Coleta e identificação de helmintos da vida selvagem

Resumo

Os animais selvagens são comumente parasitados por uma ampla gama de helmintos. Os quatro principais tipos de helmintos são "lombrigas" (nematóides), "vermes de cabeça espinhosa" (acantocéfalos), "vermes" (trematódeos) e "tênias" (cestóides). Aqui descrevemos como os helmintos são coletados de um animal vertebrado e como eles são preservados e taxonomicamente identificados.

Resumo

Animais selvagens são comumente parasitados por uma ampla gama de helmintos. Os quatro principais tipos de helmintos são "lombrigas" (nematóides), "vermes de cabeça espinhosa" (acantocéfalos), "vermes" (trematódeos) e "tênias" (cestóides). O método ideal para coletar helmintos é examinar um hospedeiro que está morto há menos de 4-6 horas, já que a maioria dos helmintos ainda estará viva. Uma necropsia completa deve ser realizada e todos os principais órgãos examinados. Os órgãos são lavados sobre uma peneira de 106 μm em água corrente e o conteúdo examinado em um microscópio estereoscópico. Todos os helmintos são contados e um número representativo é fixado (em etanol a 70%, formalina tamponada a 10% ou álcool-formalina-ácido acético). Para a identificação das espécies, os helmintos são eliminados em lactofenol (nematóides e pequenos acantocéfalos) ou corados (trematódeos, cestóides e grandes acantocéfalos) usando hematoxilina de Harris ou carmim de Semichon. Os helmintos são ligados às espécies examinando diferentes estruturas (por exemplo, espículas masculinas em nematóides ou o rostelo em cestóides). Os protocolos descritos aqui podem ser aplicados a qualquer animal vertebrado. Eles exigem alguma experiência no reconhecimento dos diferentes órgãos e na capacidade de diferenciar helmintos de outros detritos teciduais ou conteúdos intestinais. Coleta, preservação e coloração são técnicas simples que requerem equipamentos e reagentes mínimos. A identificação taxonômica, especialmente para espécies, pode ser muito demorada e pode exigir a submissão de espécimes a um especialista ou análise de DNA.

Introdução

Os vertebrados são parasitados por quatro grupos principais de helmintos (vermes). Dois dos grupos, trematódeos, ou vermes, e cestóides, ou tênias, se enquadram no filo Platyhelminthes. Os outros dois grupos são os nematóides, ou lombrigas, (Nematoda) e os acantocéfalos, ou vermes de cabeça espinhosa (Acanthocephala). Muitos desses parasitas têm sido documentados como causas de morbidade e mortalidade em aves e mamíferos silvestres^1,2.

A maioria dos helmintos tem ciclos de vida complexos envolvendo mais de um hospedeiro^1,2 . Por exemplo, os trematódeos têm um ou dois hospedeiros intermediários (geralmente invertebrados) e um hospedeiro final. Todos os hospedeiros precisam estar disponíveis para que o ciclo seja concluído e, portanto, para que os helmintos adultos estejam presentes nos hospedeiros finais (que são o tópico deste manuscrito). Portanto, é importante ter em mente que podem ocorrer flutuações sazonais na prevalência e intensidade de algumas espécies de helmintos e o monitoramento de longo prazo é desejável para capturar o helmintos completos de auna de um hospedeiro específico.

O método ideal para coletar helmintos é examinar um hospedeiro que foi sacrificado. Isso permite a coleta de helmintos enquanto ainda estão vivos e seu relaxamento e fixação adequados. O material de hospedeiros que estão mortos há mais de 24 horas, ou que foram congelados e descongelados para exame, geralmente é inferior e difícil de identificar. Trematódeos e cestóides de hospedeiros congelados ou formalizados são frequentemente muito contraídos e perderam estruturas cruciais para a identificação, como espinhos orais em trematódeos ou ganchos no escólex de tênias. No entanto, a realidade é que a maior parte do material disponível de hospedeiros vertebrados hoje em dia é congelado ou preservado.

Bancos de dados contendo informações de sequência de DNA para helmintos estão crescendo rapidamente e, portanto, a identificação taxonômica já é possível para muitas espécies. Portanto, os helmintos devem ser preservados para possíveis análises de DNA, tanto quanto possível. No entanto, o DNA de boa qualidade não é possível se as amostras forem fixadas em formalina. Os métodos descritos aqui para coletar e matar helmintos produzirão material adequado para extração de DNA e análises genéticas.

Abaixo, descrevemos métodos detalhados sobre como necropsiar vertebrados (anfíbios, répteis, aves e mamíferos; trematódeos monogênicos de peixes não estão incluídos) para a coleta de helmintos, seguidos de procedimentos sobre como preservá-los e processá-los para identificação taxonômica.

Protocolo

Os animais usados nos experimentos a seguir foram encontrados mortos como atropelamentos.

