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Características dos microgéis de polietilenoglicol formados por precipitação são controlados pelo peso molecular dos reagentes

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DOI:

10.3791/51002

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23 de dezembro de 2013

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1Department of Biomedical Engineering, The University of Akron, 2Saint Vincent Saint Mary's High School

Neste artigo

Resumo

Este trabalho descreve a formação de microgéis de poli(etilenoglicol) (PEG) por meio de uma reação de precipitação fotopolimerizada. O aumento do peso molecular do PEG aumentou o diâmetro do microgel e a taxa de inchaço. Adaptações simples à reação de precipitação de microgel PEG são exploradas para futuras aplicações de microgéis como veículos de entrega de medicamentos e andaimes de engenharia de tecidos.

Resumo

Este trabalho descreve a formação de microgéis de poli(etilenoglicol) (PEG) por meio de uma reação de precipitação fotopolimerizada. As reações de precipitação oferecem várias vantagens sobre as técnicas tradicionais de fabricação de microesferas. Ao contrário das técnicas de emulsão, suspensão e dispersão, os microgéis formados por precipitação são de forma e tamanho uniformes, ou seja, baixo índice de polidispersão, sem o uso de solventes orgânicos ou estabilizantes. As condições amenas da reação de precipitação, as propriedades personalizáveis dos microgéis e a baixa viscosidade para injeções os tornam aplicáveis para fins in vivo. Ao contrário de outras técnicas de fabricação, as características do microgel podem ser modificadas alterando o peso molecular do polímero inicial. O aumento do peso molecular inicial do PEG aumentou o diâmetro do microgel e a taxa de inchaço. Outras modificações são sugeridas, como encapsular moléculas durante a reticulação de microgel. Adaptações simples aos blocos de construção de microgel PEG são exploradas para futuras aplicações de microgéis como veículos de entrega de medicamentos e andaimes de engenharia de tecidos.

Introdução

Por definição, microgéis são hidrogéis de qualquer forma com um diâmetro equivalente de aproximadamente 0,1-100 μm1. Devido ao seu tamanho e características, os microgéis poliméricos apresentam uma ferramenta versátil para o avanço dos sistemas de administração de medicamentos e engenharia de tecidos. Embora os hidrogéis a granel sejam amplamente utilizados como andaimes de engenharia de tecidos e veículos de entrega de medicamentos com grande sucesso2-4, uma mudança recente para o controle em microescala de andaimes oferece uma oportunidade única para que os microgéis sejam usados como materiais de base para a construção de andaimes. Além disso, os microgéis têm uma alta relação área de superfície para volume para interações celulares e, em solução, têm uma baixa viscosidade que os torna ideais para injeções. Finalmente, os microgéis podem ser formados usando vários polímeros por uma variedade de métodos, dependendo das características desejadas do microgel, tornando-os altamente personalizáveis para uma variedade de aplicações.

As técnicas para produzir microgéis incluem polimerizações em suspensão, emulsão, dispersão ou precipitação. As polimerizações de emulsão e suspensão normalmente requerem solventes orgânicos e surfactantes ou estabilizadores para formar os microgéis. A natureza desses métodos produz uma distribuição de tamanho de partícula altamente dispersa5. As reações de dispersão e precipitação produzem partículas com menor polidispersidade6; no entanto, as partículas formadas por polimerização por dispersão ainda requerem o uso de agentes estabilizantes6. Os microgéis formados por reações de precipitação são únicos, pois formam partículas de tamanho e forma uniformes sem o uso de estabilizantes ou surfactantes. A formação de microgéis é alcançada quando as cadeias poliméricas em crescimento se separam da fase contínua por precipitação entálpica ou entrópica7. A polimerização por precipitação geralmente ocorre em altas temperaturas que podem ser reduzidas pelo uso de sais kosmotróficos, que diminuem a solubilidade do polímero no solvente8. Este trabalho se concentra em microgéis formados a partir de poli(etilenoglicol) (PEG) por uma reação de precipitação fotopolimerizada sob condições biologicamente compatíveis, com variações para alterar as propriedades do microgel e encapsular moléculas para aplicações de liberação de fármacos.

Estudos anteriores com hidrogéis PEG mostram que as condições de polimerização influenciam muito as propriedades físicas e mecânicas dos hidrogéis, nomeadamente o teor de água do hidrogel e o módulo de compressão3,9. Esses materiais reticulados são de interesse porque a relação entre as propriedades estruturais e físicas descritas por Flory10 pode ser utilizada para adaptar o hidrogel reticulado para aplicações específicas. Esses princípios são semelhantes para microgéis. Descobriu-se que os microgéis de PEG formados por precipitação têm potencial para a medicina regenerativa11, no entanto, uma investigação mais aprofundada sobre as propriedades do microgel foi necessária para aprimorar seu repertório para futuras aplicações biomédicas. Este relatório descreve o procedimento para fabricar microgéis por reação de precipitação e alterar características, como diâmetro de micropartículas, índice de polidispersidade (PDI), densidade e inchaço, que seriam importantes para desenvolver ainda mais esses materiais para administração de medicamentos ou medicina regenerativa.

