Isolamento de Cortical Microglia com Imunofenótipo preservada e funcionalidades de murino Os recém-nascidos

Resumo

Uma chave para o sucesso na investigação de biologia da microglia é a preservação do immunofunction microglial ex vivo durante o isolamento a partir de tecido do SNC. Isolando microglia através de resultados de agitação rotativos em culturas de células altamente puras e imuno avaliado pela imagem fluorescente, imunocitoquímica e ELISA após a ativação da microglia com o lipopolissacarídeo estímulos pró-inflamatória (LPS) e Pam ₃ CSK ₄ (Pam).

Resumo

Isolamento de microglia de tecido do SNC é um poderoso instrumento de investigação utilizado para estudar biologia microglial ex vivo. O presente método de detalhes de um procedimento para o isolamento da microglia de córtices murino neonatal por agitação mecânica com um agitador rotativo. Esse isolamento microglia método produz microglia corticais altamente puras que apresentam características morfológicas e funcionais indicativos de microglia quiescentes em condições não patológicas normais in vivo. Este procedimento também preserva a imunofenotipagem da microglia e funcionalidade bioquímica como demonstrado pela indução de alterações morfológicas, translocação nuclear da subunidade p65 de NF-kB (p65), e a secreção de citoquina pró-inflamatória característica, fator de necrose tumoral-α (TNF-α ), ao lipopolissacarídeo (LPS) e Pam ₃ CSK ₄ (Pam) desafios. Portanto, o processo de isolamento do presente preserva a imunofenotipagem de ambos quiescente e actimicroglia motivadas, proporcionando um método experimental de investigação de biologia microglia em condições ex vivo.

Introdução

Células microgliais, os macrófagos de vigilância do parênquima do SNC, compreendem cerca de 12% da população total de células de cérebro de mamíferos adultos. Microglia são derivadas do saco vitelino mielóides células precursoras que variam em densidade celular e morfologia em diferentes regiões citoarquitecturais dentro do SNC adulto ^1-5. Em um adulto saudável do cérebro, microglia são células pequenas, ramificadas ou polares, com processos dinâmicos finas. Em contraste com a morfologia dos macrófagos periférica, microglia demonstrar um repouso, fenótipo de baixo perfil em cérebros saudáveis ​​que podem aparecer como inatividade celular, no entanto, estudos in vivo de imagens demonstram que processos microgliais estender dinamicamente e retrair para monitorar seu microambiente de uma forma que lembra " amostragem e levantamento ^"6,7.

Microglia são altamente responsivos e diferencialmente a alterações ambientais e fisiopatológicos no cérebro, a mudançaa partir de um vigilante de um estados considerados como seu repouso e activado comumente no estado efectoras, respectivamente. Esta chave na ativação pode ser mediada por um envolvimento de receptores ligados à membrana de reconhecimento de padrões (PRRs), tais como receptores toll-like (TLRs), que respondem a padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs), lipoproteínas nomeadamente bacterianas e virais derivadas , ácidos nucleicos, hidratos de carbono e ^8-11. Além de PAMPs, PRRs também foram mostrados para induzir a ativação da microglia contra moléculas estéreis, não patogênicas, conhecidos como padrões moleculares perigo / associado a danos (amortece), que representam uma perturbação na homeostase do SNC, tais como danos celulares ^12-16. Uma vez envolvido, PRRs iniciar uma cascata de sinalização intracelular, que resulta em alterações na morfologia celular e a expressão do gene da microglia, mais especificamente, a microglia activada adaptar um fenótipo amebóides semelhante, translocar o p65 de NF-kB subunidade (p65) para o núcleo da célula, e regula positivamente a producção e secreção de citocinas pró-inflamatórias, tais como fator de necrose tumoral-α (TNF-α), interleucina-1 β (IL-1β), juntamente com espécies reativas de oxigênio (ROS) ^16-24. Embora integrante da resposta imune inata do sistema nervoso central, estas moléculas segregadas também foram encontradas para aumentar o stress oxidativo neuronal, induzindo e exacerbar a neurodegeneração em estados patológicos, tais como a doença de Parkinson e doença de Alzheimer ^25-29.