1. Necropsia Animal e Triagem de Órgãos Principais para Coleta de Helmintos

1. Posicione o animal em uma superfície plana e examine todas as aberturas externas, incluindo orelhas, cavidade oral e olhos com uma lupa quanto à presença de nematóides (redondos) e trematódeos (planos e não segmentados) (ver Figura 1).
2. Se estiver trabalhando com pássaros, lave com água da torneira para umedecer as penas antes de dissecar.
3. Usando uma lâmina afiada ou faca e com o auxílio de um par de pinças de dissecação, faça uma incisão sobre a cavidade abdominal, tomando cuidado para não romper nenhum órgão. Para tartarugas com carapaça dura, use uma serra manual para cortar o osso na área da ponte entre os escudos peitorais e abdominais.
4. Abra a cavidade torácica como acima; para animais grandes, cortadores de ossos ou uma pequena serra manual podem ser necessários para cortar as costelas.
5. Se estiver trabalhando com pássaros, examine os sacos aéreos in situ antes de remover qualquer órgão. Use uma lupa, se necessário.
6. Examine ambas as cavidades em busca de lombrigas filariais e trematódeos grandes.
7. Antes de remover o trato gastrointestinal da cavidade abdominal, amarre um fio próximo ao início do esôfago e outro no final do intestino grosso (reto).
8. Separe os seguintes órgãos torácicos em placas de Petri (ou bandejas de vidro, se os órgãos forem muito grandes) para exame ao microscópio estereoscópico (10-30X): coração e vasos sanguíneos principais, traqueia e pulmões.
9. Remova o fígado, a vesícula biliar e o ducto, o pâncreas, o baço, os rins e a bexiga urinária e examine conforme descrito na etapa 1.8.
10. Remova todo o sistema digestivo e coloque cada seção em pratos/bandejas de vidro.
11. Após a remoção dos órgãos, lave a cavidade corporal com uma mangueira ou frasco de esguicho cheio de solução salina a 0,9% em uma peneira de malha de 106 μm e examine o conteúdo da peneira em um microscópio estéreo quanto à presença de vermes filariais ou trematódeos sanguíneos.
12. Abra cada seção do trato digestivo com uma tesoura, raspe a mucosa e examine cuidadosamente a presença de parasitas grandes (>1 cm). Use uma lupa, se necessário. A tromba dos acantocéfalos geralmente está profundamente enraizada na parede do intestino e pode ter que ser cuidadosamente retirada do tecido com uma pinça e / ou uma pequena tesoura.
13. Coloque cada seção aberta sob água corrente e lave todo o conteúdo em uma peneira de 106 μm conforme descrito na etapa 1.11.
14. Abra o coração e os principais vasos sanguíneos (pulmonar e aorta), traqueia e vesícula urinária e biliar e examine o conteúdo da mesma maneira.
15. Corte e separe órgãos sólidos, como pulmões, fígado, rins, baço e pâncreas, usando uma lâmina afiada e uma pinça. Lave-os em água corrente para uma peneira de 106 μm, conforme descrito na etapa 1.11.
16. Registre os tipos de parasitas encontrados, o número de cada tipo e o(s) órgão(s) em que são encontrados. Os métodos de fixação e coloração estão listados abaixo.
17. Rotule os frascos/frascos colocando um pequeno pedaço de um cartão de índice comum escrito com lápis (tinta e cartões de índice pautados "escorrerão" em amostras de álcool e manchas).

