Investigando Sistemas receptor-ligante do Celulossoma com base-AFM única molécula Força Espectroscopia

Markus A. Jobst; Constantin Schoeler; Klara Malinowska; Michael A. Nash

doi:10.3791/50950

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Artigo de método

Investigando Sistemas receptor-ligante do Celulossoma com base-AFM única molécula Força Espectroscopia

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DOI:

10.3791/50950

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20 de dezembro de 2013

Markus A. Jobst^*¹ , Constantin Schoeler^*¹ , Klara Malinowska¹ , Michael A. Nash¹

¹Lehrstuhl für Angewandte Physik and Center for Nanoscience, Ludwig-Maximilians-Universität

^* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Os celulossomos são complexos multienzimáticos projetados para digerir celulose. O SMFS baseado em AFM foi usado para estudar as propriedades mecânicas e a configuração de dobramento de conjuntos de proteínas associadas ao celulossomo. Apresentamos um fluxo de trabalho completo para imobilização de proteínas, aquisição de dados e análise de dados para estudar as interações de complexos receptor-ligante individuais envolvidos na montagem do celulosomo.

Resumo

Os celulossomos são complexos multienzimáticos discretos usados por um subconjunto de bactérias anaeróbicas e fungos para digerir substratos lignocelulósicos. A montagem das enzimas na proteína de andaime não catalítica é dirigida por interações entre uma família de pares receptor-ligante relacionados compreendendo módulos de coesina e dockerina em interação. A ligação extremamente forte entre os módulos coesina e dockerina resulta em constantes de dissociação na faixa de picomolar a nanomolar baixo, o que pode dificultar medições precisas fora da taxa com métodos convencionais em massa. A espectroscopia de força de molécula única (SMFS) com o microscópio de força atômica mede a resposta de biomoléculas individuais à força e, em contraste com outros métodos de manipulação de molécula única (ou seja, pinças ópticas), é ideal para estudar interações receptor-ligante de alta afinidade devido à sua capacidade de sondar o regime de alta força (>120 pN). Aqui apresentamos nosso protocolo completo para estudar montagens de proteínas celulossômicas no nível de molécula única. Usando uma topologia de proteína derivada do celulossomo nativo, trabalhamos com proteínas de fusão enzimática-dockerina e módulo de ligação a carboidratos-coesina (CBM-coesina), cada uma com um grupo tiol livre acessível em um resíduo de cisteína projetado. Apresentamos nosso protocolo de imobilização de superfície específico do local, juntamente com nosso procedimento de medição e análise de dados para obter parâmetros de ligação detalhados para o complexo de alta afinidade. Demonstramos como quantificar as forças de desdobramento de subdomínio único, forças de ruptura complexas, taxas de desligamento cinéticas e larguras potenciais do poço de ligação. A aplicação bem-sucedida desses métodos na caracterização da interação coesina-dourina responsável pela montagem de complexos celulolíticos multidomínio é descrita mais adiante.

Introdução

Cellulossomos são grandes complexos multienzimáticos exibidos na superfície de bactérias celulolíticas anaeróbicas (por exemplo, C. thermocellum) que evoluíram para despolimerizar eficientemente a lignocelulose da parede celular vegetal em oligossacarídeos solúveis¹. Um atributo central dos celulossomos é a interação coesina-dockerina de alta afinidade. No paradigma mais proeminente, um módulo de dospina de 60-75 aminoácidos tipo I altamente conservado é exibido na extremidade C-terminal das várias enzimas bacterianas. O módulo dockerin direciona a montagem de combinações sinérgicas de enzimas para a proteína de andaime não catalítica ('scaffoldin'), que compreende uma poliproteína de domínios de coesina que são específicos para o módulo dockerin tipo I. Em níveis mais altos, a arquitetura do celulossomo pode se tornar muito complexa, incorporando pares alternativos de coesina e dockerina (por exemplo, tipo II, tipo III) que ancoram as estruturas à superfície celular e permitem a montagem de estruturas ramificadas contendo múltiplos andaimes². Os vários tipos de coesina-dourina, apesar de terem estruturas relacionadas, exibem especificidades de ligação diferencial, suprimindo a reatividade cruzada com andaimes não intencionais ou componentes de outras espécies bacterianas produtoras de celulossoma. Embora as abordagens de bioinformática tenham identificado com sucesso milhares de componentes celulossômicos únicos no nível genético, comparativamente poucas estruturas proteicas são conhecidas, e os mecanismos em ação na determinação da especificidade coesina-dourina continuam sendo uma área ativa da pesquisa em biologia estrutural.

