Este vídeo demonstra uma estratégia fácil e confiável para a preparação de culturas puras de células endoteliais do cérebro anterior embrionário dentro de 10-12 dias e será útil para a pesquisa focada em muitos aspectos da angiogênese cerebral.
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Artigo de método
Isolamento e cultura de células endoteliais da Embryonic posencéfalo
Neste artigo
Resumo
Resumo
Células endoteliais cerebrais embrionárias podem servir como uma ferramenta importante no estudo da angiogênese eo desenvolvimento neurovascular e interações. As duas redes vasculares do cérebro anterior embrionário, pial e periventricular, são espacialmente distinta e têm diferentes origens e padrões de crescimento. As células endoteliais das redes vasculares pial e periventriculares têm perfis de expressão de genes únicos e funções. Aqui apresenta-se um protocolo de passo-a-passo para o isolamento, a cultura, e a verificação de populações puras de células endoteliais a partir da rede vascular periventricular (PVECs) do prosencéfalo embrionário (telencéfalo). Nesta abordagem, telencéfalo desprovido de membrana pial obtido a partir do dia embrionário 15 ratinhos é picada, digeridos com colagenase / dispase e disperso mecanicamente numa suspensão de células individuais. PVECs são purificados a partir de suspensão de células utilizando selecção positiva com anticorpo conjugado com MicroBeads anti-CD-31/PECAM-1 usando um forte magnéticométodo de separação. Células purificadas são cultivadas em colágeno 1 revestidas placas de cultura em meio de cultura de células endoteliais, até que se tornar confluentes e mais subcultivadas. PVECs obtidos com esta exposição de paralelepípedos protocolo e fenótipos fusiformes, visualizadas por microscopia de luz de contraste de fase e microscopia de fluorescência. Pureza de culturas PVEC foi estabelecida com marcadores de células endoteliais. Em nossas mãos, este método confiável e consistente produz populações puras de PVECs. Este protocolo irá beneficiar estudos para obtenção de conhecimentos mecanicistas em prosencéfalo angiogênese, compreender as interacções PVEC e transversais conversações com os tipos de células neuronais e tem um enorme potencial para a angiogênese terapêutica.
Introdução
A angiogênese, neurogênese e migração neuronal são eventos críticos no sistema nervoso central (SNC) de desenvolvimento, reparo e regeneração. Vários estudos elegantes mostraram que células endoteliais estimular a proliferação neuronal e vice-versa através da liberação de fatores solúveis e pelo contato direto. Descobrimos que é curioso que na maioria dos estudos 1-3, enquanto progenitoras neuronais / células estaminais neurais são isoladas a partir do cérebro embrionário, que são co-cultivados com células endoteliais do cérebro adulto, outras fontes de tecido adulto, ou com linhas de células endoteliais. Isto pode em parte ser devido aos problemas técnico....
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Protocolo
1. Preparação de reagentes e soluções
- Revestimento de 35 mm de prato de cultura: O colagénio tipo 1 solução é fornecida como uma solução aquosa de ácido acético 20 mM (~ 100 mg de proteína / tubo de ensaio). Dilui-se um volume adequado de solução de colagénio a uma concentração de trabalho de 0,01% a partir da cultura de tecido estéril, de grau água. Pratos de revestimento com 1 ml de solução de colagénio durante 3-4 horas à temperatura ambiente (TA) ou a 37 ° C, ou durante a noite a 2-8 ° C. Retire o excesso de solução do prato revestido e deixe-a secar durante a noite. Lave o prato com água grau cultura de tecido ou PBS antes de adicionar mídia. Placas r....
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Resultados
A caracterização fenotípica dos PVECs do dia 1-12 é mostrado por microscopia óptica de contraste de fase (figura 2). As células ligadas ao prato no dia 1 mostra a morfologia característica de divisão celular (Figura 2A). Entre 5-8 dias, PVECs transição de pedra de calçada ao fuso morfologia em forma típica de células endoteliais e mais parecido com o seu estado in vivo (Figuras 2B e 2C). Por volta do dia 12, a cultura atinge PVEC confluência co.......