No entanto, os mecanismos de ativação da microglia em estados patológicos não estão completamente esclarecidos. Portanto, o isolamento de microglia é uma poderosa ferramenta de investigação para esses processos biológicos, como muitos em características in vivo de ativação da microglia pode ser reproduzido na cultura. Vários métodos estão disponíveis para o isolamento de microglia, incluindo o isolamento por meio de um gradiente de Percoll a seguir à digestão enzimática de tecido do SNC ^30,31. No entanto, a digestão enzimática pode alterara imunofenotipagem de células por redução da superfície da célula expressão de antigénios ^{de 32,} e resulta na produção de células por animal menor do que o método aqui descrito. Especificamente, nós relatamos um rendimento médio por microglia filhote córtex de 7,5 x 10 ⁵ células, enquanto anteriormente relatados métodos de isolamento de todo CNS através de um gradiente de Percoll rendimento 3-5 x 10 ⁵ células ^30,33,34. O presente processo evita a utilização de enzimas de digestão, isolando microglia com base nas suas propriedades de baixa aderência, preservando assim a imunofenotipagem da microglia e funcionalidade.

No presente estudo, descrevemos o isolamento de células microgliais de culturas mistas gliais derivadas de heterozigotos CX3CR1-GFP (CX3CR1-GFP ^{+ / -)} neonatal e C57BL / 6 córtices murino via agitação mecânica num agitador rotativo, uma extensão do anteriormente método publicado ^24,35. Nós utilizamos o ex-tensão do mouse para fácil visualização da microglia, comoestes ratinhos expressam GFP sob o controlo do locus endógeno CX3CR1 - um promotor específico de monócitos ^36-38. Este método produz culturas microgliais altamente puros com um imunofenotipagem conservados ex vivo, como demonstrado por alterações morfológicas, a translocação nuclear de p65, e a secreção de TNF-α quando desafiados com o lipopolissacarídeo bacteriano (LPS) ou Pam ₃ CSK _4, TLR4 e TLR1 / 2 agonistas , respectivamente.

Protocolo

Antes de iniciar este protocolo, recolher os ratos neonatal nos dias pós-natal 1-3 (P1-3) em um recipiente estéril aninhados com roupa de cama gaiola original para proteção e calor. É importante trabalhar com rapidez e eficiência através deste protocolo para otimizar o rendimento da microglia. Por favor, consulte a Tabela 1 para a lista de reagentes completa.

1. Preparação de instrumentos, Meios de Cultura, e pratos

1. Preparar 10 ml / filhote Microglia Meio Completo (MCM; 1x Essencial Mínimo de Meio Earle [MEM], suplementado com: 1 mM de L-glutamina, piruvato de sódio 1 mM, 0,6% v / v D-(+)-glucose, 100 ug / ml penicilina / estreptomicina (P / S), 4% v / v de soro fetal bovino (FBS), 6% v / v de soro de cavalo), e adicionar a cada frasco T-75 (um frasco / cão); tampa e horizontalmente em lugar uma incubadora (37 ° C, 5% CO ₂₎ para se equilibrar durante 1 hora. É essencial para equilibrar este meio em frasco (s) antes de iniciar a dissecção.
2. Prepare, alíquota, e quente em 37 ° C MCM banho-maria por dissecção (6 ml / filhote de cachorro) e em um tubo cônico MCM separado para a ressuspensão celular (2 ml / filhote de cachorro). Preparar, alíquota, e frio em gelo trituração meios (MM; HBSS suplementado com: 100 mg / ml de P / S, 0,01 M HEPES, 3 ml / cão), e meios de dissecação (DM; MEM suplementado com 100 ug / ml de P / S; 2 ml / filhote de cachorro).
3. Esterilizar os seguintes instrumentos cirúrgicos por submersão em etanol 70% por 10 min: tesoura # 1 (1; decapitar), fórceps # 1 (2, para proteger o nariz e remover córtices), tesoura # 2 (1; nonangled; abrir couro cabeludo ), fórceps # 2 (1; remover couro cabeludo), fórceps # 3 (1, para remover o crânio), fórceps # 4 (2; remover meninges), tesoura # 3 (1; picar o tecido cerebral). Deixe secar ao ar em uma almofada estéril.
4. Limpe a estação de trabalho do fluxo de ar horizontal e dissecção microscópio com etanol 70%.
5. Dispensar DM em 2 estéreis, 100 milímetros placas de Petri para a captura de cabeça (3 ml, 1 prato / 3 filhotes) e dissecção (1 ml;1 prato / filhote; refrigerados em gelo antes da dissecação). Dispensar MM em um estéril, 100 milímetros placa de Petri para picar o tecido cerebral (1 ml, 1 prato / filhote de cachorro).

