As glândulas vegetais são estruturas especializadas responsáveis pela biossíntese e secreção de muitos compostos envolvidos nas interações com o ambiente biótico. Para possibilitar estudos sobre suas características moleculares e bioquímicas, uma técnica de micropreparação mecânica foi estabelecida para isolar glândulas metabolicamente ativas únicas, aqui da planta carnívora Nepenthes.
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Artigo de método
Isolamento de Viável multicelular Glândulas de tecido da planta carnívora, Nepenthes
Neste artigo
Resumo
Resumo
Muitas plantas possuem estruturas especializadas que estão envolvidas na produção e secreção de compostos e proteínas específicos de baixo peso molecular. Essas estruturas estão quase sempre localizadas nas superfícies das plantas. Entre eles estão nectários ou tricomas glandulares. Os compostos secretados são frequentemente empregados em interações com o ambiente biótico, por exemplo, como atrativos para polinizadores ou dissuasores contra herbívoros.
Glândulas únicas em vários aspectos podem ser encontradas em plantas carnívoras. Nas chamadas plantas carnívoras do gênero Nepenthes, as glândulas bifuncionais dentro da armadilha de queda, por um lado, secretam o fluido digestivo, incluindo todas as enzimas necessárias para a digestão da presa e, por outro lado, absorvem os nutrientes liberados. Assim, essas glândulas representam um tecido ideal e especializado predestinado a estudar os mecanismos moleculares, bioquímicos e fisiológicos subjacentes à secreção de proteínas e absorção de nutrientes nas plantas. Além disso, geralmente a biossíntese de compostos secundários produzidos por muitas plantas equipadas com estruturas glandulares pode ser investigada diretamente nas glândulas.
Para trabalhar em tais estruturas especializadas, elas precisam ser isoladas de forma eficiente, rápida, metabolicamente ativa e sem contaminação com outros tecidos. Portanto, uma técnica de micropreparação mecânica foi desenvolvida e aplicada para estudos sobre o fluido de digestão de Nepenthes. Aqui, é apresentado um protocolo que foi usado para preparar com sucesso glândulas bifuncionais únicas a partir de armadilhas de Nepenthes, com base em uma plataforma de microamostragem mecanizada. As glândulas podem ser isoladas e usadas diretamente para análise de expressão gênica por técnicas de PCR após a preparação do RNA.
Introdução
As plantas produzem uma grande variedade de compostos com diferentes aplicações industriais e farmacêuticas, que vão desde moléculas de baixo peso molecular até polímeros. Tais compostos são frequentemente produzidos e secretados por estruturas altamente especializadas, muitas das quais estão localizadas na superfície das plantas, como tricomas glandulares ou nectários, ou internamente, como idioblastos ou ductos de látex e resina, respectivamente. No entanto, sabe-se relativamente pouco sobre a biologia dessas estruturas secretoras especializadas, embora todos os tipos dessas glândulas apresentem muitas características indicativas de metabolismo ativo. Em particular, as glândulas de plantas carnívoras, como Nepenthes, podem ser consideradas sistemas modelo em biologia celular vegetal1.
Plantas carnívoras são objeto de diversos estudos desde 1875, quando foi publicado 'As plantas insetívoras' de Charles Darwin2. No entanto, somente nos últimos anos foram realizados estudos em nível molecular, e ainda assim o nosso conhecimento é limitado. Por exemplo, a composição proteica do fluido digestivo nas plantas carnívoras do gênero Nepenthes ainda não é completamente conhecido. Apenas recentemente várias proteínas hidrolíticas foram identificadas, bem como alguns dos genes correspondentes3. Nas armadilhas de queda de Nepenthes (Figura 1), glândulas multicelulares estão localizadas na parte interna inferior das jarros. Essas glândulas produzem e secretam enzimas digestivas no fluido dos jarros, além de absorverem nutrientes dissolvidos desse fluido4. Assim, essas glândulas bifuncionais representam um microtecido único com posição e função centrais na carnivoridade de Nepenthes que vale a pena ser estudado em detalhes.
Figura 1. Jarra de Nepenthes alata. A parte inferior da jarra contém o fluido digestivo e as glândulas na superfície interna.