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Discussão
PVEC do são mais fisiologicamente relevante do que as células endoteliais adultas do cérebro e células endoteliais provenientes de outras fontes de tecidos para estudos sobre interações neurovasculares e também têm potencial terapêutico. Para a preparação PVEC, é princípio fundamental com dissecção de trabalhar rápido para conseguir uma boa viabilidade desde as células mortas pode ligar de forma inespecífica a MicroBeads CD31. Além disso, se a suspensão de uma única célula não é conseguido antes da etapa de marcação mag.......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado por uma Aliança Nacional para a Pesquisa sobre Esquizofrenia e Depressão (NARSAD) Young Investigator Award e National Institutes of Health conceder R01NS073635 a AV.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| DNase I | Sigma | D-4527 | |
| Colágeno, solução tipo 1 de cauda de rato | Sigma | C3867 | |
| DPBS | Quality Biologicals | 114057-131 | |
| EDTA | Fisher Scientific | M4055 | |
| BSA | Sigma | A2058 | |
| Coluna MS | Miltenyi Biotech | 130-042-201 | |
| Microesferas CD31 | Miltenyi Biotech | 130-097-418 | |
| Separador MACS | Miltenyi Biotech | 130-042-102 | |
| Suporte múltiplo MACS | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| Filtro de células 70 µ m | BD Bioscience | 352350 | |
| Solução antibiótica e antimicótica | Sigma | A5955 | |
| FBS Sigma | F4135 | ||
| Colagenase/Dispase | Roche | 10269638001 | |
| DMEM | Lonza | 12-604F | |
| Placa de cultura de 35 mm | BD Bioscience | 353001 | |
| Tubo Falcon de 15 ml | BD Bioscience | 352097 | |
| Tubo Falcon de 50 ml | BD Bioscience | 352098 | |
| Kit ECCM | BD Bioscience | 355054 | Kit Inclui suplemento de crescimento de células endoteliais, EGF, e Inibidor de Tripsina de Soja |
| Suplemento de Crescimento de Células Endoteliais (ECGS) | BD Bioscience | 354006 | |
| Aplicações de Células | RBECGM | R819-500 | |
| DMEM F12 | Tecnologias de Vida | 10565-018 | |
| GlutaMAX | Life Technologies | 305050-061 | |
| Água para cultura de tecidos | Life Technologies | 15230162 | |
| 0,25% Tripsina | Life Technologies | 15050 | |
| Inibidor de tripsina de soja | BD Bioscience | 5425 | |
| Matrigel | BD Bioscience | 354234 | |
| Kit de Etiquetagem de Células Qtracker 655 | Life Technologies | Q25021 | |
| Membrana de Plasma CellLight-RFP, BacMam 2.0 | Life Technologies | C10608 | |
| Anticorpo biotinilado Isolectina B4 | Sigma | L2140 | |
| Fator Anti-Von Willebrand | Sigma | F3520 | |
| Anti-CD31/PECAM-1 | BD Pharmingen | 550274 | |
| Mídia de Montagem Rígida VECTASHIELD com DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
| Ketamine | Butler Schein Animal Health Supply | 44028 | |
| Xilazina | Lloyd Laboratories | 1009 | |
| Estereomicroscópio | Motic | SMZ-168 | |
| Hemocitômetro | Fisher Scientific | 267110 | |
| Microscópio invertido | Olympus CK-40 | CK-40 | |
| Microscópio fluorescente | Olympus FSX-100 | FSX-100 | |
| Pinças finas | Roboz Surgical Instrument | 7 inox | |
| Tesoura microtip fina | Roboz Instrumento Cirúrgico | RS5611 |
Referências
- Shen, Q., S, G., et al. Endothelial cells stimulate self-renewal and expand neurogenesis of neural stem cells. Science. 304, 1338-1340 (2004).
- Milner, R. A novel three-dimensional system to ....
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Reimpressões e permissões