2. Tecido cerebral Dissecção

1. Antes da eutanásia, higienizar suavemente pescoço e cabeça de cachorro com etanol 70%, utilizando um tecido de laboratório. Com tesoura # 1, eutanásia rapidamente filhote, removendo a cabeça, cabeça de captura previamente preparado em placa de Petri. Eutanásia e completar a dissecação de um filhote de cachorro antes de prosseguir para o próximo animal.
2. Transfira a cabeça para o prato dissecção refrigerados; sob microscópio de dissecação proteger a cabeça, apertando o nariz com pinça # 1 (em alternativa, a cabeça pode ser assegurada por piercing fórceps através do soquete do olho); couro cabeludo aberto usando tesoura º 2, criando um Y-cut: começar a partir da base da cabeça e em um ângulo em direção aos olhos. Use pinça n º 3 para remover suavemente couro cabeludo, descamação lateralmente, expondo o crânio.
3. Usando fórceps # 3, retire cuidadosamente tecido conjuntivo na base dacabeça. Quando a base do crânio é exposta crânio, cuidadosamente aberta enfiando um braço de pinça entre o cérebro eo crânio (após a fissura inter-hemisférica); aderência; puxe o crânio para cima para rasgar.
4. Disrupt tecido conjuntivo sob o lado ventral do cérebro usando pinça n º 1 e, posteriormente, remover cérebro usando a mesma ferramenta. Levante o cérebro fora do crânio, utilizando uma força para cima sob o lado ventral do cérebro.
5. Mantenha o cérebro em sua posição anatômica: Lado dorsal voltada para cima para visualizar os córtices sob o microscópio de dissecação; proteger o cérebro no lugar através da inserção de pontas de uma pinça na interseção do mesencéfalo eo córtex; remover completamente meninges corticais com pinça # 4, em seguida, proceder para remover as meninges ventral. Uma vez que as meninges foram completamente removidos, os córtices separar do resto do cérebro utilizando fórceps # 4. É essencial para remover completamente o tecido das meninges para maximizar a pureza e microglia yield.

3. Tecido Cerebral Picar

1. Córtices Transferência para preparado previamente picados prato; continuar a picar passo usando técnica estéril na Classe II cabine de segurança biológica.
2. Tecido cerebral Mince usando tesoura # 3; transferência tecido picada de um tubo de 15 ml;. Lavar tesoura e picar prato com 1 ml de MM cada, recolher e distribuir lavagens para o tubo de 15 ml contendo o tecido picada Esta etapa de lavagem irá maximizar o rendimento da microglia, assegurando que todo o tecido residual é transferido para o tubo cónico. Deixe suspensão de tecido sem ser perturbado por 1-2 min, permitindo que o tecido picada para resolver na parte inferior do tubo. Não exceda 2 min como MM não contém nutrientes essenciais.
3. Cuidadosamente retire e descarte 2 ml de sobrenadante com genérico 1.000 mL micropipeta com uma ponteira standard, tornando certas para não perturbar o tecido picada resolvido.
4. Adicionar 3 ml de MCM para o tecido moído; tritura-se o tecido com força total usando um genérico 1000 ul micropipeta com uma ponta de pipeta padrão discernível n tecido sólido devem permanecer quando trituração é completa.. Adicionar mais 3 ml de MCM com a mesma ponteira, coletando amostra triturado residual da ponta da pipeta.

