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Avaliando Miogênica Resposta e vasoactividade em artérias mesentéricas de resistência Usando Miografia Pressão

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DOI:

10.3791/50997

⸱

6 de julho de 2015

 ,  ,  , 
1Section of Gastroenterology and Hepatology, Georgia Regents University, 2Division of Gastroenterology and Hepatology, University of Pittsburgh School of Medicine, 3Vascular Biology Center, Georgia Regents University

Neste artigo

Resumo

Miografia pressão é utilizado para avaliar a vasoactividade das pequenas artérias que se desenvolvem constrição prolongada quando pressurizado. Este manuscrito proporciona um protocolo detalhado para avaliar em segmentos isolados de pequenas artérias mesentéricas de ratos, vasoactividade e o efeito da pressão intraluminal no diâmetro vascular.

Resumo

Artérias resistência pequena constrição e dilatar, respectivamente, em resposta ao aumento ou diminuição da pressão intraluminal; este fenómeno conhecido como resposta miogénica é um regulador chave do fluxo sanguíneo local. Em condições isobáricas artérias de resistência pequenas desenvolverem elevações contínuas constrição conhecida como tom miogênica (MT), que é um dos principais determinantes da resistência vascular sistêmica (RVS). Daí, ex vivo preparações pressurizados das artérias de resistência pequenas são as principais ferramentas para estudar função microvascular em estados próximos a-fisiológica. Para alcançar este objectivo, um segmento intacto isolada de fresco de uma artéria pequena resistência (diâmetro ~ 260 uM) está montada em duas cânulas de vidro pequenas e pressurizado. Estas preparações arteriais reter mais características in vivo e avaliação de autorização do tônus ​​vascular em tempo real. Aqui nós fornecemos um protocolo detalhado para avaliar vasoactividade em pressurizados pequenas artérias mesentéricas de resistência de ratos; estas artérias desenvolvervasoconstrição sustentada - cerca de 25% do diâmetro máximo - quando pressurizado a 70 mmHg. Estas preparações arteriais pode ser utilizada para estudar o efeito dos compostos experimentais na relação entre a pressão intra-arterial e vasoactividade e determinar alterações na função microvascular em modelos animais de várias doenças.

Introdução

Pequenas artérias de resistência são os principais determinantes do SVR e desempenham um papel importante na fisiopatologia de muitas doenças 1,2. Condições como a diabetes 3, 4 a gravidez, de isquemia-reperfusão 5, obesidade e hipertensão 6,7 são frequentemente associados com a função microvascular alterada. Miografia vascular pode não só fornecer importantes insights sobre mudanças na função microvascular em várias doenças, mas também ajudar a identificar alvos terapêuticos e avaliar a eficácia dos compostos vasoativas. Função vascular foi estudada usando isoladas pequenas artérias em condições de vasos isométricos ou isobáricas 8. Descrição detalhada do Miografia isométrica é fornecido em outros lugares 9. No entanto, existem diferenças nos dados obtidos a partir de preparações contra isométrica isobáricas 10-12. Desde preparações arteriais pressurizados permitir o estudo da função microvascular em condições de quase-fisiológicas, aresultados obtidos podem correlacionar melhor com o comportamento in vivo do leito vascular 8,13.

Em 1902 Bayliss descreveu pela primeira vez o efeito da pressão transmural do diâmetro vascular 14. Ele observada em artérias de resistência pequenas de vários leitos vasculares de coelhos, gatos e cães que uma diminuição na pressão foi seguido por vasodilatação, e um aumento da pressão foi seguido por vasoconstrição. Este fenômeno é conhecido como resposta miogênica. Bayliss e investigadores subseqüentes observou que, em condições isobáricas artérias pequena resistência desenvolver constrição sustentado conhecida como MT 15,16. Tanto a resposta miogénica e MT pode ser avaliada usando Miografia pressão (PM) técnica. PM é usado principalmente para determinar vasoactividade de pequenas artérias, veias e outros recipientes. Além de avaliar o efeito dos compostos vasoativos no diâmetro vascular, PM - como o nome indica - é utilizado para avaliar ch mediada por pressão intravascularanges do diâmetro vascular. Ao longo das últimas décadas os avanços em software de computador, o que aprimorou microscopia de vídeo e pipeta de vidro puxando, fizeram PM mais fácil de executar. No entanto, a dissecção de segmentos intactas viáveis ​​de pequenos vasos sanguíneos continua a ser tedioso e às vezes desafiador. Aqui destacamos um protocolo detalhado para estudar resposta miogênica em pequenas artérias mesentéricas de resistência isolados de ratos.

