Geração de Quimeras de Almofada de Gordura de Linfonodo para o Estudo da Origem das Células Estromais de Linfonodos

Resumo

A geração de quimeras de linfonodos/fat pad para o estudo da origem das células estromais dos linfonodos é descrita. O método envolve o isolamento de linfonodos de camundongos recém-nascidos e bolsas de gordura embrionárias, a geração de bolsas de gordura quiméricas para linfonodos e sua transferência sob a cápsula renal de um camundongo hospedeiro.

Resumo

O estroma é um componente-chave da estrutura e função dos linfonodos. No entanto, pouco se sabe sobre sua origem, composição celular exata e os mecanismos que regem sua formação. Os linfonodos estão sempre encapsulados no tecido adiposo e recentemente demonstramos a importância dessa relação para a formação do estroma linfonodal. As células precursoras de adipócitos migram para o linfonodo durante seu desenvolvimento e, após o envolvimento do receptor de linfotoxina-b, desligam a adipogênese e se diferenciam em células estromais linfóides (Bénézech et al.¹⁴). Com base no potencial do estroma linfóide do tecido adiposo, apresentamos um método usando uma quimera de linfonodo/almofada de gordura que permite o rastreamento da linhagem de precursores de células estromais de linfonodos. Mostramos como isolar os gânglios linfáticos do recém-nascido e o tecido adiposo embrionário EYFP⁺ e fazer uma quimera de almofada de gordura LN/EYFP⁺. Após a transferência sob a cápsula renal de um camundongo hospedeiro, o linfonodo incorpora células precursoras locais do tecido adiposo e termina sua formação. A análise da progênie de células do coxim adiposo EYFP⁺ nos linfonodos resultantes pode ser realizada por análise por citometria de fluxo de linfonodos digeridos enzimaticamente ou por análise de imunofluorescência de criossecções de linfonodos. Ao usar almofadas de gordura de diferentes modelos de camundongos knockout, este método fornecerá uma maneira eficiente de analisar a origem das diferentes populações de células estromais de linfonodos.

Introdução

Os linfonodos (LNs) são órgãos-chave do sistema imunológico situados em locais estratégicos do corpo, ao longo da rede de vasculatura linfática. Eles permitem a filtração de antígenos e patógenos e fornecem um local para apresentação de antígenos aos linfócitos e indução de respostas imunes adaptativas. O estroma, que forma a estrutura básica do LN e orquestra o movimento dos diferentes participantes hematopoiéticos da resposta imune adaptativa, é central para a função desses órgãos. Diferentes populações de células estromais fornecem pistas essenciais e específicas para os movimentos, localização, sobrevivência, proliferação e maturação do componente hematopoiético d....

Protocolo

Os camundongos foram criados e mantidos em condições de FPS na Unidade de Serviços Biomédicos da Universidade de Birmingham, de acordo com os regulamentos do Ministério do Interior do Reino Unido e do comitê de ética local. Todos os procedimentos descritos neste protocolo são cobertos por uma Licença de Projeto aprovada pelo comitê de ética local e pelo Ministério do Interior.

1. Isolamento de LNs recém-nascidos

1. Sacrifique os camundongos recém-nascidos por luxação cervical.
2. Corte a cabeça e abra o corpo com uma tesoura do topo da região torácica até a parte inferior da região abdominal e remova cuidadosamente todas as ....

Resultados

Três semanas após o transplante, a quimera de GL/gordura é recuperada do rim. A quimera agora é muito semelhante a um GL normal em seu próprio tecido adiposo, e o GL é visível no centro do tecido adiposo (Figura 1). Se o GL não puder ser identificado, é possível que tenha sido perdido durante o transplante no rim. Ao avaliar o papel de genes potencialmente importantes no desenvolvimento do GL, os GLs recuperados podem permanecer muito pequenos e mais difíceis de encontrar. Esse é o caso quando o tecido a.......

Discussão

Neste artigo apresentamos um método para testar e quantificar a contribuição das células progenitoras do tecido adiposo para o desenvolvimento de LNs e duas técnicas que permitem a análise de sua progênie. Dissecção de almofadas de gordura embrionárias e recém-nascidos Os LNs são delicados e requerem habilidades manuais adquiridas por muita prática antes da geração da quimera real da almofada de gordura LN. Para controlar a qualidade das dissecções, a análise por citometria de fluxo pode ser realizada nas bolsas de gordu.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
2-Mercaptoetanol	Sigma	M3148
50 mm Placa de Petri Esterilizada	Appleton Woods	SC265
90 mm Placa de Petri Esterilina	Appleton Woods	SC260
Lâminas adesivas	Surgipath	00202
Anti-mouse CD31 eFluor 450 eBioscience		48-0311
Anti-mouse CD4 Alexa 647	eBioscience	51-0041
Anti-mouse CD45 PerCP-Cy5.5	eBioscience	45-0451
Anti-mouse IgM Rodamina Vermelha	Stratech	715-296-020-JIR
Anti-mouse Podoplanina PE / Cy7	Biolegend	127411
Podoplanina Anti-rato purificada	eBioscience	14-5381
Colagenase D	Roche
DMEM Medium	Sigma	D5671
DNase I	Sigma	DN25-1G
Dumont #5 Fórceps Inox Biologie	FST	11252-20	Pinça extra fina para dissecções embrionárias e neonatais
Solução EDTA 0,5 M	Sigma	E7889
ERTR-7	Biogênese
Soro fetal bovino	Sigma	F9665
Tesoura de íris fina endurecida reta 11 cm	FST	14090-11	Tesoura pequena para dissecção
Solução HEPES	Sigma	H0887
0,8 μ m ATTP	Millipore	ATTPO 1300
Solução de L-Glutamina	Sigma	G7513
MEM Solução de Aminoácidos Não Essenciais (100x)	Sigma	M7145
O.C.T. Compound	Tissue-Tek	4583
Penicilina-Estreptomicina	Sigma	P4458
Caixa de plástico com tampa	Watkins e Doncaster	E6052	Caixa de sanduíche para cultura de órgãos in vitro. Faça dois furos na tampa para permitir a troca gasosa na incubadora CO2.
RPMI 1640 Medium	Sigma	R0883
Esponjas Vulkan Underwrap	Patterson Medical	004383
Stereomicroscope	Leica	LEICA MZ95	Microscópio de dissecação com zoom
Thermomixer	Eppendorf	5436
Vectashield Meio de montagem com DAPI	Vector Laboratories	H-1200

11088858001 Filtros de membrana de isóporos