4. Crescer células corticais

1. Centrífuga tecido picada para sedimentar as células (215 xg, 5 min; RT; centrífuga clínica com rotor basculante). Retornar células peletizadas para a cabine de segurança biológica, remover e descartar o sobrenadante; delicadamente ressuspender o pellet celular (2 ml / tubo; MCM); adicionar o ressuspensão celular para o T-75 frasco previamente preparado; tampar a garrafa e coloque-o horizontalmente em um humidificado, incubador padrão de cultura de tecidos (37 ° C, 5% CO _2). Permitir que as células a incubar durante 24 horas.
2. Após 24 horas, bata suavemente frasco contra a palma da mão para interromperrestos de tecido. Confira as células antes e depois de tocar para garantir a completa remoção de detritos. Conjunto de frasco vertical; remover e descartar media; adicionar MCM fresco para o fundo do frasco (12 ml; 37 ° C); tampa e volte a colocar na incubadora, horizontalmente.
3. Confira as células diariamente para a contaminação e para monitorar o crescimento.
4. Em cerca de 17-21 dias in vitro (DIV), as células microgliais estará pronto para a colheita a partir da cultura mista glial. Para determinar se as células estão prontos, examinar células sob um microscópio de contraste de fase invertida. Microglia estão prontos para a colheita quando a ~ 40% de confluência. Eles aparecem como células esféricas pequenas, brilhantes, crescendo como uma monocamada em cima de outro glia.

5. Isolamento da microglia de cultura mista de glia

1. Para isolar microglia, vigorosamente tocar frasco contra a bancada de laboratório. Esta agitação ajuda microglia separadas de outras células da glia, devido às propriedades de baixa aderência da microglia.
2. Selo T-75 tampas de garrafa com Parafilm e girar as culturas gliais mistos (200 rpm; 37 ° C, 5 h). usando um agitador rotativo nonhumidified com temperatura controlada Não permitir que as células a tremer por mais de 5 horas Inspecione visualmente. que microglia ter levantado da superfície do frasco depois de 5 horas, usando um microscópio de contraste de fase invertida. Microglia são luminosos, esférico, de livre flutuação células. Haverá uma camada residual de astrócitos e oligodendrócitos que aderiram ao fundo do frasco.
3. Recolhe meios de sobrenadante contendo microglia em um tubo de centrífuga estéril cónica; microglia pelota (215 xg, 5 min; rotor basculante).
4. Ressuspender o sedimento em microglia quente Microglial Meio de Crescimento (MGM; MEM suplementado com: 1 mM de piruvato de sódio, 0,6% v / vglucose, 1 mM de L-glutamina, 100 ug / ml de P / S, 5% v / v de FBS, 2 ~ ml / frasco), determinar a concentração de células utilizando um hemocitómetro, e a placa de 1 x 10 ⁵ células / cavidade em um formato de placa de 24 poços emplástico ou deslizamentos estéreis tampa de vidro (500 mL / poço; MGM). Usando este procedimento, o rendimento médio microglia é de 7,5 x 10 ⁵ células / filhote córtex.
5. 24 horas pós-chapeamento, remova todos os meios de comunicação e as células refeed com MGM fresco (37 ° C) para remover as células flutuantes e detritos. Esta etapa é fundamental para a sobrevivência da célula e manter microglia quiescentes. As células podem ser utilizados para a experimentação imediatamente após a realimentação.

6. Tratamentos Exemplo

1. Expor as células a 10 ng / ml de Pam ₃ CSK ₄ (Pam), 10 ng / mL de lipopolissacarídeo (LPS) ou de controlo de veículo; incubar durante 2 ou 24 horas, numa incubadora humidificada (37 ° C, 5% CO _2).