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Protocolo

Os exemplos mostrados aqui são de experimentos aprovados pelo IACUC na Georgia Regents University - Protocolo nº: # 2011-0408

1. Preparação dos Reagentes

  1. Preparar solução de estoque dissecção: Por 500 ml da solução de dissecção (5x), dissolver 21,18 g de NaCl, 0,875 g de KCl, 0,739 g de MgSO4, 1,049 g de MOPS e 0,019 g de EDTA em 450 ml de água Milli-Q. Ajustar o pH a 7,3-7,4 utilizando NaOH 1 N. Completar o volume a 500 ml com água Milli-Q. Da solução pode ser armazenada até 7-10 dias. Ver Tabela 1 para uma lista de produtos químicos e seus fornecedores. Ver Tabela 2 para a concentração em mM.
  2. Preparar a solução de dissecção de trabalho: Preparar a solução de trabalho dissecção fresco todos os dias. Para 100 ml de solução de trabalho, dissolver 0,091 g de glucose, 0,016 g de NaH 2 PO 4 e 0,022 g de piruvato de sódio em 79,8 ml de água Milli-Q. Adicionar 0,2 ml 1M CaCl 2 e 20 ml da solução de dissecção para trazer volume a 100 ml.
  3. Preparar a solução salina fisiológica (PSS): Para preparar 1000 ml PSS, dissolver 0,365 g de KCl, NaCl 6,545 g, 0,296 g MgSO4, 0,163 g KH 2 PO 4, 2,072 g de glicose, 2.184 g de NaHCO 3 e 2,383 g de HEPES em 950 ml de água Milli-Q. Ajustar o pH a 7,3-7,4 utilizando NaOH 1 N. Completar o volume a 1000 ml com água Milli-Q. Retirar 2 ml de solução e substituí-la com 2 ml de 1 M de CaCl2. (Fresh PSS precisa ser preparada diariamente)
  4. Prepare de cálcio (Ca2 +) PSS livre: Para 100 ml PSS sem Ca 2+, dissolver 0,036 g de KCl, 0,654 g de NaCl, 0,029 g de MgSO4, 0,016 g de KH 2 PO 4, 0,207 g de glucose, 0,218 g de NaHCO3, 0,238 g de HEPES, 0,015 g de EGTA e 0,0026 g de nitroprussiato de sódio (SNP) em 95 ml de água Milli-Q. Ajustar o pH a 7,3-7,4 utilizando NaOH 1 N. Completar o volume a 100 ml com água Milli-Q.

2. Preparação de vidro cânulas

  1. Puxe pipetas de vidropara gerar os 100-150 ^ m cânulas derrubadas usando um extrator pipeta de acordo com as orientações do fabricante.
  2. Bevel as dicas cânula de vidro usando um beveller microeletrodos, fogo polonês-los e dobrar as pontas cânula de vidro por ~ 45 ° utilizando uma sonda aquecedor.
  3. Coloque as cânulas no suporte micropipeta e anexar o titular da micropipeta para a câmara de perfusão.