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Na ciência vegetal, muitas abordagens experimentais dependem de "material bruto", pois não se investiga um tecido definido, mas órgãos inteiros. Como consequência, sua homogeneização e análise só podem fornecer resultados diluídos e proporcionais em relação aos tecidos e células individuais5. Para resolver esse problema, foram desenvolvidas técnicas de micropreparação, como a chamada microdissecção a laser com captura (LCM), que têm sido usadas com sucesso para colher tecidos vegetais específicos e analisar seus conteúdos individuais6. No entanto, a LCM frequentemente apresenta limitações quando componentes celulares instáveis e/ou de rápida degradação são alvo, como o RNA. Nesse caso, a necessidade de fixação prévia do tecido, que é demorada e muitas vezes acompanhada por degradação das biomoléculas, representa uma desvantagem. Além disso, devido ao alto teor de água de muitos tecidos vegetais e à resistência das paredes celulares, a LCM frequentemente falha em preparar diretamente a partir de tecido fresco7. Qualquer abordagem para investigar componentes celulares presentes em glândulas secretoras, desde genes, mRNA e proteínas até compostos secundários e sua biossíntese, exige técnicas alternativas de preparação específica. Assim, são necessárias técnicas específicas para isolar células individuais ou até glândulas multicelulares que permaneçam intactas após a preparação.
Aqui é apresentado um método que utiliza uma plataforma automatizada de microamostragem com visualização microscópica direta. Essa técnica é rápida e eficiente no preparo de glândulas individuais provenientes das jarros de espécies de Nepenthes. Essas glândulas multicelulares são bifuncionais, ou seja., participam tanto na secreção quanto na absorção; são sésseis, e camadas celulares não expostas são impregnadas para formar um endoderma. Glândulas inteiras podem ser isoladas sem tecido adjacente e depositadas de maneira bem definida em um tubo de PCR. Esta técnica é aplicada para estudar genes específicos bem como a expressão gênica nos tecidos das glândulas.
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Protocolo
1. Preparação de material vegetal
- Todas as espécies de Nepenthes foram cultivadas nas estufas do IPM para Ecologia Química ou no Jardim Botânico de Jena, Alemanha.
- Para a preparação do tecido secretor, colha uma jarra e remova o terço superior, incluindo tampa, peristoma e zona escorregadia. O jarro pode ser usado fresco ou congelado em nitrogênio líquido e armazenado a -80 °C.
2. Microdissecção do tecido do jarro
- A plataforma de microamostragem consiste em um estereomicroscópio e um micromanipulador, que é conectado diretamente ao corpo do microscópio e é operado por um joystick 3D. Aqui, um protótipo inicial de aureka foi usado conforme documentado (Figura 2A).
- Para a dissecção das glândulas secretoras dos jarros de Nepenthes, use uma micropinça e anexe-a ao manipulador (Figuras 2A e 2B).
- Para extração de RNA, trate todos os instrumentos (lâminas de barbear, pinças, micromanipulador, microfórceps, lâmina de objeto) com RNaseZAP.
- Preparar os tubos de recolha adicionando 9 μl de água isenta de nuclease e 1 μl de inibidor de RNase num tubo de PCR para extracção de ARN. Para PCR direta de amostras de tecido, use apenas água livre de nuclease (10 μl).
- Pegue o jarro fresco ou congelado e remova um pedaço de tecido de 1-2 cm2 contendo as glândulas secretoras usando uma lâmina de barbear e uma pinça. Lave o lenço com água; adicione dietilpirocarbonato a 0,1% (DEPC) se o RNA for extraído.
- Fixe o material vegetal com fita adesiva dupla face em uma lâmina de objeto (a superfície coberta com glândula deve estar voltada para cima, Figuras 2C e 2D) e prenda a lâmina com fita adesiva em um palco universal, que deve ser aplicado com uma mesa móvel.
- Para a extração de ácidos nucléicos, a preparação deve ser feita em gelo. Portanto, pegue uma caixa plana de isopor, coloque o estágio universal contendo a amostra dentro e encha a caixa com gelo. Em seguida, coloque a caixa sob o microscópio.
- Para a preparação, o posicionamento das glândulas é muito importante. As glândulas secretoras são parcialmente cobertas por uma capa protetora (Figura 3) e acessíveis apenas pela pinça de um lado. Além disso, o ângulo da amostra em relação à pinça deve ser ajustado inclinando a mesa do estágio universal aproximadamente 135°, dependendo da espécie de Nepenthes.
- A microdissecção é feita sob controle visual. Para isolamento da glândula, use um filtro não UV para limitar a degradação do DNA e do RNA.
- Mova o micromanipulador e a pinça através do painel de controle para a glândula selecionada. Quando atingir a glândula, coloque cada braço da pinça em ambos os lados da glândula. Remova a glândula do tecido remanescente fechando a pinça (Figura 4A).