Desde a invenção do microscópio de força atômica (AFM) por Binnig et al.³, vários modos operacionais do AFM foram desenvolvidos e melhorados continuamente, incluindo a imagem latente do noncontact, a imagem latente⁴ do modo da oscilação, e a única espectroscopia da força da molécula (SMFS)^5,6. O SMFS evoluiu para uma técnica amplamente utilizada para sondar diretamente proteínas individuais^7-11, ácidos nucléicos^12-15 e polímeros sintéticos^16-19. Em um experimento típico de SMFS para investigar a ligação receptor-ligante^20,21, uma ponta cantilever AFM é modificada com um dos parceiros de ligação, enquanto uma superfície de vidro plana é modificada com o parceiro de ligação complementar. O cantilever modificado é colocado em contato com a superfície, permitindo que os parceiros se unam. A base do cantilever é então retirada a velocidade constante e a força é medida usando o método de deflexão da alavanca óptica. Os traços de dados de força-distância resultantes exibem picos semelhantes a dentes de serra se a ligação foi estabelecida. Nos casos em que os parceiros de ligação são fundidos a vários domínios de proteína, cada pico no traço de força-distância pode ser correlacionado ao desdobramento de um único domínio de proteína ou subdomínio dobrado, enquanto o último pico corresponde à ruptura da interface de ligação à proteína. As posições específicas dos elementos resistentes à força podem ser usadas como uma impressão digital para identificar os vários domínios de proteína de interesse. Este método pode ser usado para interrogar aminoácidos importantes envolvidos no dobramento e estabilização de proteínas. Muitos modelos foram relatados na literatura para tratar o comportamento característico de extensão de força observado em experimentos SMFS. Os modelos mais comumente usados incluem o modelo de corrente articulada livremente (FJC)²², o modelo de cadeia semelhante a um sem-fim (WLC)^18,23-25 e o modelo de corrente de rotação livre (FRC)^25,26.

Em nosso trabalho anterior¹¹, usamos espectroscopia de força de molécula única para investigar a interação dos módulos coesina e dockerina. Aqui, apresentamos um protocolo experimental para funcionalização de superfícies de vidro e cantilever com construções de proteínas enzimáticas-dockerina e CBM-coesina. Também apresentamos um protocolo SMFS baseado em AFM, incluindo procedimentos de aquisição e análise de dados. O protocolo descrito pode ser facilmente generalizado para outros sistemas moleculares e deve ser particularmente útil para pesquisadores interessados em pares de ligantes de receptores de alta afinidade.

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Protocolo

Um esquema da geometria de tração utilizada neste trabalho para investigar a interação coesina-dockerina é apresentado na Figura 1A. O protocolo de imobilização proteica descrito aqui para funcionalização do cantiléver e do vidro de cobertura é uma versão modificada do procedimento publicado anteriormente²⁷. As proteínas foram expressas a partir de vetores plasmidiais em E. coli utilizando métodos convencionais. As proteínas foram projetadas com um grupo tiol acessível ao solvente, que foi usado em combinação com a química de maleimida para ancorar a proteína à superfície do vidro de cobertura e ao cantiléver por meio de uma ligação tioéter estável. Os resíduos de cisteína modificados nas proteínas de fusão CBM-coesina e xilanase-dockerina localizavam-se no lado N-terminal das proteínas, distantes da interface de ligação entre coesina e dockerina¹¹. Uma visão geral detalhada das ligações químicas empregadas na imobilização proteica é mostrada na Figura 1B.