3. Preparação de Perfusão Secção

  1. Câmara de perfusão de enxaguamento com água Milli-Q, seguido por solução de dissecção durante 5 minutos cada. Carregar a câmara com 2 ml de solução de dissecção.
  2. Solução de dissecção de sucção através de uma cânula usando seringa de 10 ml e preencher cuidadosamente toda a cânula e o tubo ligado sem quaisquer bolhas. Aplicar sucção com cuidado para evitar a geração de bolhas.
  3. Prepare duas suturas com uma meia-nó cada usando uma pinça sem corte. Desde suturas monofilamento de nylon oftálmicas (10-0, 0,2 métrico) são usados ​​para preparar os nós que só são1-2 mm de diâmetro, pode ser necessária dissecção microscópio.
  4. A visualização sob dissecção microscópio, utilize uma pinça de dissecção para carregar ambas as cânulas com nós de sutura parcialmente fechados um pouco longe da ponta. Mais tarde, esses nós serão deslizou cuidadosamente sobre as extremidades arteriais canulados e completamente fechada.

4. Cobrança dos mesentérica Artéria Arcade de Sprague-Dawley

  1. Buscar a aprovação do Animal Care e Use Comitê Institucional local (IACUC) antes de realizar esses experimentos. Animais casa no biotério com temperatura controlada e iluminação e permitir o acesso livre à água e uma ração comercial para roedores.
  2. Anestesiar ratos por injecção intraperitoneal de cetamina (80 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg). Confirme anestesia profunda por toe-pitada e se necessário Administrar anestésicos adicionais.
  3. Após a confirmação da anestesia cirúrgica, eutanásia do animal por decapitação. Siga as orientações AAALAC para utilizing métodos adequados para a eutanásia dos animais.
  4. Use uma tesoura de dissecção e uma pinça para realizar uma laparotomia na linha média da pelve para esterno. Isto é feito em dois passos: primeiro, incisão na pele e, segundo, a incisão camada muscular subjacente. Cuidados devem ser tomados para não ferir os órgãos intra-abdominais.
  5. Cortar a extremidade proximal do intestino próximo do piloro e a extremidade distai perto da junção íleo-cecal. Tie separadamente ambas as extremidades para impedir o escape do quimo e fezes, evitando assim a contaminação da solução de banho extracelular. Inciso o mesentério na sua base, perto da alimentação vasculatura ou seja, artéria mesentérica superior e transferir toda a pequena cama mesentérica intestinal para uma proveta de 50 ml contendo solução de dissecção gelado.
  6. Permita tecido colhido para ficar em solução dissecção fria gelo durante 5 minutos e enxágüe com solução dissecção fresco para se livrar de sangue.

