Geração de Quimeras de Almofada de Gordura de Linfonodo para o Estudo da Origem das Células Estromais de Linfonodos

Summary

A geração de quimeras de linfonodos/fat pad para o estudo da origem das células estromais dos linfonodos é descrita. O método envolve o isolamento de linfonodos de camundongos recém-nascidos e bolsas de gordura embrionárias, a geração de bolsas de gordura quiméricas para linfonodos e sua transferência sob a cápsula renal de um camundongo hospedeiro.

Abstract

O estroma é um componente-chave da estrutura e função dos linfonodos. No entanto, pouco se sabe sobre sua origem, composição celular exata e os mecanismos que regem sua formação. Os linfonodos estão sempre encapsulados no tecido adiposo e recentemente demonstramos a importância dessa relação para a formação do estroma linfonodal. As células precursoras de adipócitos migram para o linfonodo durante seu desenvolvimento e, após o envolvimento do receptor de linfotoxina-b, desligam a adipogênese e se diferenciam em células estromais linfóides (Bénézech et al.¹⁴). Com base no potencial do estroma linfóide do tecido adiposo, apresentamos um método usando uma quimera de linfonodo/almofada de gordura que permite o rastreamento da linhagem de precursores de células estromais de linfonodos. Mostramos como isolar os gânglios linfáticos do recém-nascido e o tecido adiposo embrionário EYFP⁺ e fazer uma quimera de almofada de gordura LN/EYFP⁺. Após a transferência sob a cápsula renal de um camundongo hospedeiro, o linfonodo incorpora células precursoras locais do tecido adiposo e termina sua formação. A análise da progênie de células do coxim adiposo EYFP⁺ nos linfonodos resultantes pode ser realizada por análise por citometria de fluxo de linfonodos digeridos enzimaticamente ou por análise de imunofluorescência de criossecções de linfonodos. Ao usar almofadas de gordura de diferentes modelos de camundongos knockout, este método fornecerá uma maneira eficiente de analisar a origem das diferentes populações de células estromais de linfonodos.

Introduction

Os linfonodos (LNs) são órgãos-chave do sistema imunológico situados em locais estratégicos do corpo, ao longo da rede de vasculatura linfática. Eles permitem a filtração de antígenos e patógenos e fornecem um local para apresentação de antígenos aos linfócitos e indução de respostas imunes adaptativas. O estroma, que forma a estrutura básica do LN e orquestra o movimento dos diferentes participantes hematopoiéticos da resposta imune adaptativa, é central para a função desses órgãos. Diferentes populações de células estromais fornecem pistas essenciais e específicas para os movimentos, localização, sobrevivência, proliferação e maturação do componente hematopoiético do sistema imunológico^1-3. As células estromais LN adultas se enquadram em três categorias: as células endoteliais do sangue, as células endoteliais linfáticas e os fibroblastos. Essas três categorias abrangem populações heterogêneas. As populações fibroblásticas contêm células reticulares fibroblásticas (CRF), células dendríticas foliculares (FDC), células reticulares marginais (MRC), enquanto os fibroblastos formam a cápsula, a medula e outras células ainda não^{identificadas1-5}. As origens e os mecanismos que governam a maturação das diferentes populações de células estromais LN não são claros e a ausência de marcadores específicos que permitam o mapeamento do destino de populações específicas de células estromais LN torna seu estudo particularmente difícil. No entanto, uma compreensão completa da ontogenia das células estromais LN é necessária para a compreensão das respostas imunes adaptativas, os mecanismos que contribuem para a tolerância e está na base do desenvolvimento de LNs artificiais.

Até agora, o estudo da origem e desenvolvimento das células estromais LN tem sido limitado principalmente à avaliação direta do desenvolvimento da LN em embriões e recém-nascidos em camundongos selvagens e diferentes linhagens de camundongos knockout^6-9. Essas abordagens são limitadas pela letalidade embrionária e perinatal de algumas das cepas de camundongos portadoras de deleções em genes importantes para o desenvolvimento de LN. Além disso, alguns dos genes essenciais para o desenvolvimento do tecido linfóide também estão envolvidos em uma ampla gama de processos biológicos, como é o caso do RANK^10-11 ou NF-κB2¹². Para resolver essas questões, o isolamento e o transplante de LNs embrionários sob a cápsula renal de um camundongo hospedeiro^{foram realizados 12-13}. Essa técnica permite, por exemplo, a transferência de LNs embrionários geneticamente modificados em um ambiente selvagem para avaliar o desenvolvimento de órgãos e o recrutamento e organização de células hospedeiras. No entanto, o crescimento de LN embrionário enxertado sob a cápsula renal de um hospedeiro adulto é prejudicado, limitando assim o uso dessa técnica.