2. Preservação de helmintos

1. Para helmintos que precisam ser preservados para estudos genéticos posteriores, coloque-os diretamente em etanol a 80-90% (sem glicerina). O etanol deve ser feito diluindo etanol a 95%, preferencialmente grau reagente (Tabela 1). Nunca permita que essas amostras sejam expostas à formalina, pois a formalina degrada o DNA a um estado inutilizável.
2. Coloque trematódeos vivos em uma lâmina de microscópio de vidro em uma gota de solução salina, coloque uma lamínula de vidro e passe a lâmina sobre uma chama sem ferver a solução salina.
   1. Solte a lâmina em uma placa de Petri contendo AFA (álcool-formalina-ácido acético, consulte a Tabela 1) e deixe a tampa flutuar.
   2. Fixe em AFA por um a vários dias, enxágue com água da torneira e transfira para frascos de vidro de 5 ml (ou frasco / frasco de vidro maior, dependendo do tamanho e da quantidade de parasitas) preenchidos com etanol a 70% para armazenamento a longo prazo.
3. Fixe os trematódeos mortos em AFA ou formalina tamponada a 10% por 48 horas e, em seguida, transfira para frasco / frasco cheio de etanol a 70% para armazenamento de longo prazo.
4. Relaxe os cestóides vivos em uma placa de Petri despejando água quase fervente sobre eles e, em seguida, transfira para um frasco / frasco cheio de etanol a 70% para armazenamento a longo prazo.
5. Relaxe os acantocéfalos vivos colocando em uma placa de Petri por uma a várias horas em água da torneira na geladeira (~ 4 ° C) até que a tromba esteja totalmente evertida (isso pode levar até 24 horas). Transfira para frasco/frasco cheio de etanol 70% ou AFA para armazenamento de longo prazo.
6. Trate cestóides e acantocéfalos mortos da mesma forma que trematódeos mortos (veja acima).
7. Mate os nematóides vivos pequenos (<5 mm) ou frágeis (por exemplo, tricostrongilídeos, capilarídeos) em etanol a 70% quente (quase em ebulição) e conserve em frasco/frasco cheio de etanol a 70% com glicerina a 5% (Tabela 1) adicionada para preservar os vermes em caso de evaporação.
8. Mate (e limpe) nematóides médios a grandes (>5 mm) (por exemplo, ascarídeos, espiurídeos, oxiurídeos, filarídeos) colocando em uma placa de Petri com ácido acético glacial frio (Tabela 1) e após 15 minutos transfira para frasco / frasco cheio de etanol a 70% e glicerina a 5%. O ácido acético pode ser usado repetidamente dessa maneira.
9. Coloque os nematóides mortos diretamente em frasco/frasco cheio de etanol a 70% e glicerina a 5%.

3. Identificação taxonômica de helmintos

1. Prepare a hematoxilina de Harris dissolvendo a hematoxilina em álcool e dissolvendo o sulfato de alumínio e amônio em água com calor. Misture as duas soluções e leve para ferver.
   1. Adicione iodato de sódio e ferva por 2-3 min. Solução de filtro (papel de filtro 541) depois de voltar à temperatura ambiente.
2. Cubra trematódeos, cestóides e acantocéfalos, deixando-os em hematoxilina de Harris diluída (1:10) ou carmim de Semichon durante a noite (ver Tabela 1).
   1. Remova a coloração com etanol ácido a 70% até que os órgãos fiquem visíveis (pode levar de alguns segundos a mais de uma hora e deve ser observado de perto).
   2. Interrompa a descoloração transferindo amostras para etanol básico a 70% por pelo menos 30 min. Em seguida, desidrate-os em uma série de etanoles graduados (80%, 95%, 100%) e limpe-os em xileno ou salicilato de metila.
   3. Monte as amostras em uma lâmina de microscópio depois de adicionar uma gota de bálsamo do Canadá e uma lamínula. Deixe secar durante a noite.
3. Limpe nematóides e acantocéfalos pequenos a médios por 15-30 min em montagens temporárias de lactofenol em uma lâmina de microscópio com uma lamínula.
   1. Use fenol a 80% por até 60 min para nematóides grandes (ascarídeos e espirúridos) e acantocéfalos. Examine sob um microscópio óptico (40-400X) para avaliação de estruturas menores (espículas e ganchos masculinos).
4. Use as seguintes abordagens para examinar estruturas especiais.
   1. Para cestóides, corte o escólex e coloque em uma lâmina de microscópio lactofenol e "abóbora" com uma lamínula para medir e contar ganchos roestelares (ver Figura 1B).
   2. Para nematóides, corte a extremidade anterior e monte em uma lâmina de microscópio em algumas gotas de lactofenol (sem lamínula) ou em geléia de glicerina para uma montagem permanente (com lamínula) e observe as peças bucais sob um microscópio de luz (35-400X) (ver Figura 1D).
   3. Corte as caudas de nematóides grandes e monte em uma lâmina de microscópio em lactofenol com uma lamínula para observar as papilas ventrais e a morfologia da espícula dos machos sob um microscópio óptico (ver Figura 1D).
5. Identifique parasitas para espécies usando uma combinação de literatura primária e referências taxonômicas padrão, como:
   1. Trematódeos: Yamaguti (1958, 1971)^3,4 e Gibson et al. ^5-7
   2. Acantocéfalos: Yamaguti⁸
   3. Cestodes: Yamaguti⁹, Schmidt¹⁰ e Khalil et al. ¹¹
   4. Nematóides: Yamaguti¹² e Anderson et al. ¹³

