Um método inovador para exossomo Quantificação e Size Measurement

A função exata de exossomos circulam permaneceu desconhecido por um longo período de tempo. Mesmo se agora o mecanismo de caminho completo de exossomas não é totalmente compreendido. Desde exossomas transportar antigénios, proteínas e ARN (ARNm e miARN) que lhes diz respeito a sua célula de origem parental, a sua função como transmissores de sinalização célula-célula, principalmente, foi dada prioridade.

Muitos métodos diferentes têm sido descritas na literatura para o isolamento e detecção quantitativa de exossomas ^1,2. No entanto, não há consenso sobre um "padrão ouro" foi atingido. Enquanto isso, a maioria dos cientistas que operam no domínio da investigação exosome concordam que um método consistente de isolamento é altamente garantido para alcançar um maior grau de comparabilidade entre os diferentes relatórios e estudos.

Fluorescência ativado separação de células (FACS) é a ferramenta mais comum e prevalente para análise exosome ^3. FACS tem o benciar que, através de marcação por fluorescência, as células de diferentes origens pode ser comparado, em um passo. As principais desvantagens da FACS são de que este método não é sensível o suficiente para identificar as partículas menores que 0,5 mm ^4, enquanto que exossomos são geralmente entre 30-120 nm de diâmetro ^5, ainda menos para medir o seu tamanho.

Microscopia eletrônica de varredura (MEV) e microscopia eletrônica de transmissão (TEM) são outras ferramentas para a análise do tamanho das partículas e morfologia de exossomos. No entanto, tanto SEM e TEM tem a desvantagem de que a preparação de amostras é, ambos os métodos envolvem passos de trabalho intensivo, consumidores de tempo e cada um tem um certo risco de geração artefato. Nenhum método é apropriado para elevado débito de amostras e caracterização de vários milhares de partículas individuais de uma amostra. Além disso, uma análise quantitativa para a rotina clínica diária, onde as amostras têm muitas vezes de ser analisadas simultaneamente, ou pelo menos em um período muito curto édifícil de executar. Novas técnicas de geração de agora nos permitem analisar exosomes sem intenso trabalho preparatório antes (SEM por exemplo, ambiental). Estas técnicas modernas ainda são bastante inconveniente para análise de grandes volumes contendo suspensões exosomes para determinar o seu número médio e distribuição de tamanho ^6.

Outro método altamente sensível para a visualização e análise de exossomos é de rastreamento de nanopartículas análise (NTA). Este método leva vantagem de dois princípios diferentes da física. Em primeiro lugar, as partículas são detectados pela luz dispersa quando são irradiados com um feixe de laser. O segundo fenómeno é conhecido como movimento Browniano, segundo a qual a difusão de partículas diferentes em uma suspensão líquida é inversamente proporcional ao seu tamanho. Neste último caso, o movimento também depende da temperatura e da viscosidade do líquido. No entanto, esta taxa está diretamente relacionada ao tamanho das partículas e é usado por NTA. Usando suaveanálise baseada-ware, imagens digitais de luz difusa de partículas individuais são gravadas. A parcela de manchas de luz difusa e a sua velocidade de movimento fornecer os dados que facilitar a determinação da contagem total de partículas e distribuição de tamanho. Esta técnica é particularmente poderosa para a análise de partículas com um diâmetro médio de menos de 100 nm.

As medidas de tamanho e concentração são realizadas com o ZetaView browniano e Microscópio Análise Eletroforese de vídeo de animação. Este é um desk top nanopartícula instrumento de análise semi-automatizado para amostras líquidas (doravante referida como o instrumento de rastreamento de partículas). Consiste no analisador de partículas de rastreamento, bem como um computador portátil com o software utilizado para a análise de dados. Amostras biológicas heterogéneos são tão adequados para este método como suspensões mais homogéneos de partículas inorgânicas. Um microscópio de dispersão a laser com uma câmara de vídeo é usado para a detecção de partículas e para a OBSErvação de seu movimento. Enquanto o eixo horizontal e microscópio é focada dentro do canal celular preenchido com uma suspensão contendo exossomas, o feixe de laser é orientado verticalmente. As partículas irradiadas pela dispersão de laser a luz, que é contabilizada em 90 ° por uma câmera de vídeo digital através do microscópio (Figura 1). A intensidade da luz dispersa permite a observação de partículas superiores a 60 nm de diâmetro. Numa tal configuração do brilho de uma partícula não é a única indicação de tamanho de partícula. Quando nenhum campo elétrico é aplicado, o movimento de partículas só segue o movimento browniano e pode servir como um indicador para o cálculo do tamanho das partículas. No entanto, o instrumento também é capaz de aplicar um campo eléctrico através do canal celular. Quando submetido a este campo, o potencial, polaridade e nível de carga iônicos dos exossomos suspensas se tornarem outros determinantes da direção de seu movimento. Velocidade e direção resultado em um mo eletroforéticahistograma dade.