- Direcione a glândula presa à pinça para longe do objeto e para o tubo de coleta. Coloque as pontas da pinça em contato com a solução no tubo (Figura 4B). A liberação da glândula pela abertura da pinça deve ser bem observada, pois as glândulas tendem a grudar na ponta da ferramenta. O tecido pode ser armazenado a -80 °C até a extração por PCR ou RNA.
3. Amplificação direta de PCR do tecido de Nepenthes
- Para provar a eficiência do método de preparação, pode ser realizada uma abordagem de PCR diretamente do tecido da glândula sem uma etapa de extração de DNA.
- Para a amplificação por PCR, use primers específicos do gene; aqui codificando para a sequência de uma proteína semelhante à taumatina (TLP) (direto: 5'-CAATGAGCCAATTCATAAAATTCATTG-3', reverso: 5'-CAGTTATACTTTAAGGGCAAAACACAAC-3').
- Colete 1-5 glândulas em um tubo de PCR contendo 10 μl de água livre de nuclease. Para uma reação de 50 μl, adicione 5 μl de tampão Taq 10x, 1 μl de trifosfatos de desoxinucleosídeo 10 mM (dNTPs), 3 μl 25 mM MgCl2, 0,4 μl (1,25 U) Taq DNA polimerase, 1 μl (100 pmol) de cada primer e 28,6 μl de água livre de nuclease.
- Realize reações de PCR em um termociclador com o seguinte programa: desnaturação inicial de 94 °C por 3 min; 35 ciclos de desnaturação (94 °C por 30 segundos), recozimento (59 °C por 30 segundos) e extensão (72 °C por 1 min); e uma etapa final de extensão de 10 min a 72 °C.
- Prove a amplificação do produto de PCR usando eletroforese em gel de agarose. Portanto, use agarose a 1,5% (p / v) e dissolva-a em tampão 1x TAE (base Tris 40 mM, ácido acético glacial 20 mM, EDTA 1 mM, pH 8). Aqueça a solução no micro-ondas até que a agarose se dissolva. A 100 ml de solução de agarose, adicionar 1 μl de brometo de etídio (10 μg/μl) para visualização a jusante. Execute o gel em 1x tampão TAE a 300 V, 115 mA por aproximadamente 20 min em uma câmara de eletroforese. O tamanho correto do amplicon TLP deve ser de 690 pb.
4. Extração de RNA de pequenas amostras de tecido e transcrição reversa
- Execute as etapas a seguir no gelo. Para a extração do RNA foram utilizados dois métodos de extração, um Micro Kit para a extração do RNA total e um kit de isolamento de mRNA aplicado com esferas magnéticas.
- Coletar pelo menos 30 glândulas secretoras por micropreparação em um tubo de PCR contendo 1 μl de inibidor de RNase e 9 μl de água livre de nuclease. Em seguida, alise o tecido em um termociclador por 10 min a 75 ° C.
- Extração de RNA total.
- Após a preparação, adicionar 90 μl de solução de lise à amostra e incubar durante 10 min a 75 °C. Em seguida, carregar a mistura de reacção na coluna (fornecida com o kit) e proceder aos passos de lavagem descritos no manual do fabricante.
- Eluir o RNA duas vezes com 10 μl de solução de eluição, respectivamente, e continuar com o tratamento com DNase I.
- Para 20 μl de RNA extraído, adicione 2 μl de tampão 10x DNase I e 1 μl de DNase I (fornecido com kit de extração de RNA) e incube 1 hora a 37 ° C. Pare a reação adicionando 2 μl de reagente de inativação de DNase e incube por 2 min em temperatura ambiente. Após uma etapa de centrifugação por 1,5 min na velocidade máxima, o RNA pode ser transferido para um novo tubo livre de RNase. Determinar a concentração de ARN de cada amostra utilizando um espectrofotómetro. As amostras devem ser armazenadas a -80 °C.
- Extração de mRNA usando esferas magnéticas.
- Ajuste o volume da amostra para 100 μl com tampão de lise/ligação (fornecido no kit) e incube por 10 min a 75 °C. Adicione 20 μl de esferas magnéticas fornecidas com uma saliência de Oligo (dT)25 e misture a reação por 5 min à temperatura ambiente. O mRNA se liga pela cauda poli (A) à saliência Oligo (dT) 25 das contas.
- Execute as etapas de lavagem do mRNA ligado às esferas magnéticas seguindo o protocolo do fabricante. As soluções podem ser removidas usando um ímã. Ressuspenda os grânulos em 20 μl de tampão Tris-HCl 10 mM (pH 7,5).