5. O isolamento ea canulação da 4ª Ordem mesentérica Artéria

  1. Pin para baixo a extremidade proximal do intestino, no lado direito em uma placa revestida-Sylgard. Estender o intestino remanescente em um caminho de sentido anti-horário, fixando o segmento para baixo para espalhar o mesentério e expondo os vasos sanguíneos (Figura 1). Nota: isolar segmentos arteriais à temperatura ambiente. Caso contrário, coloque a arcada mesentérica contendo prato no gelo. Alguns laboratórios, incluindo aqueles em nossa instituição, utilizar unidades chiller para dissecar as artérias a 4 ° C.
  2. Sob um microscópio estéreo zoom dissecar 3 ª e 4 ª ordem pequena artéria mesentérica (~ 260 mm) paralelo ao intestino delgado usando uma tesoura pequena. Primeiro dissecar afastado toda a gordura de cobertura. Então dissecar a veia e isolar a artéria com ponto de ramificação em forma de V. Tenha cuidado para não perfurar o segmento selecionado. Comece dissecar a gordura perto de um fim ramo 2º e encontrar o caminho para a 3ª ou 4ª ordvasos de er.
    1. Nota: Artérias e veias podem ser distinguidos com base na sua espessura de parede - parede arterial é mais espessa do que veia do. Além disso, quando o tecido conjuntivo adjacente é puxado suavemente perpendicular aos vasos, veias colapso prontamente quando as artérias não. Desde artérias com diâmetro luminal <400 mm são os principais locais de resistência vascular sistêmica, para este protocolo que usamos 4º artéria mesentérica fim de rato (diâmetro luminal <300 mm).
  3. Isolar uma secção de 4-5 mm da artéria paralelo para o intestino delgado. Visualize todas as 5 filiais th ordem de incorporação para o intestino delgado e cortá-los um pouco longe da origem de ramos e preservar uma parte. Estas porções preservadas de ramos servem como segurando locais (com uma pinça de dissecção) para a transferência de segmentos arteriais a uma câmara de perfusão e, posteriormente, orientar a sua punção.
  4. Em seguida, corte os segmentos arteriais, fazendo duas incisões para distal5 ramos ordem th em cada lado da artéria e transferi-lo para a câmara de perfusão (ver Figura 1C e legenda).
  5. Canular uma extremidade dos vasos em uma micropipeta de vidro (diâmetro: 100-150 mm) usando uma pinça de dissecação, mantendo as pontas do segmento arterial com uma pinça de dissecação. Deslize a sutura parcialmente fechada previamente carregado para o fim canulada e prendê-lo. Nota: A extremidade proximal da artéria pode ser canulada para a cânula de vidro que está ligado ao dispositivo de regulação de pressão servo-controlada para imitar no ambiente in situ.
  6. Anexar uma solução de dissecção carregado seringa de 10 ml com a torneira de passagem ligado a esta cânula de tal modo que na solução de dissecção a tubagem de ligação da cânula e que se funde com a torneira na seringa. Levantar suavemente a seringa. A força gravitacional sobre a solução irá remover o sangue intravascular da extremidade aberta do recipiente. Depois de retirar a intra-arterial, Fechar a torneira.
    Nota: Como alternativa, coloque a torneira para o controlador de pressão, ligue-o suavemente e aumentar a pressão para 5-10 mm Hg para alcançar o mesmo resultado.
  7. Ate a extremidade distal dos vasos para uma segunda cânula de vidro levando cuidadosamente o outro cânula tão próximo quanto possível da extremidade não ligada do segmento arterial. Deslize a sutura parcialmente fechada previamente carregado para o fim canulada e prendê-lo. Cuidados devem ser tomados para não puxar ou puxar os segmentos arteriais. Certifique-se de que as torneiras ligadas a ambas as cânulas são fechadas.
  8. Transferir câmara de perfusão para a fase de microscópio invertido equipado com gravação de vídeo ao vivo.
  9. Ligue a torneira de cânula ligada à extremidade proximal do segmento arterial a um dispositivo de regulação de pressão servo-controlada e certificar-se que a torneira anexa à outra cânula permanece fechado para manter a pressão intraluminal estável.
  10. Em seguida, conectar o tubo de vácuo para a porta de sucção umnd a perfusão tubulação para a porta da câmara de perfusão.
    Nota: chanfrada porta agulha é usada para aspiração e porta agulha romba para perfusão.
  11. Iniciar a perfusão de navio com PSS quente através aquecedor em linha única solução (37 ° C, equilibrada com a mistura de gás: 5% de CO2, 5% de O2 e 90% de N para manter o pH neutro e uma oxigenação adequada 17) em 2 mL / min usando uma bomba peristáltica. Rode o vácuo no bem. Inserir um termistor na câmara para monitorizar continuamente a temperatura.
  12. À medida que a temperatura do PSS na câmara aproxima ~ 37 ° C (geralmente dentro de 5 min), lentamente aumentar a pressão intraluminal de 20 a 100 mmHg e vasos para verificar fugas. Isso é feito usando o ajuste de pressão automático do regulador de pressão. Descarte navios com vazamento e substitua-o por outro segmento. Os recipientes com fugas não vai ser capaz de manter a pressão.
  13. Avaliar o segmento arterial para curvas, mantendo a pressão a 100 mmHg.Usando a alavanca de parafuso, mover a cânula para endireitar o segmento arterial. Não mais de esticar os segmentos arteriais; a meta é imitar em comprimento do segmento arterial in vivo.
  14. Reduzir a pressão para 70 mmHg (para imitar na pressão vivo na arcada mesentérica 18) e permitir que o segmento arterial para estabilizar e desenvolver tom miogênica. Artérias pode ser pressurizado variável (40-70 mmHg) de acordo com a estratégia experimental e leito vascular. Uma revisão publicada anteriormente proporciona uma excelente avaliação da variabilidade em MT em segmentos arteriais de diferentes leitos vasculares 8.