Enquanto encontrar um método ideal para analisar exossomas isoladas é um problema, um outro está no isolamento eficaz de exossomas a partir de diferentes meios, tais como sangue, ascites, urina, leite, fluido amniótico ou meio celular. Diferentes métodos têm sido descrita até agora, que são baseados em ultracentrifugação ^1, reagentes de separação industriais (como Exoquick ^7), esferas magnéticas para antigénio empregando separação ⁸ ou ⁹ passos de ultrafiltração.

Neste protocolo, demonstrar todo o processo de isolamento exosome via ultracentrifugação e mostrar como analisar a exosome resultante contendo suspensão através de um instrumento de rastreamento de partículas. As considerações específicas para a análise de médias no plasma ou cultura de células humanas exossomas derivados são fornecidos.

NOTA: Os experimentos apresentados neste trabalho foram aprovados pelo conselho de ética da instituição, da Universidade de Dusseldorf.

1. Preparação exossomo

1. Coletar sangue total em 3 tubos de citrato via punção venosa (total de 9 ml). Despeje o sangue para um tubo Falcon de 15 ml.
2. Centrifuga-se a amostra a 1500 xg durante 20 min a 4 ° C para iniciar a separação das células do plasma. Transferir o sobrenadante para um novo tubo de 15 ml Falcon.
3. Centrifuga-se a amostra a 2800 xg durante 20 min a 4 ° C para remover todas as células do plasma (plasma isento de células; PCP). Transfira o PCP a tubos de ultracentrifugação, 1 ml por tubo.
4. Centrifugar a 100.000 xg durante 90 min a 4 ° C para esgotar exossomas. Retirar 900 ul de sobrenadante. Re-suspender o pellet nos restantes 100 l no tubo de ultracentrifugação. Adicionar 900 ul de PBS.
5. Centrifugar novamente a 100.000 xg durante 30 min a 4 ° C. Retirar 900 ul de supernatant. Re-suspender o pellet com as restantes 100 l.
6. Transferência de 5 a 20 ul de re-suspensão em 40 ml de água destilada. Filtra-se a suspensão através de um filtro de 450 nm para separar exossomas a partir de partículas maiores. Utilize este suspensão final para a medição de partículas.

2. Processo de inicialização do instrumento de rastreamento de partículas

1. Inicie o programa clicando duas vezes sobre o ícone-software. Clique nas diversas guias de software ("exame de celular", "Medição", "Análise") para alternar entre eles ao longo do protocolo.
2. Siga as instruções na tela para uma implementação automatizada do processo de inicialização. Marque as caixas de verificação de qualidade, tanto para celular e alinhamento automático.
   NOTA: Qualquer um desses passos podem ser repetidos em separado, se necessário, pressionando o botão (A) ou (B) na guia "de seleção de células".
3. Abra a porta de entrada e de saída do instrumento de NTA e injectar 10 ml de água destilada através de uma seringa para dentro do canal de células através da abertura de entrada. Fechar o orifício de saída como a última quantidade de água está a ser injectado. Coloque um copo sob a porta de saída para recolher a solução para o lixo. Assegure-se que a célula de medição é livre de bolhas de ar e não seringa bolhas de ar no sistema. Fechar a porta de entrada imediatamente.
4. Realize a verificação da qualidade célula clicando em "OK". O software irá exibir os resultados de qualidade de células depois de alguns segundos.
5. Se todas as partículas ainda são visualizados na tela de visualização ao vivo do software ou se o resultado da verificação de qualidade só é bom ou ruim, repita o passo 2.3 até que as partículas restantes são removidos da célula de medição. Também repita o passo 2.3 após cada medição para evitar acúmulo de partículas. Se repetir a injeção de água destilada e de seleção de células não produz um "bom" resultado, avance para 2.9.
6. Preparar uma suspensão de controlo contendo uniforme 200 nm pol sizedystyrene partículas a ser usada para alinhar os focos de laser e o microscópio. Adicionar uma gota de concentrado em suspensão, fornecida pelo fabricante do instrumento, a 500 ml de água destilada para se obter a concentração necessária de tal modo que 600 ± 100 partículas por tela são exibidas na exibição ao vivo.
7. Injectar a suspensão de alinhamento no instrumento NTA, tal como descrito na etapa 2.3. Pressione "OK" para iniciar o alinhamento automático, uma rotina automatizada através do qual o sistema irá automaticamente encontrar a posição ideal dos dois focos.
8. Quando aparece uma solicitação indicando o sistema está pronto para os experimentos, clique em OK para iniciar a medição.
9. Ocasionalmente, limpar o canal célula manualmente entre experiências lavando a célula com uma solução a 30% de etanol. Limpe o canal sempre que o software exibe um relatório de erros automática.