1. Preparação da amostra

Tampões
1. Prepare o tampão de cloreto de sódio e Tris suplementado com cálcio (TBS): 25 mM TRIS, 75 mM NaCl, 1 mM CaCl₂, pH 7,2
2. Prepare o tampão de borato de sódio: 50 mM Na₂B₄O₇, pH 8,5
  O diagrama de fluxo do processo mostrando as etapas de preparação da amostra é apresentado na Figura 2.
  Na manipulação de cantilevers e lamínulas, recomenda-se o uso de pinças autoclaváveis.
Aminossilanização da lamínula (aproximadamente 1,5 h)
1. Coloque a lamínula (diâmetro de 24 mm, espessura de 0,5 mm) em um suporte de PTFE.
2. Sonicar a lamínula em etanol : água ultrapura na proporção 1:1 (v/v) por 15 min.
3. Lave a lamínula com água ultrapura.
4. Coloque a lamínula na solução de piranha (1:1 H₂SO₄ (concentrado) : H₂O₂ (30%) (v/v)) por 30 min, depois enxágue abundantemente com água ultrapura. Seque a lamínula sob um fluxo suave de N₂. Cuidado: a solução de piranha é extremamente corrosiva. É obrigatório o uso de proteção para os olhos e para a pele.
5. Submergir a lamínula em etanol : água ultrapura : 3-aminopropil dimetil etoxissilano na proporção 45:5:1 (v/v). Colocar em agitador à temperatura ambiente (RT) por 60 min (aproximadamente 50 rpm).
6. Submergir a lamínula sequencialmente em etanol e água ultrapura (2 vezes cada). Seque a lamínula sob um fluxo suave de N₂.
7. Leve a lamínula ao forno (80 °C por 30 min).
8. Lamínulas silanizadas podem ser armazenadas sob argônio por até 6 semanas.
Aminossilanização de cantilevers (aproximadamente 1,5 h)
NOTA: O protocolo apresentado para funcionalização da ponta é apropriado para pontas de cantilever de silício.
1. Coloque os cantilevers sobre uma lâmina de vidro limpa. Trate com ozônio-UV por 15 min.
2. Submergir os cantilevers por 3 min em etanol : 3-aminopropil dimetil etoxissilano na proporção 1:1 (v/v), com uma quantidade catalítica (0,25%, v/v) de água ultrapura.
3. Lave os cantilevers com agitação suave sequencialmente por 60 s em béqueres contendo tolueno, etanol e água ultrapura. Seque cuidadosamente os cantilevers em papel de filtro entre os enxágues.
4. Coloque os cantilevers sobre uma lâmina de vidro limpa e leve à estufa (80 °C por 30 min).
Redução de dissulfetos de proteína (aproximadamente 3 h)
Todas as soluções devem ser preparadas para obter aproximadamente 30 µl de proteína diluída por cantilever e 20 µl de proteína diluída por lamínula. As soluções de proteína devem ser misturadas com o gel redutor de dissulfetos Tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) na proporção 1:2 (v/v).
1. Prepare alíquotas de perlas redutoras de dissulfetos TCEP em microtubos. Recomenda-se cortar as ponteiras de micropipeta com tesoura para aumentar o diâmetro do orifício ao pipetar a suspensão de perlas de TCEP.
2. Lave a suspensão de perlas de TCEP com 1 ml de tampão TBS e centrifugue a 850 rcf por 3 min.
3. Remova e descarte cuidadosamente o sobrenadante com uma micropipeta.
4. Repita as etapas 1.4.2–1.4.3 duas vezes.