6. Medição do diâmetro arterial

  1. Veja as artérias na objetiva de 10X em um microscópio equipado com uma câmera de vídeo monocromática dispositivo de carga acoplada. Medir o diâmetro luminal usando quadro de vídeo grabber e em tempo real do sistema de detecção de bordas. Uma lista de equipamento utilizado é fornecido na Tabela 3.
  2. Monitorar e vaso registro diameter continuamente.
  3. Observar o desenvolvimento de MT. Nota: Observamos que, em ratos artérias mesentéricas de resistência, em 70 mmHg, desenvolvimento de MT é caracterizada pela diminuição ~ 20% de diâmetro. MT varia de acordo com a cama e as espécies animais vasculares.
  4. Confirmar viabilidade vascular, avaliando vasoconstritores e vasodilatadores respostas a fenilefrina 1 fiM (Phe) e 1 uM de acetilcolina (ACh).
  5. No final de cada experiência, determinar diâmetro passiva (PD) por incubação em artérias de Ca 2 + livre PSS durante 20 min.

7. Miogênica Response

  1. Reduzir a pressão até 20 mm Hg e permitir que o diâmetro para estabilizar. Aumentar a pressão intraluminal em passos incrementais (20, 40, 60, 80 e 100) e em cada passo de permitir que a pressão artérias para atingir um diâmetro estável (usualmente dentro de 5 min).
  2. Reduzir a pressão intraluminal para 20 mmHg e incubar o segmento arterial em Ca 2 + livre PSS contendo 0,39 mMSNP mM de EGTA e 0,1. Permitir que o diâmetro arterial para estabilizar (geralmente 15 min).
  3. Repita a resposta da pressão passo em Ca 2 + livre PSS contendo EGTA 0,39 e 0,1 mM SNP.

8. Interpretação dos Resultados e cálculo dos dados

  1. Calcular o MT como a diferença percentual em diâmetro observado para Ca 2+ molecular contendo contra Ca 2 + livre PSS para cada pressão de acordo com a seguinte cálculo:
    figure-protocol-1
  2. Para artérias submetidos a vasomotricidade o diâmetro pode ser calculada tomando a média da fase de plateau durante 1 min. Expressar os dados coletados como por cento de relaxamento máximo (% PD) de acordo com a relação:% DP = 100 x [ΔD / PD]; ΔD é a diferença entre o diâmetro antes e depois da adição de qualquer composto em investigação (por exemplo, Phe); DP é o diâmetro passiva (também adiâmetro máximo).

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Resultados

Representação esquemática de um myograph pressão típica configuração é mostrado na Figura 1. As duas extremidades do recipiente é canulada com uma micropipeta de vidro e protegido com suturas de ambos os lados. Por meio da tubagem e uma torneira aberta, uma cânula é ligada a um regulador de pressão de servo-controlada; a outra cânula é ligada a uma torneira de passagem fechada. A câmara é perfundido com PSS e diâmetro vascular mudanças são observadas por um microscópio invertido ligado a uma câmara CCD....

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Discussão

Passos crítico, resolução de problemas e modificações

Numa preparação típica vaso isobárica, a artéria é pressurizado a 70 mmHg entre duas cânulas de vidro perfundidos com água morna (37 ° C) PSS. Após 30-45 min, artérias desenvolver MT, caracterizado por diminuição espontânea de diâmetro que se estabiliza em 20-30 min. As artérias de resistência de vários leitos vasculares desenvolver MT variável. Por exemplo resistência rato artéria mesentérica desenvolver MT ~ 25% do PD, enquanto artérias cr...

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Divulgações

Autores não têm conflitos financeiros.