3. Medição da Amostra

1. Lave o canal com água destilada antes do bismedição da amostra ch (como descrito no passo 2.3).
2. Injectar a suspensão exossoma (preparada na secção 1) para o canal, tal como descrito na etapa 2.3.
3. Ajuste os seguintes parâmetros principais do software, conforme necessário:
   1. Sensibilidade. A fim de encontrar a faixa de sensibilidade ideal, clique no botão "número de partículas versus sensibilidade" para exibir uma curva para partículas medidas por tela para diferentes níveis de sensibilidade. Escolheram um nível de sensibilidade antes do declive máximo da curva. Um nível de sensibilidade mais elevada permite a visualização de mais partículas pequenas, mas também aumenta as questões relacionadas com o ruído de fundo.
   2. Brilho mínimo. Escolheu um brilho inicial de 20 para medição exosome para utilizar esta função como um filtro. Regule este parâmetro até em branco se fortemente partículas de dispersão da luz. Regule-o para baixo para amplificar fracamente espalhando artefatos. Varie o brilho conforme necessário durante todo o experimento.
      NOTA: As partículas que luz-Scatter muito fortemente se sobrepõem e podem ser excluídos da análise por engano.
   3. Min e Max Size. Definir um filtro digital para eliminar o ruído de pixel e dispersão indesejada de partículas de grandes dimensões regulando o tamanho mínimo e máximo. Utilize uma gama de 10 a 500 pixels para a medição de exossomas.
   4. Shutter. Ajustar o período de tempo em que a câmara é aberta para 1/300 seg.
4. Viva parâmetros lidos:
   1. Alternar entre uma câmera digital e uma vista modus análogo a qualquer momento clicando no botão "Viva-imagem".
   2. Durante todo o experimento, monitorar a barra de intensidade de espalhamento, que apresenta o estado de saturação da amostra, tal como um indicador de cor codificada. Não analise exossomos se a barra de espalhamento é vermelho. Em tal caso, diluir a amostra para evitar este fenómeno. Se a condição experimental proíbe a manipulação da suspensão da amostra, para baixo-regular a sensibilidade ou up-regular o brilho no software-sCONFIGURAÇÃES ​​para melhorar os resultados da medição.
      NOTA: Quando se analisam as amostras com uma concentração extremamente elevada de partículas a dispersão se fundirão partículas individuais e eles são contadas como uma única partícula.
   3. Observe que o número de partículas contadas no campo de visão do visor.
5. Clique na aba "Medição".
6. Escolha as configurações na matriz "opções de execução".
   1. Antes de cada aquisição, selecione "movimento de seleção 'para uma verificação repetida teste de partícula drift. Realizar o teste pelo menos uma vez antes de começar toda a análise. Se o desvio for maior do que 20 mm / seg, esperar antes de continuar a medição de modo a que a amostra pára de fluir.
   2. Escolher o número de experiências (5) e o atraso de tempo entre eles (0).
   3. Realize um "cheque sample ', se necessário. Este teste é parte do alinhamento automático no procedimento de inicialização e pode ser repetido mais tarde, conforme necessário.
   4. Por fim, clique no botão "aquisição de vídeo executar". Na nova janela, definir o número de ciclos (15) e o número de posições de medição (11).
      NOTA: A cabeça de laser e o microscópio pode ser movido para analisar o número de partículas em 11 posições diferentes. Dependendo da procura experimental, decidir se a experiência deve ser realizada numa única posição ou em posições diferentes.
      1. Confirme o tempo de duração mínima de uma partícula tem que ser controlado para ser contada como uma partícula individual, definindo a resolução de vídeo (baixo). A diminuição dos resultados de resolução em um período mais curto de seguimento.
      2. Escolha um nome de arquivo e clique em "OK" para iniciar a medição.