5. Adicione solução concentrada de proteína (1–10 mg/ml) às perlas de TCEP (proporção 1:2 proteína : suspensão de perlas de TCEP, v/v) e misture suavemente agitando com a ponteira da micropipeta. Evite introduzir bolhas de ar.
6. Coloque a mistura de suspensão de proteína/perlas de TCEP em um agitador rotativo por 2,5 h.
PEGilação de lamínulas e cantilevers (aproximadamente 1,5 h)
1. Antes da modificação com ligantes NHS-PEG-maleimida, mergulhe os cantilevers e lamínulas aminossilanizados em tampão de borato de sódio (pH 8,5) por 45 min para desprotonar os grupos amina primários na superfície.
2. Assegure-se de que o pó de NHS-PEG-maleimida esteja em temperatura ambiente (RT) antes de abrir a tampa e pesar a quantidade apropriada para uma solução de 25 mM. O NHS-PEG-maleimida não utilizado deve ser armazenado sob argônio a -20 °C. São necessários aproximadamente 30 µl de solução polimérica por cantilever e 90 µl por 2 lamínulas (empilhadas).
3. Após pesar o NHS-PEG-maleimida de 5 kDa, adicione tampão de borato de sódio e vortexie para obter uma solução de 25 mM.
  Nota: A solução deve ser usada o mais rapidamente possível devido à meia-vida extremamente curta do NHS em pH 8,5. O vortex e a transferência do líquido para os cantilevers/lamínulas devem ser concluídos em 1–2 min.
4. Incube os cantilevers em gotas de 30 µl de solução de NHS-PEG-maleimida em uma placa de Petri. Para as lamínulas, coloque 90 µl de solução de NHS-PEG-maleimida sobre uma lamínula individual e adicione uma segunda lamínula em cima, formando um "sanduíche" com a solução de NHS-PEG-maleimida no meio.
5. Incube os cantilevers/lamínulas com a solução de NHS-PEG-maleimida em atmosfera saturada com água à temperatura ambiente (RT) por 1 h.
Conjugação de proteína (aproximadamente 2 h)
Crítico: Minimize a exposição dos cantilevers e lamínulas PEGilados ao ar.
1. Centrifugue as soluções de proteína reduzida/perlas de TCEP a 100 rcf por 1 min e colete o sobrenadante.
2. Dilua a solução de proteína com TBS. O objetivo é obter uma concentração de proteína durante a conjugação superficial na faixa de 0,5–2 mg/ml. Reserve as soluções de proteína reduzida e diluída por alguns minutos enquanto enxágua os cantilevers e lamínulas.
3. Enxágue os cantilevers e lamínulas em três béqueres sequenciais contendo água ultrapura.
4. Remova cuidadosamente o líquido residual das lamínulas tocando suavemente as bordas em papel de filtro sob um fluxo suave de N₂. Remova cuidadosamente o líquido residual dos cantilevers tocando-os em papel de filtro. Aplique imediatamente a solução de proteína diluída.
5. Monte as lamínulas em um suporte de amostra apropriado compatível com o instrumento de AFM.
6. Incube as lamínulas e cantilevers PEGilados com as respectivas soluções de proteína diluída à temperatura ambiente (RT) por 1–2 h.
7. Enxágue os cantilevers em três béqueres sequenciais com TBS para remover proteínas não ligadas. Pipete e enxágue as lamínulas pelo menos 10 vezes.
8. Armazene os cantilevers e lamínulas em TBS antes da medição.