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Protocolo

1. Preparando soluções para uso na fabricação de microgéis

  1. Antes de iniciar a reação de precipitação, fazer as soluções necessárias e aquecê-las a 37 °C. As soluções necessárias incluem fotoiniciador a 0,5%, 1,5 M Na2SO4, solução tampão, solução de diacrilato de PEG 200 mg/ml (PEG-DA) e 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS). Nota: Acrilato de todos os precursores de PEG de acordo com os métodos publicados e armazenar a -20 °C sob argônio até o uso12.
  2. Pesar o fotoiniciador e dissolver em H2O desionizado (DI) para uma solução a 0,5 (p/v). É importante proteger a solução da exposição à luz UV.
    1. Após a dissolução completa, filtrar através de um filtro de 0,22 μm. Esta solução pode ser preparada com antecedência e conservada a 4 °C na obscuridade. Nota: Diminua o tempo de agitação para aproximadamente 1 hora aquecendo a solução a 40 °C enquanto agita.
  3. Para 1x PBS, adicione 1 comprimido de PBS a 1 L DI H2O e filtre através de um filtro de 0,22 μm. O PBS pode ser feito com antecedência e armazenado a 4 °C.
  4. Meça 39,4 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS, pH = 7,4) e adicione 612 μl de trietanolamina (TEOA) e 260 μl de ácido clorídrico (HCl) 6 M. Nota: TEOA é muito viscoso; pré-aqueça o TEOA a 37 °C antes da pipetagem.
    1. Ajustar o pH do tampão de modo a que seja aproximadamente 7,7 e filtrar através de um filtro de 0,22 μm (pH final ~7,8). A solução tampão pode ser ampliada, fabricada com antecedência e armazenada a 37 °C.
  5. Faça a solução de PEG-DA antes de iniciar a reação a cada vez; diminuição da reatividade foi observada se a solução for armazenada. Pese o PEG-DA e adicione o tampão PBS/TEOA/HCl até a concentração final de 200 mg/ml. Nota: Adicione o tampão lentamente para controlar cuidadosamente a concentração de PEG, pois o PEG incha na solução.
    Nota: Esta solução é altamente personalizável. As opções para personalizar microgéis incluem: alterar o peso molecular inicial do PEG para alterar as propriedades do microgel, usar um precursor de PEG degradável para fabricar microgéis degradáveis, filtrar estéreis todas as soluções para microgéis biologicamente estéreis, completar o processo de formação em uma capela de fluxo laminar e, finalmente, adicionar grupos funcionais à superfície, incorporando-os na solução de PEG.
  6. Pesar Na2SO4 e dissolver em DI H2O para uma solução a 1,5 M. Para obter melhores resultados, a solução de sulfato de sódio também deve ser feita imediatamente antes de iniciar a reação.
    1. Aquecer e vortex a solução até que o Na2SO4 esteja completamente dissolvido. Filtre através de filtro de 0,22 μm conforme necessário.

2. Fabricação de microgel

  1. Coloque 127,5 μl de tampão PBS/TEOA/HCl, 10 μl de fotoiniciador a 0,5% e 25 μl de solução de PEG 200 mg/ml nos tubos onde os microgéis serão formados; normalmente tubos de microcentrífuga de 2 ml.
    1. Aqueça esses tubos junto com a solução 1.5 M Na2SO4 a 37 °C.
    2. Misture os tubos enquanto aquece. Nota: Este protocolo de microgel pode ser ampliado.
  2. Para encapsular moléculas nos microgéis, adicione a molécula desejada (por exemplo, ovalbumina) ao tampão PBS / TEOA / HCl, fotoiniciador e solução de PEG. Após a reticulação, a molécula ficará presa na rede de microgel.
  3. Complete cada reação de microgel, uma de cada vez. Pegue o primeiro tubo e adicione 87,5 μl de 1,5 M Na2SO4.
  4. Misture o tubo pipetando 3-5x; alternativamente, espere 30 segundos. Após a mistura, a concentração de sal será distribuída uniformemente e a solução deve ser límpida.
  5. Coloque o tubo sob a luz UV e reticule por 30 segundos. Após a reticulação, deve haver uma camada turva no topo da solução, esta camada contém os microgéis. Veja a Figura 1 para o esquema de reação.
  6. Adicione 750 μl de PBS para formar um pellet após a centrifugação e misture bem.
  7. Lave os microgéis 5 x centrifugando por 2 min a 4.000 x g para formar um pellet e trocando o sobrenadante com PBS. Nota: Não perturbe o pellet de microgel durante a troca do tampão, pode não ser possível remover todo o sobrenadante.