   4. Interpretação dos Resultados

   1. Ver os seguintes resultados e parâmetros exibidos após a medição na aba "resultados": (1) o número total de partículas traçadas, (2) número médio de parteicles por posição, e (3) a concentração de partículas.
      1. Ver tabela média do resultado para a relação numérica de tamanho de partícula (diâmetro, superfície e volume) a percentagem do número de partículas, assim como os valores de média e diferenciação padrão.
      2. Use a tabela de análise de pico se mais de um pico existe na análise gráfica. Esta tabela mostra a distribuição de partículas que são menores do que o primeiro ou respectivamente segundo pico.
   2. Veja o gráfico calculado após a medição para ver uma distribuição de partículas por tamanho. Use os ícones no modo de exibição e acima do gráfico para alterar as configurações.

As amostras utilizadas para esta demonstração mostra uma configuração óptima para a medição com uma sensibilidade de 85%, antes do declive máximo da curva de sensibilidade (Figura 2). O brilho, o min / max valores foram escolhidos como recomendado no protocolo. Uma concentração de 5,3 partículas / ml x 10 6 foi medido, enquanto que o tamanho médio das partículas foi de 0,149 um, a maioria deles eram de 0,137 mm.

Os valores recebidos após a medição podem ser salvos em um relatório com um formato de arquivo .pdf ou como .txt para exportar em um banco de dados. O gráfico pode ser ajustado como preferidos, tal como descrito no protocolo (secção 4). A sequência de vídeo é guardado e também pode ser utilizado mais tarde para fora da linha de re-análise. No entanto, em tal análise off-line, as configurações pré-aquisição da câmara não podem ser alterados de forma retrospectiva.

A fim de encontrar as configurações dos parâmetros ideais para a medição, nós aqui descrever the otimização das configurações do instrumento sobre o exemplo de um 100 nm tamanho padrão de poliestireno. A influência de dois parâmetros, sensibilidade e min / tamanho máximo em distribuição de imagens de vídeo e tamanho de partícula é discutido em detalhe. Todos os outros parâmetros são resumidos na Tabela 1.

A impressão visual do impacto de sensibilidade (variando de 50 a 94) em imagens analógicas e digitais é visualizado na Figura 3. A informação quantitativa derivada a partir das imagens é apresentado na Figura 4, com base nas configurações da Tabela 1, Min = Tamanho 5 e Tamanho máximo = 200. Uma relação típica de o número das partículas detectadas vs. sensibilidade é mostrado na Figura 4A. Entre 50 e 90, o número de partículas detectadas com sensibilidade aumentada e aumentou dramaticamente para sensibilidades> 90. Encontrou-se uma faixa ideal de sensibilidade entre 66 e 86 (A). Distribuições de tamanho de partícula obtida com difajustes de sensibilidade rentes são apresentados na Figura 4B. As distribuições de tamanho de partícula representam a média de três medições individuais. Por muito baixa sensibilidade (sensibilidade = 62, curva vermelha) só foram analisadas algumas partículas resultando em estatísticas bastante pobres. O número de partículas com sensibilidade analisados ​​aumentou e alcançou um valor óptimo entre 70 (curva de amarelo) e 86 (curva tan). Aumentando ainda mais o chumbo sensibilidade a uma deterioração da distribuição de tamanho de partículas, com o número de partículas que deixam cair e distribuição de tamanho mudando para tamanhos menores (sensibilidade = 94, curva azul). A figura 4C mostra a tendência de o diâmetro x50 baseada no número (50% de partículas são menores do que este diâmetro) como uma função de sensibilidade. No intervalo bege, o RSD de tamanho de partícula foi inferior a 8% e corresponde ao intervalo óptimo em A. As regiões vermelhas indicam RSD> 8%, como resultado de estatísticas pobres (sensibilidade muito baixa) ou ampla distribuições com mudança para tamanhos menores (sensibilidade muito alta).

