Acompanhamento da evolução das Membrane Polaridade, integridade de membrana e intracelulares Ion concentrações no<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Usando corantes fluorescentes

Emily A. Clementi; Laura R. Marks; Hazeline Roche-Håkansson; Anders P. Håkansson

doi:10.3791/51008

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Artigo de método

Acompanhamento da evolução das Membrane Polaridade, integridade de membrana e intracelulares Ion concentrações no

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DOI:

10.3791/51008

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17 de fevereiro de 2014

Emily A. Clementi^*¹ , Laura R. Marks^*¹ , Hazeline Roche-Håkansson¹ , Anders P. Håkansson¹^,²^,³

¹Department of Microbiology and Immunology, University at Buffalo, State University of New York, ²Witebsky Center for Microbial Pathogenesis and Immunology, University at Buffalo, State University of New York, ³New York State Center of Excellence in Bioinformatics and Life Sciences, University at Buffalo, State University of New York

^* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Ao contrário do que a observada para eucariotos, há uma escassez de estudos que despolarização detalhes membrana e concentração de íons mudanças nas bactérias, principalmente como seu pequeno tamanho faz com que os métodos convencionais de medição difícil. Aqui, os protocolos de detalhe para monitoramento de tais eventos no patógeno Gram-positivo significativo Streptococcus pneumoniae utilizando técnicas de fluorescência.

Resumo

Despolarização da membrana e de iões de fluxos são eventos que têm sido extensivamente estudadas em sistemas biológicos, devido à sua capacidade de influenciar profundamente as funções celulares, incluindo a energética e transduções de sinal. Embora ambos os métodos fluorescentes e eletrofisiológicos, incluindo o uso de eletrodos e patch-fixação, foram bem desenvolvidos para medir esses eventos em células eucarióticas, a metodologia para a medição de eventos semelhantes em microorganismos têm se mostrado mais desafiador para desenvolver dada a sua pequena dimensão, em combinação com o mais complexo a superfície exterior de bactérias blindagem da membrana. Durante nossos estudos de morte-iniciação em Streptococcus pneumoniae (pneumococo), queríamos para elucidar o papel dos eventos de membrana, incluindo mudanças na polaridade, integridade e concentrações de íons intracelulares. Pesquisando na literatura, encontramos que existem poucos estudos. Outros pesquisadores haviam monitorado captação do radioisótopo ou equilíbrio para medir gripe íonxes e potencial de membrana e um número limitado de estudos, principalmente em organismos gram-negativos, já tinha visto algum sucesso usando carbocianina ou oxonol corantes fluorescentes para medir o potencial de membrana, ou carregar bactérias com acetoximetílico célula-permeante (AM) versões de éster de íon sensível corantes fluorescentes indicadores. Nós, portanto, estabelecido e otimizado protocolos para medir o potencial de membrana, ruptura e íon-transporte no organismo Gram-positivas S. pneumoniae. Desenvolvemos protocolos utilizando o corante de bis-oxonol DiBAC ₄ (3) e o iodeto de propídio corante célula-impermeabilizante para medir a despolarização da membrana e de ruptura, respectivamente, bem como os métodos para carregar de forma optimizada os pneumococos com os ésteres de AM dos corantes raciométrica Fura-2, PBFI, e BCECF para detectar alterações nas concentrações intracelulares de Ca ^{2 +,} K ⁺ e H ^+, respectivamente, utilizando um leitor de placas de detecção de fluorescência. Estes protocolos são o primeiro de seu tipo para o pneumococoe a maioria dos corantes não têm sido utilizados em todas as outras espécies bacterianas. Apesar de nossos protocolos foram otimizados para S. pneumoniae, acreditamos que essas abordagens devem constituir um excelente ponto de partida para estudos similares em outras espécies bacterianas.

Introdução

O nosso laboratório identificou um complexo proteína-lípido a partir de leite humano chamado ALDEOLA (por alfa-lactalbumina humana Feito letal para as células de tumor), que induz a apoptose em células tumorais, mas também é capaz de matar uma variedade de espécies bacterianas ^1,2. As espécies que se verificou serem particularmente sensíveis eram os que visam o aparelho respiratório, com o Streptococcus pneumoniae (pneumococos), exibindo a maior sensibilidade e um fenótipo semelhante a apoptose de morte ^2,3. Eventos de transporte de despolarização da membrana e de iões específica são bem descritas e eventos cruciais durante a apoptose e....