Agradecimentos

Sandeep Khurana é suportado pelo NIH (K08DKO81479). Vikrant Rachakonda é suportado por (T32DK067872).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
< forte > químico < / forte >
acetilcolinaSigma AldrichA6625
Cloreto de cálcio (CaCl < sub > 2 < / sub >)Sigma Aldrich223506
D- (+) -glicoseSigma AldrichG5767
Etilenoglicol-bis (2-aminoetiléter) -N, N, N ', N'-tetra ácido acético (EGTA)Sigma AldrichE3889
Ácido etileno diamina tetraacético (EDTA)Sigma AldrichE9884
HEPESSigma AldrichH3784
Sulfato de magnésio (MgSO4)Sigma AldrichM7506
MOPSSigma AldrichM5162
FenilefrinaSigma AldrichP6126
Cloreto de potássio (KCl)Sigma AldrichP3911
Fosfato de potássio (KH2PO4)Sigma AldrichP5655
Bicarbonato de sódio (NaHCO3)Sigma AldrichS6014
Cloreto de sódio (NaCl)Sigma AldrichS7653
Hidróxido de sódio (NaOH)Sigma AldrichS5881
Nitroprussiato de sódioSigma Aldrich13451
Fosfato de sódio monobásico monohidratado (NaH2PO4)Sigma AldrichS9638
Piruvato de sódioSigma AldrichP8574
Tabela 1.
2
Solução salina fisiológica (1.000 ml) mM
KCl4,90,365 g
NaCl1126,545 g
MgSO4,7H2O1,20,296 g
KH2PO41,20,163 g
Glicose11,52,072 g
NaHCO3262.184 g
HEPES102.383 g
CaCl2 22 ml (estoque 1M)
Água desionizada998 ml
Ca2+ solução salina fisiológica livre (100 ml) mM
KCl4,90,036 g
NaCl112 0,645 g
MgSO4,7H2O1,20,029 g
KH2PO4 1,2 0,016 g
Glicose11,50,207 g
NaHCO326 0,218 g
HEPES100,238 g
EGTA 0,390,015 g
Nitroprussiato de sódio 0,10,0026 g
Água desionizada100 ml
Solução de dissecação, estoque (500 ml) mM
NaCl14521,18 g
KCl4,70,875 g
MgSO41,20,739 g
MOPS21,049 g
EDTA0,020,019 g
Água desionizada500 ml
Solução de dissecção de trabalho (100 ml) mM
Estoque de solução de dissecção20 ml
Glicose1,20,091 g
NaH2PO450,016 g
Piruvato de sódio20,022 g
20,2 ml (estoque de 1M)
Água desionizada79,8 ml
< tr> < td>CaCl
Tabela 2. Composição de soluções experimetnal
EquipmentCCD Câmera monocromática A fonte de imagem DMK 21AU04 Aquecedor de solução em linha único Warner Instruments 64-0102 Termistor Warner Instruments 64-0108 Controlador de temperatura automático duplo Warner Instruments
TC-344B
Extrator de micropipeta flamejante/marromSutter InstrumentsP-97
Interface do sistema de fluorescênciaIonOptixmodelo FSI-700
Fórceps e tesouras World Precision Instruments
Ion Wizard-Core e análiseIonOptixIon Wizard 6.0
Tubulação de laboratórioSilastic508-005
Rato macho Sprague DawleyHarlan Laboratories
Master flex console driveCole-parmer
Milli-Q Plus Sistema de água ultrapuraMilliporeZD5211584
Sutura de nylon monofilamento oftálmico Ethicon9007G
Microscópio de Fotometria e DimensionamentoMoticAE31
com bomba peristáltica e transdutor de pressãoInstrumentação de sistemas vivosPS-200
EstereomicroscópioNikon Instruments IncSMZ660
Câmara de vasoInstrumentação de sistemas vivosCH-1
Prato de dissecaçãoInstrumentação de sistemas vivosDD-90-S
Instrumentos de precisãoTW120-6capilares de vidro finos da parede
que armazena51550
Tabela 3.
Servo controlador de pressão Microforge do mundo dos

Referências

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