LNs e depósitos de gordura estão anatomicamente intimamente associados e se desenvolvem simultaneamente durante a embriogênese. Recentemente, demonstramos que a associação LN/tecido adiposo desempenha um papel crucial no fornecimento de progenitores de células estromais para os LNs. Em particular, a sinalização através do LTβR controla o destino das células precursoras de adipócitos, bloqueando a adipogênese e, em vez disso, promovendo a maturação em direção a um fenótipo de célula estromal LN¹⁴. Aqui descrevemos um método baseado na geração de quimeras de almofada de gordura LN permitindo o rastreamento de células derivadas do tecido adiposo no LN em desenvolvimento. Este método será útil para determinar a contribuição dos tecidos adiposos para diferentes populações de células estromais LN e combinado com o uso de tecidos de linhagens de camundongos geneticamente modificados, permitirá uma melhor compreensão dos mecanismos que controlam a diferenciação dos diferentes subconjuntos de células estromais LN.

Protocol

Os camundongos foram criados e mantidos em condições de FPS na Unidade de Serviços Biomédicos da Universidade de Birmingham, de acordo com os regulamentos do Ministério do Interior do Reino Unido e do comitê de ética local. Todos os procedimentos descritos neste protocolo são cobertos por uma Licença de Projeto aprovada pelo comitê de ética local e pelo Ministério do Interior.

1. Isolamento de LNs recém-nascidos

1. Sacrifique os camundongos recém-nascidos por luxação cervical.
2. Corte a cabeça e abra o corpo com uma tesoura do topo da região torácica até a parte inferior da região abdominal e remova cuidadosamente todas as vísceras (coração, pulmões, fígado, intestino, rim, bexiga) da cavidade abdominal.
3. Transferir o corpo para uma placa de Petri de 90 mm contendo meio RF10 (meio RPMI1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino, 100 U/ml de penicilina, 100 mg/ml de estreptomicina e 2 mM de L-glutamina). A partir desta etapa, os tecidos serão mantidos em condições estéreis e manuseados em uma capa de cultura de tecidos.
4. Transfira o corpo para uma nova placa de Petri de 90 mm contendo RF10.
5. Sob o microscópio de dissecação, retire cuidadosamente o peritônio da pele na região inguinal. O LN inguinal está situado na interseção de três vasos sanguíneos na almofada de gordura.
6. Remova cuidadosamente o LN. Certifique-se de que todo o tecido adiposo seja removido. Transfira o LN para uma placa de Petri de 50 mm contendo meio RF10. Mantenha os tecidos no gelo enquanto continua com o procedimento.

2. Isolamento de almofadas de gordura E18.5

1. Para gerar embriões de camundongos no dia 18,5 da gestação (E18.5), configure gestações programadas colocando uma fêmea e um macho por gaiola durante a noite. Separe os camundongos pela manhã e verifique se há tampões vaginais (dia gestacional E0,5).
   1. Eutanasiar as fêmeas obstruídas no dia 18,5 da gravidez por luxação cervical.
   2. Remova os embriões e coloque-os em uma placa de Petri de 90 mm contendo RF10.
2. A partir desta etapa, os tecidos devem ser manuseados usando técnica estéril na capa de cultura de tecidos. Sob o microscópio de dissecação, corte a cabeça, abra os embriões com uma tesoura da região torácica até o fundo da região abdominal e remova cuidadosamente todas as vísceras (coração, pulmões, fígado, intestino, rim, bexiga) da cavidade corporal.
3. Limpe o corpo de todos os tecidos viscerais restantes e lave-o em PBS para eliminar todos os vestígios de sangue que possam dificultar a dissecação.
4. Transferir os corpos limpos para uma nova placa de Petri de 90 mm contendo RF10.
5. Separe cuidadosamente o peritônio da pele na região inguinal. O LN inguinal está situado na interseção de três vasos sanguíneos na almofada de gordura.
6. Remova cuidadosamente o LN e descarte-o. É muito importante remover completamente o LN para garantir que a almofada de gordura usada para as quimeras não esteja contaminada por nenhuma célula estromal linfoide.
7. Remover a almofada de gordura inguinal e transferi-la para uma placa de Petri de 50 mm contendo meio RF10. Mantenha os tecidos no gelo enquanto continua com o procedimento.