7. Analisando Microglia para Funcionalidade Ex vivo via Immunofluorescent Imagem e Imunocitoquímica

1. Após o tratamento, meios de cultura de células da colheita em tubos de microcentrífuga (1,5 ml) e centrifuge usando uma microcentrífuga de mesa (2 min; 900 xg) para limpar a mídia. Transferir o sobrenadante para um tubo de microcentrífuga limpo; ensaio imediatamente, ou armazenar a -20 ° C até que esteja pronto para uso. Analisar a concentração de TNF-α em células de cultura sobrenadante através disponível comercialmente kit de TNF-α rato ELISA.
2. Lavar as células com tampão fosfato salino (PBS), e fixar as células com 4% (w / v) de paraformaldeído / 4% (w / v) de sacarose / PBS pH 7,4 (4% PFA, 15 min; RT). Após a fixação, lavar as células com PBS durante 5 min com agitação suave num agitador orbital.
   1. Imunofluorescência / Imunocitoquímica. Após a fixação e PBS lavar, processo microglia para imunocitoquímica. Todas as etapas realizadas com agitação suave. Permeabilizar as células em PBS/0.1% de triton X-100, células de bloco em PBS/10% de soro de cabra normal durante uma hora. Incubar as células S / N a 4 ° C com anticorpo de coelho anti-NF-kB (p65 subunidade, 1/1, 250) ou de coelho anti-Iba-1 do anticorpo (1/750) no tampão de bloqueio. Visualize antigénio: anticorpo a seguir à incubação com fluorescência de cabra anti-coelho conjugado anticorpo IgG secundário (1 hora, 1/1, 000). Remover o anticorpo secundário não ligado por lavagem com PBS/0.1% de triton X-100 (3 x 5 min).
   2. Células contra mancha com 4 ',6-diamidino-2-fenilindole / PBS (DAPI, 0,1 ug / ml). De visualizar o núcleo da célula Todos os derivados de microglia CX3CR1-GFP ^{+ / -} ratos expressam GFP. Utilizar um filtro de comprimento de onda de 350 nm para visualizar DAPI; de um filtro de comprimento de onda de 488 nm para visualizar GFP, e um filtro de comprimento de onda de 594 nm para visualizar p65 e Iba-1 imunocomplexos.
3. Monte lamínulas utilizando solução aquosa de montagem e visualizar microglia por microscopia de fluorescência.

Resultados

Mantendo a imunofenotipagem e funcionalidade da microglia ex vivo durante o isolamento é importante ser capaz de utilizar essas células como um modelo de investigação para a biologia da microglia. A fim de demonstrar a conservação bem sucedida da microglia immunofunctionality usando o presente método, foram isoladas a partir de recém-nascidos microglia corticais P3 (CX3CR1-GFP ^{+ / -} C57BL / 6) e as culturas tratadas quer com LPS ou Pam.

Como ilustrado na Figura 1A...