4. Depositário de Helmintos na Coleção Nacional de Parasitas dos EUA

1. Deposite espécimes representativos de helmintos na Coleção Nacional de Parasitas dos EUA (USNPC). Isso é obrigatório para a maioria dos diários de parasitas. Após a submissão, cada espécie de helmintos recebe um número de acesso para inclusão nos manuscritos.
2. Inclua as seguintes informações ao enviar amostras: 1) Nome científico do parasita; 2) informações do hospedeiro (espécies, coordenadas de longitude/latitude ou localização geográfica); 3) órgão encontrado no hospedeiro; 4) nome de quem coletou os espécimes e data da coleta; 5) tipo de fixador, mancha ou meio de limpeza/montagem utilizado; 6) localização de outras coleções (números de museu e acesso) se espécimes adicionais forem enviados em outro lugar; e 7) informações sobre publicação e periódico. Esses dados também devem ser enviados junto com as amostras e em capa separada.
3. Embale as amostras em recipientes fortes com material absorvente à prova de choque. Tape / Parafilm tampas de rosca em frascos de vidro e coloque cada frasco em um saco plástico separado. Embrulhe as lâminas em papel e coloque em uma caixa de lâminas com material absorvente de choque entre elas.
4. Envie amostras e carta separada com informações sobre amostras para: U.S. National Parasite Collection, USDA, ARS, ANRI, Bldg. 1180, BARC-East, 10300 Baltimore Avenue, Beltsville, MD 20705-2350.

Resultados

Utilizando os métodos descritos acima, foi realizada uma pesquisa sobre os helmintos da musaranha-mascarada, Sorex cinereus, no condado de Missoula, Montana, entre 2007 e 2011. Um total de 56 musaranhas foi coletado em armadilhas de queda e examinado dentro de 2 horas após a morte. A prevalência geral de infecção foi de 96%; apenas 2 musaranhas estavam livres de parasitas. Quinze espécies de helmintos foram identificadas, incluindo 9 espécies de cestódeos e 6 espécies de nematódeos. Uma espécie do gênero de cest...

Discussão

É extremamente difícil identificar parasitas helmínticos, mesmo para gênero, com base em material pobre. Cestóides e trematódeos, em particular, tendem a morrer e se deteriorar rapidamente após a morte do hospedeiro. A taxonomia dos cestóides depende muito do número, tamanho e forma dos ganchos rostelares, que muitas vezes se perdem no material congelado. O mesmo se aplica a certos trematódeos com espinhos ao redor da ventosa oral, como equinostomas e heterofídeos, que também são freqüentemente perdidos. Por causa de sua...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Fixação
Álcool-Formalina-Ácido Acético (AFA)	Fisher Scientific	A407-1 (etanol) F75F-1GAL (formaldeído) BP2401500 (ácido acético glacial)	Etanol 85% (85 ml) + formaldeído 37% (10 ml) + ácido acético glacial (5 ml)
Etanol para abate e preservação a longo prazo	Fisher Scientific	A407-1	Etanol 100% (70 ml) + água destilada (30 ml)
Etanol para fixação e estudos de DNA	Fisher Scientific	AC61511-0010	Etanol 80-90% (80-90 ml) + água destilada (20-10 ml), respectivamente
Tamponado com formalina	Fisher Scientific	SF100-4	Formalina 10% (10 ml) + água destilada (90 ml)
Glicerina-álcool	Fisher Scientific	A407-1 (etanol) AC15365-1000 (glicerina)	Etanol 70% (95 ml) + glicerina (5 ml)
Limpeza, coloração e montagem
Etanol para desidratação durante a coloração	Fisher Scientific	A407-1	Etanol 80%, 95%, 100% (80 ml, 95 ml, 100 ml) + água destilada (20 ml, 5 ml, 0 ml)
Lactofenol	Fisher Scientific	R400-27-Fenol
	Fisher Scientific	A931I-1 (fenol) A407-1 (etanol)	Fenol 100% (80 ml) + etanol 100% (20 ml)
Harris' Hematoxilina	Fisher Scientific	S25347 (hematoxilina) A407-1 (etanol) A567-500 (sulfato de alumínio e amônio) S25553 (iodato de sódio)	Hematoxilina (5 g) + etanol 100% (50 ml) + sulfato de alumínio e amônio (100 g) + iodato de sódio (0,37 g) + água destilada (1.000 ml)
Semichon' s carmim acético	Fisher Scientific	BP2401500 (ácido acético glacial) S25236 (carmim) A407-1 (etanol)	Ácido acético glacial (100 ml) + carmim (1,5 g) + água destilada (100 ml). Aqueça em banho-maria fervente por 15 min e deixe esfriar. Filtre para fazer a solução estoque. Misture 1:2 com álcool 70% para colorir.
Xileno	Fisher Scientific	X4-4	Use apenas sob um exaustor químico.
Salicilato de metila	Fisher Scientific	S25437-Etanol
básico	Fisher Scientific	A407-1 (etanol) S25159A (hidróxido de amônio concentrado)	Etanol 70% (100 ml) + hidróxido de amônio (0,1 ml)
Ácido etanol	Fisher Scientific	A407-1 (etanol) SA9233-100 (ácido clorídrico)	Etanol 70% (99,5 ml) +  ácido clorídrico (0,5 ml)
Bálsamo do Canadá	Fisher Scientific	B10-100	-