2. Aquisição de Dados

Neste trabalho, foi utilizado um AFM de construção personalizada²⁸, controlado por um controlador MFP-3D da Asylum Research, com software personalizado escrito em Igor Pro. O desvio da alavanca é medido pelo método de desvio do feixe óptico²⁹. Os protocolos de preparação da amostra e de análise de dados fornecidos aqui são aplicáveis independentemente do modelo exato de AFM utilizado. No entanto, o modelo de AFM deve ser adequado para medições em líquidos e suportar uma faixa de velocidade acessível no piezo z de aproximadamente 200-5.000 nm/s.

Monte o cantiléver funcionalizado e a superfície de vidro no MFA. Durante todo o procedimento, a superfície deve permanecer coberta com tampão. Ao montar o cantiléver, minimize a exposição ao ar. Após o ajuste correto do feixe de laser, deixe o sistema equilibrar por pelo menos 30 min para reduzir quaisquer efeitos de deriva e reajuste, se necessário.
Registre um espectro de ruído térmico com o cantiléver distante da superfície, ou seja, na ausência de efeitos de amortecimento.
Utilize um método minimamente invasivo, como a abordagem acústica, para localizar a superfície sem danificar a ponta do cantiléver antes da medição. Se possível, aproxime manualmente o cantiléver da superfície e use fones de ouvido para escutar o ruído térmico no sinal bruto de deflexão proveniente do controlador do MFA. Assim que o cantiléver se aproximar da superfície, uma mudança distinta no som será audível.
Observação: A ponta do cantiléver deve agora estar a 2-5 µm da superfície. A natureza da mudança sonora depende do cantiléver utilizado. A frequência de ressonância do cantiléver usado neste trabalho é aproximadamente 25 kHz na água, acima da faixa auditiva humana. Devido aos efeitos de amortecimento próximos à superfície, a ressonância é deslocada para frequências mais baixas, trazendo a ressonância do cantiléver para a faixa audível. Assim, percebe-se um aumento aparente na frequência e na intensidade do som.
Nos casos em que não houver saída de áudio do sinal de deflexão, a superfície pode ser aproximada com o z-piezoeletrico enquanto um feedback ativo no sinal de deflexão estiver habilitado. Assim que o sinal de deflexão aumentar em uma quantidade definida devido à indentação da superfície, a aproximação é interrompida.
Determine a sensibilidade inversa do alavanca óptica (InvOLS), que representa a distância de deslocamento da ponta (em nm) por volt de sinal de deflexão. Faça isso indentando a superfície com a ponta do cantiléver. Recomenda-se uma tensão de ponto de ajuste de deflexão correspondente a um deslocamento da ponta do cantiléver de aproximadamente 3 nm.
Determine a constante elástica do cantiléver ajustando uma função de resposta de oscilador harmônico simples ao espectro de ruído térmico, de acordo com o teorema da equipartição^30,31.
Inicie uma rotina experimental. Para este trabalho, foi utilizado o seguinte conjunto de parâmetros de medição: velocidade de aproximação: 3.000 nm/s; força de indentação: 180 pN; tempo de permanência na superfície: 10 ms; velocidades de recuo: 0,2, 0,7, 2,0, 5,0 µm/s com taxas de amostragem de 2.000, 5.000, 15.000, 20.000 Hz, respectivamente; distância de recuo: 500 nm.
Observação: A taxa de amostragem não deve ser definida acima de 10 pontos/nm para evitar superamostragem e manter os tamanhos dos dados razoáveis.
Após cada traçado força-distância, acione os estágios piezoelétricos x e y para expor uma nova posição da superfície à ponta do cantiléver em cada curva força-distância. Essa técnica permite amostrar uma área maior da superfície do vidro de cobertura durante medições de longa duração.
Utilize a rezeragem periódica do estágio de deflexão (ou seja, posição do fotodiodo) e da altura do chassi z-piezoeletrico durante medições de longa duração, caso o sinal de deflexão sofra deriva fora da faixa ou o contato com a superfície seja perdido.
Após a conclusão da série de medições, realize outra medição de InvOLS com uma força de indentação significativamente maior do que a usada antes das medições, a fim de obter um valor de InvOLS mais preciso.
Registre outro espectro de ruído térmico distante da superfície. Determine a constante elástica ao final da série experimental.

3. Análise de Dados

O diagrama de fluxo na Figura 3 ilustra o processo de análise de dados. Realize todas as manipulações dos dados utilizando um pacote de software apropriado, como Igor Pro ou MATLAB. Primeiro, converta o sinal bruto do detector em unidades de força e corrija o deslocamento e deriva. Posteriormente, utilize modelos de elasticidade de biopolímeros para localizar barreiras de energia nos caminhos de desdobramento e identificar subdomínios proteicos. Finalmente, obtenha os parâmetros cinéticos e energéticos da interação receptor-ligante.