Discussão

O presente processo oferece um método eficaz para o isolamento da microglia corticais de ratinhos neonatais. Este procedimento tem um benefício duplo de 1) a preservação imunofenotipagem microglia e funcionalidade, como determinado por imagiologia fluorescente, imunocitoquímica, e ELISA, e, 2), permitindo que a microglia para amadurecer na presença de outras células gliais (astrócitos e oligodentrocytes) antes isolamento, o que pode facilitar as interações célula-célula importantes durante o período de maturação da cult...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Glicose	Sigma	G8270	Faça 20% de solução de estoque com água MilliQ; filtre esterilize; armazene a 4 ° C; Prazo de validade: 3-6 meses. Usado para fazer MCM e MGM.
Piruvato de sódio 100 mM (100x)	Hyclone	SH30239.01	Armazenar a 4 °C. Usado para fazer MCM e MGM.
Penicilina/Estreptomicina 10.000 unidades/ml (100x)	Gibco	15140-122	Armazenar a -20 °C. Usado para fazer MCM, MGM, MM e DM.
L-Glutamina 200 mM (100x)	Gibco	25030-081	Armazenar a -20 °C. Usado para fazer MCM e MGM.
Soro bovino fetal (definido)	Hyclone	SH30070.03	Filtro esterilizar; armazenar a -20 ° C. Usado para fazer MCM e MGM.
Mínimo essencial médio Earle's (MEM)	Cellgro	15-010-CV	sem L-glutamina. Contém sais de Earle. Usado para fazer MCM, MGM e DM.
Soro de cavalo	Gibco	16050	Filtro esterilizar; armazenar a -20 °C. Usado para fazer MCM e MGM.
Solução salina balanceada de Hanks (HBSS)	Cellgro	21-021-CV	Sem cálcio e magnésio. Armazene a 4 graus C. Usado para fazer MM.
HEPES 1 M	Gibco	15630-031	Loja em 4 ° C. Usado para fazer MM.
Frasco T-75	Corning	430641
4',6-Diamidino-2-fenilindo, dilactato (DAPI)	Invitrogen	D3571	Usado para corar o núcleo da célula.
Coelho anti-Iba1	Wako	019-19741	Usado na diluição de 1/750 para coloração ICC de Iba1.
Coelho anti-NFκ B (p65)	Abcam	7970	Usado em diluição de 1/1.250 para coloração ICC para p65.
Alexa Fluor 594 IgG anti-coelho de cabra (H+L)	Invitrogen	A11012	Usado na diluição de 1/1.000 para visualização do complexo antígeno:anticorpo em ICC.
Pipeta Sorológica Descartável de 10 ml	Fisher Scientific	13-678-11E
Tubo de Centrífuga Descartável de 50 ml	Fisher Scientific	05-539-8
Tubo de Centrífuga Descartável de 15 ml	Fisher Scientific	05-539-12
Placa de Petri de Poliestireno Estéril	Fisher Scientific	875713	100 mm x 15 mm
Tesoura: Metzembaum Reto (tesoura #1)	Roboz Surgical	RS-6010	1; 5 in; usado para remover a cabeça
Tesoura: Vannas (scissor #2)	Fine Science Tools	15000-08	1; não angulado; borda de corte de 2,5 mm; usado para abrir o couro cabeludo
Scissor: Student Vannas (scissor #3)	Fine Science Tools	91501-09	1; curvado; usado para picar tecido cerebral
Fórcep: Dumont #7 (fórceps #1)	Fine Science Tools	91197-00	2; usado para fixar o nariz e remover córtices
Fórcep: Dumont #2 (fórceps #2)	Fine Science Tools	11223-20	1; usado para remover o couro cabeludo
Fórcep: Dumont #3 (fórceps #3)	Fine Science Tools	11231-30	1; usado para remover o crânio
Fórcep: Dumont #5a (fórceps #4)	Fine Science Tools	11253-21	1; usado para remover meninges
Tabela de Equipamentos Específicos
Microscópio de Dissecção Estéreo Zoom	O microscópio Olympus	SZ4060	é colocado dentro do Gabinete de Fluxo Laminar-Horizontal
Gabinete de Fluxo Laminar-Horizontal	Nuaire	NU-201-330
Gabinete de Segurança Biológica	Labconco	3440001	Classe II
Incubadora de CO2	VWR	97025-836	Definido para 37 ° C, 5% CO2
Baldes basculantes	Fisher Scientific	75006441	Para ser usado com rotor basculante
Rotor basculante	Fisher Scientific	75006445	Raio máximo: 19,2 (cm)
Centrífuga Sorvall Legend RT+ (centrífuga clínica)	Fisher Scientific	75-004-377	Com rotor basculante
Microcentrífuga AccuSpin Micro 17 ( microcentrífuga de mesa)	Fisher Scientific	S98645	Com rotor de microlitro (24 x 1,5/2,0 ml; Cat #: 75003524)