As configurações do Min Size e Max Size são os filtros aplicados a imagens digitais, a fim de remover as partículas com tamanhos de ponto inferior a Min Tamanho e maiores do que Max Size. Devido à capacidade de dispersão de luz, uma partícula cria um local de um determinado tamanho de uma imagem digital. O tamanho da mancha é medido como um número de pixels (px). Quando uma partícula dispersa a luz muito bem (por exemplo, partículas de> 200 nm ou agregados), o tamanho do local é bastante grande, por exemplo,> 500 px. O tamanho do ponto é muito pequena (por exemplo, <10 px) de pequenas partículas (por exemplo, <20 nm), dependendo do material de partículas. Tamanho de ponto (px) não podem ser trocadas com tamanho de partícula (nm), como eles não são idênticos e não existe uma relação direta entre essas duas variáveis. Uma otimização de Min e Max Tamanho permite ao usuário filtrar os objetos indesejados tais como aglomerados (Max Tamanho) ou pequenaobjetos, como ruído de fundo (Min tamanho). A influência de Min / Max tamanho da distribuição do tamanho das partículas de um tamanho padrão de 100 nm é mostrado na Figura 4D (sensibilidade = 82). Quando o intervalo é definido como pequenos tamanhos de ponto (por exemplo, min = 1, max = 52; curva de laranja), o número de partículas é reduzido e analisados ​​o diâmetro x50 baseado número é ligeiramente deslocado para tamanhos menores. A definição para manchas maiores (min = 40, max = 1.000; curva vermelha) resulta em uma ampla distribuição de tamanho de partículas deslocado para tamanhos maiores. A fim de se obter o número total de partículas iguais, os limites do intervalo de distribuições tanto laranja e vermelho foram ajustados para coincidir com 80 partículas. A distribuição com configurações mais eficientes (min = 5, max = 200; tan curva) consiste em 360 partículas.

Uma série de experiências foram realizadas com sucesso exossomas isoladas por ultracentrifugação e medidos por NTA utilizando o sistema apresentado. Os dados resultantes eram altamenteconsistente e confirmou um nível elevado de reprodutibilidade. Outros métodos de isolamento deve mostram resultados semelhantes. No entanto, o passo de diluição foi identificado como um passo particularmente crítico e o seu impacto sobre os números totais calculados de partículas tem de voltar a ser avaliadas.

Figura 1. Esquema da instalação do NTA. A / eixo vídeo microscópio e feixe de laser são orientadas perpendicularmente um ao outro, cruzando a seção transversal do canal celular. Luz espalhada pelas partículas é exibido no "live-view" janela do software. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3. Impacto da sensibilidade em analógico e digital de imagens. A visualização de partículas na tela de visualização ao vivo é exibido para sensibilidades entre 50 e 94, tanto para analógico (linha superior) umd digitais vistas (linha inferior). Quando a sensibilidade é muito baixo, apenas umas poucas partículas são detectados (esquerda). Em ótima sensibilidade as partículas aparecem como pontos de solteiro bem isolados uns dos outros (no meio). Em um comparativamente altas partículas sensibilidade fundem levando a má qualidade de imagem (à direita). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4. Influência da sensibilidade min e as configurações de tamanho máximo para uma amostra de controlo de 100 nm de poliestireno de partículas (A) Lote de sensibilidade versus o número detectado de partículas.; o intervalo óptimo é 66-86, antes do declive máximo da curva. Distribuições (B) de tamanho de partícula obtido com várias configurações de sensibilidade (62-94); gráficos para muito baixo (62) ou muito alta (94) de sensibilidade não captam a distribuição de tamanho de partícula de 100 nm para a amostra de controlo de poliestireno. (C) Número baseado diâmetro x50 contra sensibilidade; o erro de 50x no intervalo bege é inferior a 8%, intervalo ideal é de 66 a 86. (D) Impacto de Min e Max tamanho da distribuição do tamanho de partícula; parâmetros ótimos (min = 5 e max = 200) capturar a distribuição correta para a amostra de controlo. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1. Resumo dos parâmetros pré e pós-aquisição para definição do instrumento de rastreamento de partículas.

Este trabalho foi apoiado pelos fundos institucionais do Departamento de Cirurgia Cardiovascular, Faculdade de Medicina, HHU. Os custos de publicação deste estudo foram fornecidos pela Particle MetrixGmbH.