Conversão de unidades e correções de dados
1. Multiplicar o sinal de deflexão bruto (volts) pelo InvOLS (nm/volt) e pela constante da mola (pN/nm) para converter a tensão do detector em unidades de força.
2. Compensar os dados de modo que a força no balanço não carregado seja de zero pN, primeiramente calculando a média dos valores de força dos últimos 10% do traçado força-distância (adquiridos mais distantes da superfície) e, em seguida, subtraindo essa média de todos os valores de força no traçado de dados.
3. Compensar cada traçado na direção x de modo que a primeira interseção com o eixo de distância ocorra em uma distância de 0 nm.
4. O InvOLS depende da posição do ponto do laser no balanço. Mesmo pequenas quantidades de deriva no sistema óptico de leitura podem causar mudanças perceptíveis no InvOLS quando a área do balanço for comparável ao tamanho do ponto do laser. Corrija isso por meio da análise do ruído no sinal de deflexão sob força zero. Assumindo condições ambientais constantes, o ruído no sinal de deflexão é diretamente proporcional ao InvOLS.
  1. Meça o valor eficaz (RMS) da deflexão (nível de ruído sob força zero) dos últimos 10% de cada traçado força-distância.
  2. Trace o ruído versus o número da curva e aplique um ajuste adequado. Normalmente, um ajuste exponencial na forma de funcionará melhor, onde N é o ruído, ni é o número da curva, e N0 e k são parâmetros de ajuste. Um ajuste linear também pode ser apropriado para certos conjuntos de dados.
  3. Determine um fator de escala (SF) para cada curva:
    
    Equação 1:
    
    em que ni é o número da curva, nf é o número da curva final, e C é um deslocamento.
  4. Em seguida, divida todos os valores de força em cada curva individual pelo fator de escala. Este procedimento escala cada curva pela razão entre o valor RMS do ruído da curva atual e o valor RMS do ruído da curva final adquirida imediatamente antes da medição do InvOLS.
  5. Realize uma correção de deflexão para transformar o eixo de distância (z) em extensão molecular (z*). Isso leva em conta a flexão do balanço sob força, que encurta a distância entre a ponta do balanço e a amostra em relação ao valor informado pela posição do sensor z-piezo.
    
    Equação 2:
    
    Onde z é a posição medida do sensor z, F é a força atuando sobre o balanço e k é a constante da mola.
Análise de comprimento de contorno
O comprimento de contorno de uma proteína é o comprimento máximo esticado da cadeia polipeptídica. O estado de dobramento de uma proteína refere-se à sua geometria e distância de ponta a ponta determinada pela estrutura secundária e terciária. O comprimento de contorno de uma proteína está diretamente relacionado ao seu estado de dobramento^9,25,32. A posição de rupturas específicas em traçados força-extensão varia amplamente devido à polidispersão dos ligantes PEG, bem como parâmetros externos como temperatura, propriedades do tampão e taxas de carregamento. Isso complica a análise direta dos dados, mas pode ser superado transformando os dados força-extensão no espaço de comprimento de contorno. Essa técnica permite a média de grandes conjuntos de dados e possibilita o uso de reconhecimento automático de padrões para identificar eventos característicos de desdobramento. Assim, é possível classificar traçados de força individuais com base no tipo de interação exibida. O seguinte procedimento descrito anteriormente²⁵ é usado para transformar dados força-extensão no espaço de comprimento de contorno.
1. Resolver o modelo WLC (Equação 3)²³ para o comprimento de contorno L em uma comprimento de persistência fixo p resulta na Equação 4, que fornece o comprimento de contorno L(x,u). Aqui, x é a distância e u=F*p/kBT, onde kB é a constante de Boltzmann e T é a temperatura. Apenas soluções reais podem ser consideradas. Restrições adicionais são x, F>0, L>0, x>0;
  
  Equação 3:
  
  Equação 4:
  
  em que,
  $Equação da função polinomial $ g(u) $, análise matemática, computação simbólica.$

Análise de taxa de carregamento
Extraia informações cinéticas e energéticas sobre a dissociação receptor-ligante aplicando modelos adequados ao espectro de força, ou seja., o gráfico de força de ruptura versus ln(taxa de carregamento).