- Remova as contaminações do DNA genômico tratando a amostra com 2U (1 μl) de DNase (2 μl de tampão 10x DNase e 17 μl de água livre de nuclease) por 1 hora a 37 ° C. Em seguida, a solução enzimática é removida pelo ímã e os grânulos são ressuspensos em 20 μl de tampão Tris-HCl 10 mM. Não é possível medir a concentração de RNA, pois ela está presa às contas. As amostras devem ser armazenadas a -80 °C.
- Para a transcrição reversa, use um kit de síntese de cDNA. As reações foram realizadas seguindo o protocolo do fabricante.
- Para a transcrição reversa do RNA total, adicione 1 μl (100 pmol) de oligo (dT) 20 primer ou 1 μl (0,4 μg) de hexâmeros aleatórios, 1 μl de inibidor de RNase e 1 μl 10 mM dNTP Misture a 1 μg de RNA e ajuste o volume para 14 μl com água livre de nuclease. Incubar a 65 °C durante 5 min e depois colocar as amostras no gelo. Adicione 1 μl de DTT 0,1M, 1 μl de transcriptase reversa e 4 μl de tampão RT 5x. As reações são incubadas por 55 min a 50 °C, seguidas por uma etapa de inativação a 70 °C por 10 min. Após a transcrição reversa, as amostras podem ser armazenadas a -20 °C.
- Para mRNA ligado a esferas magnéticas, substitua o tampão Tris-HCl pela primeira mistura de reação (1 μl de inibidor de RNase, 1 μl de 10 mM dNTP Mix e 12 μl de água livre de nuclease) e incube por 5 min a 65 ° C. Devido à saliência de Oligo (dT)25 das contas, não é necessário adicionar um primer Oligo (dT)20 ou Hexamers Aleatórios às amostras. Em seguida, siga o protocolo acima (passo 4.5.1).
- Meça a concentração de cDNA com um espectrofotômetro. Armazenar as amostras a -20 °C.
5. PCR em tempo real
- Para as análises com PCR em tempo real, use RNA total extraído com o Micro Kit e um SYBR Green QPCR Master Mix. Para garantir uma quantidade igual de transcritos, ajuste a concentração de cDNA de cada amostra para o mesmo valor após a transcrição reversa.
- Além das amostras inserir reações de controle. Use um controle sem modelo para rastrear a contaminação nos reagentes e verificar a qualidade de seus primers. Para verificar a ausência de DNA genômico, execute um controle não RT. Ambas as reações devem ser negativas (sem sinal de fluorescência) na PCR em tempo real.
- Para garantir um nível de transcrição igual entre as diferentes amostras, use pelo menos um gene de referência. Aqui, pares de primers projetados que codificam para uma actina (direto: 5'-CTCTTAACCCCAAAGCAAACAGG-3', reverso: 5'-GTGAGAGAACAGCCTGGATG-3') e um 18SrRNA (direto: 5'-CTTGATTCTATGGGTGGTGGTG-3', reverso: GTTAGCAGGCTGAGGTCTC-3') foram usados. Como gene alvo foi escolhido o TLP (forward: 5'- GTGGGCAACAATTGGACCCAG-3', reverse: 5'-CATTCGATCCGGAAAGGCTAC-3'). O tamanho de cada fragmento amplificado era de cerca de 100 pb.
- Para uma reação de 25 μl, adicione 12,5 μl 2x SYBR Green QPCR Master Mix, cDNA (≥20 ng), 400 nM de cada primer e 30 nM do corante de referência passivo ROX (fornecido com o kit). Ajustar o volume da amostra para 25 μl com água isenta de nuclease.
- As reações foram realizadas em um termociclador QPCR com o seguinte programa: desnaturação inicial a 95 °C por 10 min para ativar a polimerase; 40 ciclos de desnaturação (95 °C por 30 seg), recozimento (61 °C por 60 seg) e extensão (72 °C por 1 min); seguido pela curva de dissociação (95 °C por 60 seg, 55 °C por 30 seg, 95 °C por 30 seg). A curva de dissociação é necessária para determinar a ausência de dímeros de primer, que podem ser detectados por um pico adicional.
- Determine a eficiência (E) de cada reação de PCR usando o método de Liu e Saint8. A eficiência pode ser desviada da parte linear da curva de amplificação. Aqui, o número relativo de amplicons (Rn, A) de um ponto de ciclo (CPA) está ligado à quantidade de amplicons (Rn, B) de outro ciclo (CPB).