3. Geração da Quimera da Almofada LN-fat

1. Preparar o sistema de cultura de órgãos in vitro ¹⁵.
   1. Preparação de esponjas e filtros: Isso pode ser feito com antecedência e esponjas e filtros armazenados estéreis em uma placa de Petri na capela de cultura.
      1. Corte o Vulkan Underwrap em 1-1,5 cm² pedaços
      2. Ferva as esponjas por 2 horas em água destilada.
      3. Deixe as esponjas secarem por algumas horas na capa de cultura de células.
      4. Ferva os filtros por 20 min.
      5. Deixe os filtros secarem por algumas horas na coifa de cultura de células.
   2. Prepare o meio DMEM complementado com 10% de soro fetal bovino, HEPES 10 mM, 1x solução de aminoácidos não essenciais MEM, 2-mercaptoetanol 50 mM, penicilina 100 U/ml, estreptomicina 100 mg/ml e L-glutamina 2 mM.
   3. Adicionar 2 ml de meio numa placa de Petri de 50 mm.
   4. Disponha uma esponja no fundo da placa de Petri. Molhe os dois lados da esponja submergindo-os no meio.
   5. Coloque um filtro em cima da esponja. O filtro é posicionado na interface líquido-ar.
2. Sob o microscópio de dissecação, reassocie cuidadosamente um recém-nascido
3. Coloque a quimera da almofada de gordura LN em cima do filtro.
4. Transfira a placa de Petri em uma caixa de plástico retangular com alguns orifícios na tampa e contendo água no fundo para garantir a umidade.
5. Feche a tampa da caixa com fita adesiva. Deixe os dois orifícios da tampa abertos.
6. Transfira a caixa para uma incubadora de cultura de células a 37 °C com 5% de CO₂. Deixe a caixa se equilibrar por 2 horas, antes de selar os orifícios da tampa com fita adesiva.
7. Incube os tecidos por pelo menos 2 dias para permitir que o LN se fixe à almofada de gordura e seja transferível sob a cápsula renal.

4. Transferência da quimera da almofada de gordura LN sob a cápsula renal de camundongos hospedeiros

1. Colete as quimeras da almofada de gordura LN do filtro e transfira-as para baixo da cápsula renal dos camundongos hospedeiros. O método de transferência da cápsula renal já foi descrito ¹⁶.

5. Isolamento dos LNs transferidos

1. Após 3-4 semanas sob a cápsula renal, as quimeras das almofadas de gordura LN estão prontas para serem colhidas. Eutanasiar os camundongos hospedeiros usando orientações aprovadas.
2. Remova o rim dos camundongos hospedeiros.
3. Sob o microscópio de dissecação, isole a quimera da almofada de gordura LN e disseque a NL.

6. Digestão enzimática dos LNs transferidos para análise por citometria de fluxo

1. Faça uma incisão no LN com uma pequena tesoura para permitir que as enzimas penetrem no órgão e facilitem a digestão.
2. Coloque um LN em 1,5 ml de Eppendorf contendo 600 μl de tampão de digestão (RPMI 1% FCS, 2,5 mg / ml de colagenase D, 100 μg / ml de DNase I).
3. Incubar durante 30 min a 37 °C num bloco térmico agitador. Pipete para cima e para baixo para ajudar na dissociação dos tecidos a cada 10 minutos.
4. Adicione 6 μl de EDTA 0,5 M ao tubo e pipete para cima e para baixo para terminar a dissociação dos tecidos.
5. Centrifugue por 5 min a 490 x g.
6. Ressuspenda o pellet celular na solução de coloração (PBS, BSA 0,1%, soro de rato a 5% e soro de camundongo a 5%) contendo a combinação de anticorpos primários.
7. Incube por 30 min no gelo.
8. Lave duas vezes em PBS
9. Incube com anticorpos secundários por 20 minutos, se necessário.
10. Lave 2x em PBS.
11. Analisar com citómetro de fluxo.