3. Tamanho do microgel e polidispersidade

  1. Pipetar 30 μl de microgéis a partir do pellet formado a partir da centrifugação em 1 ml de DI H2O. Para obter melhores resultados, sonice a solução de microgel em um sonicador em banho-maria por 1 hora (50-60 Hz e 1,4 A) ou misture vigorosamente para suspender os microgéis.
  2. Pipete 15 μl da solução de microgel em uma lâmina de vidro limpa e coloque a lamínula # 1,5 por cima. Vire a lâmina e a lamínula sobre um tecido de laboratório e empurre a lâmina para baixo para remover o excesso de solução e garantir que os microgéis estejam em uma única camada.
  3. Capture várias imagens dos microgéis usando uma objetiva de óleo DIC 100X. Normalmente, 5 imagens são tiradas por amostra e 3 amostras por lote são recomendadas para um total de 15 imagens. Nota: nenhuma variação de lote para lote foi observada até o momento.
  4. Meça os microgéis para obter um diâmetro representativo.
  5. Calcule a PDI usando a seguinte equação baseada em volume, na qual N é o número total de microgéis e Vi é o volume de microgel i.

4. Densidade de microgel

  1. Prepare soluções de dextrano 7, 6, 5, 4, 3 e 1 (p / v) % em DI H2O para determinar a densidade do microgel. Essas densidades foram calculadas em 1,022, 1,020, 1,018, 1,016, 1,014 e 1,010 g/cm3, respectivamente.
  2. Adicione 1 ml de solução de dextrano a 7% a um tubo de centrífuga de 15 ml.
    1. Pipetar lentamente 1 ml de solução de dextrano a 6% para formar uma camada distinta sobre o dextrano a 7%.
    2. Aguarde 5 minutos e adicione 1 ml da solução a 5%.
    3. Continue até que todas as soluções de dextrano estejam em camadas em ordem decrescente de concentração de dextrano.
  3. Coloque cuidadosamente os microgéis acima da solução de dextrano a 1%.
  4. Centrifugue o gradiente por 10 min a 4.000 x g e 5 °C. A posição do microgel após a centrifugação permitiu o cálculo simples da densidade13.

5. Inchaço de equilíbrio de microgel

  1. Para medir a massa inchada (M s) dosmicrogéis, definida como a massa após o inchaço de equilíbrio (48 horas), primeiro lave os microgéis 5x em DI H2O e inche por um mínimo de 48 horas em tubos de microcentrífuga pré-pesados.
  2. Centrifugue os microgéis por 10 min a 4.000 x g.
  3. Remover todo o sobrenadante e registar a massa húmida. Use métodos de filtragem para garantir que todo o excesso de água seja removido para obter resultados mais precisos.
  4. Congelar os microgéis a -80 °C e, em seguida, liofilizar até obter a massa seca (Md).
  5. Calcule o teor de água nos microgéis por Água% = (Ms - Md) / Md x 100.
  6. Determine o teor de polímero por Polymer% = 100 - Water% .
  7. Realize análise estatística em todos os dados usando SAS com ANOVA de n vias e teste post-hoc de Tukey. As diferenças são observadas quando p<0,05.

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Resultados

O tamanho do microgel depende das condições de polimerização. Figura 2A ilustra como o diâmetro do microgel aumenta com o aumento do peso molecular inicial do PEG e do tempo de reticulação. Imagens representativas de microgeis utilizadas para determinação de tamanho, com diferentes pesos moleculares e reticulados por 30 segundos, são mostradas nas Figuras 2C-G. Para o PEG com peso molecular de 3.000 Da, o diâmetro médio do microgel aumentou de 1,65±0,26 para 2,20±0,54 μm quando a exposiç...

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Discussão

As propriedades físicas dos microgéis de PEG foram examinadas quanto a mudanças nas condições de polimerização. Para esta reação de precipitação, uma solução tampão, solução de diacrilato de PEG a 20% (p / v) (MW 3.000, 4.600 ou 6.000 Da) e fotoiniciador foram misturados e aquecidos a 37 ° C. A adição de 1,5 M Na2SO4, um sal kosmotrófico que aumenta as interações entre as moléculas de água, fez com que o PEG precipitasse momentaneamente após sua adição. Este efeito é mais proeminente com PEG8

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Divulgações

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

O financiamento para este projeto foi feito por meio do Prêmio NSF CBET 1061834. Os autores gostariam de agradecer ao CIBA por uma amostra de fotoiniciador.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)MP Biomedical2810305
Trietanolamina (TEOA)J.T. Baker9468-01Pré-aqueça a 37 &graus; C antes da pipetagem
Ácido clorídrico (HCl)BDH AristarBDH3028
Sulfato de sódioJ.T. Baker3891-01
Irgacure 2959Ciba029891301PS04
Ovalbumina (OVA)Invitrogen34782
PEG 1.500Alfa AesarA16241
PEG 3.000Fluka03997-1KG
PEG 4.000Alfa AesarA16151
PEG 4.600Sigma373001-250G
PEG 6.000Fluka03394-1KG
PEG 10.000Alfa AesarB21955
Dextran 70TCID1449

Referências

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