Para uma velocidade de tração dada, determine a força de ruptura e a taxa de carregamento para os eventos de ruptura de interesse:

Realize um ajuste linear em um traçado força-tempo nas proximidades do evento de ruptura de interesse. Determine a taxa de carregamento a partir da inclinação do ajuste linear no pico. Repita este procedimento para cada traçado que mostre o evento de ruptura de interesse.

Determine a força de ruptura mais provável aplicando um ajuste gaussiano a um histograma das forças de ruptura. Outras funções de ajuste são possíveis.

Determine a taxa de carregamento mais provável.

Repita os passos 3.3.3.1 - 3.3.3.3 para todas as velocidades de tração.

Trace as forças de ruptura mais prováveis contra o logaritmo natural das taxas de carregamento mais prováveis para obter o espectro de força.

Aplique um modelo teórico adequado ao espectro de força para extrair parâmetros cinéticos e energéticos (Figura 4C). Em muitos casos, o modelo linear de Bell-Evans^20,34 pode ser usado e fornecerá boas estimativas para koff, a taxa de dissociação na ausência de força, e Dx, a distância até o estado de transição ao longo da coordenada da reação, conforme mostrado na Equação 5.

Equação 5:

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Resultados

Utilizamos o procedimento descrito para investigar um par coesina-dockerina do tipo I de C. thermocellum. Após a ligação bem-sucedida do par coesina-dockerina, os traços de força-distância registrados exibiram padrões de picos característicos. Um traço típico é mostrado na Figura 4a. Cada pico no traço representa o desdobramento de um subdomínio proteico, sendo o último pico correspondente à dissociação do complexo receptor-ligante.

Para o complexo CBM-coesina-dockeri...

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Discussão

Para obter dados significativos de experimentos de espectroscopia de força de molécula única, é crucial obter geometrias de tração bem definidas e reprodutíveis. O protocolo usado aqui resulta na imobilização específica do local de complexos de proteínas em uma geometria de tração definida.

Os balanços utilizados neste estudo foram escolhidos devido à sua sensibilidade à força e alta frequência de ressonância na água. Além disso, a pequena curvatura da ponta de aproximadamente 10 nm é vantajos...

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Divulgações

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Os autores reconhecem o financiamento de uma bolsa avançada do Conselho Europeu de Pesquisa para Hermann Gaub. Michael A. Nash agradece o financiamento da Society in Science - The Branco Weiss Fellowship Os autores agradecem a Edward A. Bayer, Yoav Barak e Daniel B. Fried, do Instituto Weizmann de Ciência, por fornecerem generosamente as proteínas usadas neste estudo. Os autores agradecem a Hermann E. Gaub, Elias M. Puchner e Stefan W. Stahl pelas discussões úteis.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
3-Aminopropil dimetil etoxissilano	ABCR GmbH	AB110423
5 kDa NHS-PEG-maleimida	Rapp Polymer	13 5000-65-35
TCEP Gel redutor de dissulfeto	Thermo Scientific, Pierce	77712	www.thermoscientific.com/pierce
Tris(hidroximetil)aminometano
BioLever mini cantilevers de nitreto de silício	Olympus	BL-AC40TS-C2	Lotes macios
XYZ Atuadores piezoelétricos	Physik Instrumente GmbH
Infravermelho " amplo espectro" Laser IR	Superlum
MFP-3D AFM Controller	Asylum Research
Igor Pro 6.31	Wavemetrics		Aquisição e análise de dados
Cloreto
sódio Cloreto
cálcio Medidor de pH Borato
			de sódio
Pinças
Óculos de cobertura	Thermo Scientific, Menzel-Glä ser		24 mm de diâmetro, 0,5 mm de espessura
Porta-amostras			feito sob medida
Banho
Pureza analítica	etanol
Ácido sulfúrico (concentrado)			pureza analítica
Peróxido de hidrogênio (30%)			pureza analítica
Agitador orbital
Tolueno			analítica
Papel
Lâminas
Microtubos
Micropipetas
Centrífuga			adequada para microtubos
Rotador
			de Petri
Béqueres
Microscópio

de de de PTFE Sonicatordo pureza de filtrode vidroPlacas óptico

Referências

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