7. Análise dos LNs transferidos por imunofluorescência

1. Fixação para conservação do EYFP durante o processo de congelamento e criossecção: Coloque o LN em uma solução de PBS, 4% de PFA e 10% de sacarose e deixe por 3-4 horas.
2. Coloque uma única gota pequena de composto OCT frio em um pequeno pedaço de papel alumínio. Evite bolhas de ar. Coloque cuidadosamente o LN sem nenhum líquido no meio da gota.
3. Congele o órgão colocando a folha de alumínio em gelo seco.
4. Corte seções de 8 a 10 μm em lâminas de vidro adesivas extras usando um criostato. Deixe as lâminas secarem por 2 horas antes de armazená-las a -20 °C.
5. Os procedimentos de coloração podem variar de acordo com os anticorpos primários usados e podem ser otimizados a partir do protocolo a seguir. Manchar as secções com solução de coloração (PBS, 1% BSA) contendo a combinação de anticorpos primários.
6. Incube por 1 hora em temperatura ambiente em uma câmara umidificada.
7. Lave duas vezes em PBS por 5 min
8. Incubar com anticorpos secundários durante 1 hora.
9. Lave duas vezes em PBS por 5 min.
10. Monte as lâminas em uma mídia de montagem contendo DAPI.
11. Capture imagens usando um microscópio de fluorescência ou confocal.

Results

Três semanas após o transplante, a quimera LN/fat pad é recuperada do rim. A quimera agora é muito semelhante a um NL normal em sua própria almofada de gordura, e o LN é visível no centro do tecido adiposo (Figura 1). Se o LN não puder ser identificado, é possível que tenha sido perdido durante o transplante no rim. Ao avaliar o papel de genes potencialmente importantes no desenvolvimento de LNs, os LNs recuperados podem permanecer muito pequenos e mais difíceis de encontrar. Este é o caso quando o tecid...

Discussion

Neste artigo apresentamos um método para testar e quantificar a contribuição das células progenitoras do tecido adiposo para o desenvolvimento de LNs e duas técnicas que permitem a análise de sua progênie. Dissecção de almofadas de gordura embrionárias e recém-nascidos Os LNs são delicados e requerem habilidades manuais adquiridas por muita prática antes da geração da quimera real da almofada de gordura LN. Para controlar a qualidade das dissecções, a análise por citometria de fluxo pode ser realizada nas bolsas de gordu...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoetanol	Sigma	M3148
50 mm Placa de Petri Esterilizada	Appleton Woods	SC265
90 mm Placa de Petri Esterilina	Appleton Woods	SC260
Lâminas adesivas	Surgipath	00202
Anti-mouse CD31 eFluor 450 eBioscience		48-0311
Anti-mouse CD4 Alexa 647	eBioscience	51-0041
Anti-mouse CD45 PerCP-Cy5.5	eBioscience	45-0451
Anti-mouse IgM Rodamina Vermelha	Stratech	715-296-020-JIR
Anti-mouse Podoplanina PE / Cy7	Biolegend	127411
Podoplanina Anti-rato purificada	eBioscience	14-5381
Colagenase D	Roche
DMEM Medium	Sigma	D5671
DNase I	Sigma	DN25-1G
Dumont #5 Fórceps Inox Biologie	FST	11252-20	Pinça extra fina para dissecções embrionárias e neonatais
Solução EDTA 0,5 M	Sigma	E7889
ERTR-7	Biogênese
Soro fetal bovino	Sigma	F9665
Tesoura de íris fina endurecida reta 11 cm	FST	14090-11	Tesoura pequena para dissecção
Solução HEPES	Sigma	H0887
0,8 μ m ATTP	Millipore	ATTPO 1300
Solução de L-Glutamina	Sigma	G7513
MEM Solução de Aminoácidos Não Essenciais (100x)	Sigma	M7145
O.C.T. Compound	Tissue-Tek	4583
Penicilina-Estreptomicina	Sigma	P4458
Caixa de plástico com tampa	Watkins e Doncaster	E6052	Caixa de sanduíche para cultura de órgãos in vitro. Faça dois furos na tampa para permitir a troca gasosa na incubadora CO2.
RPMI 1640 Medium	Sigma	R0883
Esponjas Vulkan Underwrap	Patterson Medical	004383
Stereomicroscope	Leica	LEICA MZ95	Microscópio de dissecação com zoom
Thermomixer	Eppendorf	5436
Vectashield Meio de montagem com DAPI	Vector Laboratories	H-1200