais.
- Após a conclusão do teste, remova o sujeito da plataforma levantando-o suavemente pelo corpo.
- Inicie o cronômetro para o intervalo entre tentativas de 90 segundos.
- Coloque o sujeito de volta na gaiola individual sobre a almofada de termorregulação.
- Registre a plataforma específica usada para fuga circulando o local correspondente no modelo de registro de dados.
- Durante este intervalo, remova a plataforma de fuga usada pelo sujeito na tentativa anterior.
- Abra o modelo para o próximo teste e marque todas as plataformas que foram usadas para escape pelo sujeito e, portanto, removidas durante os testes anteriores, com um X.
Nota: Marcar todas as plataformas ausentes antes de uma avaliação subsequente é fundamental para definir os tipos de erro (por exemplo, memória de referência e/ou memória de trabalho correta). - Antes de iniciar uma avaliação subsequente, confirme o número da entidade, o número da avaliação e os locais restantes da plataforma.
- Após o intervalo entre tentativas de 90 segundos, coloque o sujeito no braço inicial voltado para a parede do labirinto e inicie o cronômetro para a próxima tentativa.
- Repita esse processo para as tentativas 2-4, removendo a plataforma de fuga alcançada após cada tentativa e marcando o modelo adequadamente durante e após cada tentativa (ou seja, coloque um X sobre as plataformas removidas, indique os braços inseridos e circule a plataforma usada para fuga).
- Uma vez que todos os quatro testes para um assunto tenham sido concluídos, coloque as plataformas de fuga de volta nos braços apropriados do labirinto e repita o processo de teste para o próximo assunto (etapas de teste 4.1-4.17).
- Assim que o teste for concluído para o grupo 1, exporte as folhas de registro de dados para uma pasta para esse dia de teste (por exemplo, Dia 1) e salve-as em um sistema de armazenamento de arquivos.
Observação: as planilhas de registro de dados devem ser exportadas antes de iniciar o próximo grupo de teste para minimizar a chance de perda de dados. - Repita para cada grupo (etapas de teste 2.1-4.19).
5. Variáveis Dependentes
- Para cada teste, conte o número de entradas de primeira e repetição em qualquer braço que anteriormente tinha uma plataforma. Isso será indicado por um X sobre a plataforma na folha de registro de dados. Estes são os erros corretos da memória de trabalho.
Observação: como os erros de correção da memória de trabalho dependem da lembrança da localização de uma plataforma que já foi usada para fuga e de evitar esse braço, você não pode ter um erro de correção de memória de trabalho na primeira tentativa. - Para cada teste, conte o número de primeiras entradas em qualquer braço que nunca continha uma plataforma da folha de registro de dados. Esses são erros de memória de referência.
- Para cada teste, conte o número de entradas repetidas em qualquer braço que nunca contivesse uma plataforma da folha de registro de dados. Estes são erros incorretos de memória de trabalho.
- Registre a latência para acessar a plataforma para cada teste.
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Resultados
Dados amostrais do nosso laboratório mostram erros significativamente maiores em memória de trabalho em animais HI em comparação com os controles no décimo primeiro dia do teste (t = 2.124, p<0.05, (ver Figura 3A)). Os animais HI também apresentaram erros significativamente maiores em memória de referência em comparação com os animais controle no décimo primeiro dia do teste (t = 2.303, p<0.05, (ver Figura 3B)). Os erros incorretos de memória de trabalho e os erros de referência in...
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Discussão
O paradigma do labirinto de água radial de oito braços tem sido utilizado com sucesso em nosso laboratório e por outros para avaliar o desempenho da memória de trabalho e referência em ratos com e sem lesão cerebral neonatal5-7,18-20. No paradigma atual, a remoção de uma plataforma de escape após cada tentativa aumenta a demanda de memória de trabalho (os sujeitos têm menos opções de fuga) nas tentativas subsequentes. Portanto, no teste quatro, resta apenas uma plataforma e a demanda de memória de trabalho é m...
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Divulgações
Os autores declaram que não têm interesse financeiro conflitante.
Agradecimentos
Os autores gostariam de agradecer a William Martin e ao departamento de arte do Rhode Island College pela assistência na fabricação do labirinto. Também gostaríamos de agradecer aos alunos do Rhode Island College Katrina Feyerherm, Molly La Rue e Nick Lafond pelo trabalho de execução de matérias no labirinto aquático de oito braços. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa da Rhode Island Idea Network for Biomedical Research excellence (RIINBRE) e do NIH National Center for Research Resources (Grant # P20 RR16457-12). O apoio também foi fornecido pelo Instituto Nacional de Saúde Infantil e Desenvolvimento Humano Eunice Kennedy Shriver dos Institutos Nacionais de Saúde sob o número de prêmio R15HD077544.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Banheira de plástico | Gototanks http://www.gototanks.com | ARM-19455 | O tamanho pode variar dependendo da espécie testada ou das necessidades individuais do laboratório. |
| iPad ou outro tablet digital | Apple Inc. | N/A | http://www.apple.com |
| Notabilidade ou outra aplicação de anotações | Gingerlabs | N/A | http://www.gingerlabs.com Gravador de pdf digital ou programa de anotações |
| Temporizador digital | Qualquer | almofada | |
| Braintree Scientific | ASS7D | http://www.braintreesci.com/ | |
| Inoxidável labirinto de aço | Fabricado em casa | N / A |
Referências
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Reimpressões e permissões