- Analise os resultados da PCR em tempo real com a Relative Expression Software Tool (REST 2009, http://www.gene-quantification.de/rest-2009.html) ou um software semelhante. Use o programa para calcular a taxa de expressão de um gene em uma amostra tratada em comparação com um controle.
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Resultados
Para o preparo de glândulas isoladas de tecido de jarro de Nepenthes, foi desenvolvida e aplicada uma técnica de microdissecação mecanizada. A plataforma de micropreparo precisa estar equipada com microforceps, presos ao micromanipulador, que por sua vez são operados por um painel de controle. Glândulas individuais, visíveis sob o microscópio, podem ser alvejadas com os forceps, que seguram o tecido glandular e o removem mecanicamente (Figura 4A).
O tecido glandular f...
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Discussão
Durante muito tempo, estudos de estruturas secretoras de plantas, em particular tricomas, foram realizados essencialmente em anatomia e eram puramente descritivos. Há um grande corpo de publicações desse tipo, resumidas em resenhas de9-11. Nosso conhecimento bioquímico e molecular das estruturas secretoras das plantas ainda é limitado, apesar de alguns trabalhos notáveis iniciais , por exemplo, em tricomas glandulares de hortelã, mostrando que os tricomas glandulares são o local de biossíntese de mono...
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Divulgações
Não temos nada a divulgar.
Agradecimentos
Agradecemos à equipe de estufas do MPI-CE no Jardim Botânico da Universidade Friedrich Schiller, Jena, pelo cultivo de plantas e a Wilhelm Boland e à Sociedade Max Planck pelo apoio.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| RNAqueous-Micro Kit | Life Technologies GmbH, Alemanha | AM1931 | Isolamento de RNA total, 50 amostras |
| Dynabeads mRNA DIRECT Micro Kit | Life Technologies GmbH, Alemanha | 61011 | 5 ml Dynabeads Oligo (dT)25 |
| DynaMag-2 magnet | Life Technologies GmbH, Alemanha | 12321D | |
| SuperScript CellsDirect cDNA Synthesis System | Life Technologies GmbH, Alemanha | 18080-200 | 25 reações |
| RNaseOUT | Life Technologies GmbH, Alemanha | 10777-019 | Inibidor de Rnase, 5.000 unidades |
| Random Hexamers (0,4 μ g/μ l) | QIAGEN GmbH, Alemanha | 79236 | 100 μ l |
| 10 mM dNTP Mix, grau de biologia molecular | Fermentas GmbH, Alemanha | R0192 | 1 ml |
| Taq DNA polimerase, (recombinante) | Fermentas GmbH, Alemanha | EP0402 | Fornecido com 10x tampão Taq (com KCl ou (NH4)2SO4) e 25 mM MgCl2 |
| TURBO DNase | Life Technologies GmbH, Alemanha | AM2238 | 1.000 unidades |
| Agarose | Carl Roth GmbH Co. Alemanha | T846.3 | |
| GeneRuler Low Range DNA ladder, pronto para uso | Fermentas GmbH, Alemanha | SM1193 | 50 μ g |
| Brilliant II SYBR Green QPCR Master Mix | Agilent Technologies, Inc., EUA | 600828 | Kit único |
| RNaseZAP | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemanha | R2020 | |
| Carl Roth GmbH Co., Alemanha | CK08.1 | ||
| Pinças | Carl Roth GmbH Co., Alemanha | 2801.1 / 2855.1 | |
| GE NanoVue espectrofotômetro | GE Healthcare Europe GmbH, Alemanha | 28-9569-62 | |
| Mastercycler gradient | Eppendorf AG, Hamburgo, Alemanha | 5331 000.010 | |
| Sistema de PCR em Tempo Real Mx3000P | Stratagene, EUA | 401403 | |
| Câmara de Eletroforese em Gel Horizontal Padrão | Agagel Biometra | Micromanipulador Descontinuado | |
| aura optik gmbh | aureka | Equipado com uma micropinça | |
| Estereomicroscópio | Carl Zeiss Microscopy, Jena, Alemanha | SteREO Lumar.V12 | Equipado com um conjunto de filtros AxioCam |
| Lumar 01 | Carl Zeiss, Microscopia, Jena, Alemanha | 485001-0000-000 | Filtro UV |
| Conjunto de filtros Lumar 09 | Carl Zeiss, Microscopia, Jena, Alemanha | 485009-0000-000 | filtro não UV |
Referências
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Reimpressões e permissões
