Isolamento e cultura de células endoteliais da Embryonic posencéfalo

Resumo

Este vídeo demonstra uma estratégia fácil e confiável para a preparação de culturas puras de células endoteliais do cérebro anterior embrionário dentro de 10-12 dias e será útil para a pesquisa focada em muitos aspectos da angiogênese cerebral.

Resumo

Células endoteliais cerebrais embrionárias podem servir como uma ferramenta importante no estudo da angiogênese eo desenvolvimento neurovascular e interações. As duas redes vasculares do cérebro anterior embrionário, pial e periventricular, são espacialmente distinta e têm diferentes origens e padrões de crescimento. As células endoteliais das redes vasculares pial e periventriculares têm perfis de expressão de genes únicos e funções. Aqui apresenta-se um protocolo de passo-a-passo para o isolamento, a cultura, e a verificação de populações puras de células endoteliais a partir da rede vascular periventricular (PVECs) do prosencéfalo embrionário (telencéfalo). Nesta abordagem, telencéfalo desprovido de membrana pial obtido a partir do dia embrionário 15 ratinhos é picada, digeridos com colagenase / dispase e disperso mecanicamente numa suspensão de células individuais. PVECs são purificados a partir de suspensão de células utilizando selecção positiva com anticorpo conjugado com MicroBeads anti-CD-31/PECAM-1 usando um forte magnéticométodo de separação. Células purificadas são cultivadas em colágeno 1 revestidas placas de cultura em meio de cultura de células endoteliais, até que se tornar confluentes e mais subcultivadas. PVECs obtidos com esta exposição de paralelepípedos protocolo e fenótipos fusiformes, visualizadas por microscopia de luz de contraste de fase e microscopia de fluorescência. Pureza de culturas PVEC foi estabelecida com marcadores de células endoteliais. Em nossas mãos, este método confiável e consistente produz populações puras de PVECs. Este protocolo irá beneficiar estudos para obtenção de conhecimentos mecanicistas em prosencéfalo angiogênese, compreender as interacções PVEC e transversais conversações com os tipos de células neuronais e tem um enorme potencial para a angiogênese terapêutica.

Introdução

A angiogênese, neurogênese e migração neuronal são eventos críticos no sistema nervoso central (SNC) de desenvolvimento, reparo e regeneração. Vários estudos elegantes mostraram que células endoteliais estimular a proliferação neuronal e vice-versa através da liberação de fatores solúveis e pelo contato direto. Descobrimos que é curioso que na maioria dos estudos ^1-3, enquanto progenitoras neuronais / células estaminais neurais são isoladas a partir do cérebro embrionário, que são co-cultivados com células endoteliais do cérebro adulto, outras fontes de tecido adulto, ou com linhas de células endoteliais. Isto pode em parte ser devido aos problemas técnicos associados com o isolamento e cultivo de populações puras de células endoteliais do cérebro embrionário. No entanto, a angiogénese, a neurogénese e migração neuronal são eventos que ocorrem em simultâneo, em ordens de magnitude mais robusto no cérebro embrionário do que no cérebro adulto normal. A rede vascular periventricular do embryonic prosencéfalo (telencéfalo) origina a partir de um navio localizado no primórdio gânglios basais e desenvolve-se na forma de um gradiente de ordenada ventral dorsal telencéfalo por dia embrionário 11 (E11), ^4,5. Este plexo de vasos da rede vascular periventricular são distintos dos vasos pial com base em origens, localização anatômica, os padrões de crescimento e regulação do desenvolvimento ^4,5. A direção de propagação do gradiente angiogênese periventricular corresponde ao gradiente neurogenético transversal telencefálico. Dentro do telencéfalo, o gradiente de angiogénese periventricular e o gradiente de neurónios GABA migram tangencialmente sobrepõe espacialmente assim ^6. No que diz respeito ao tempo, a inclinação da angiogénese é, antes da inclinação e do neurónio GABA gradiente neurogenético por cerca de um dia. Assim, as células endoteliais periventriculares são espacialmente e temporalmente bem posicionada para fornecer pistas importantes para apoiar a neurogênese e telencefálico^4,6 migração neuronal. Portanto, o uso de células endoteliais periventriculares embrionárias em experimentos de co-cultura com células progenitoras e / ou neurônios neuronais forneceria um modelo mais favorável para o estudo de interações neurovasculares e desenvolvimento de novos caminhos para o tratamento de doenças neurodegenerativas ou da lesão cerebral isquêmica / traumático.

Ressaltamos a importância de remover a membrana pial, não só para limitar a contaminação de células epiteliais, mas também para separar as células endoteliais pial que são molecularmente e funcionalmente distinto de células endoteliais da rede vascular periventricular ^4,6 (PVECs denominado para distinguir de pial ECs) . Aqui, descrevemos o método que usam rotineiramente em nosso laboratório para obter um rendimento rico e puro de PVECs. Estas células endoteliais são preparados a partir de prosencéfalo embrionário isolado a partir de um único rato cronometrado-grávida. Eles podem ser expandidas, subcultivadas e congelado para baixo com êxito para utilização futura.

Protocolo

1. Preparação de reagentes e soluções

1. Revestimento de 35 mm de prato de cultura: O colagénio tipo 1 solução é fornecida como uma solução aquosa de ácido acético 20 mM (~ 100 mg de proteína / tubo de ensaio). Dilui-se um volume adequado de solução de colagénio a uma concentração de trabalho de 0,01% a partir da cultura de tecido estéril, de grau água. Pratos de revestimento com 1 ml de solução de colagénio durante 3-4 horas à temperatura ambiente (TA) ou a 37 ° C, ou durante a noite a 2-8 ° C. Retire o excesso de solução do prato revestido e deixe-a secar durante a noite. Lave o prato com água grau cultura de tecido ou PBS antes de adicionar mídia. Placas revestidas podem ser armazenadas a 4 ° C durante um mês.
2. Prepare Eagle Modificado por Dulbecco completo (DMEM). Suplementar o meio DMEM (500 ml) com 10% FBS e solução de antibiótico-antimicótico (concentração 1x; 1 ml/100 ml). DMEM completo pode ser armazenado a 4 ° C durante dois meses.
3. Prepara-se uma alíquota (50 ml) de meio DMEM com DNase I (0,001 mg / ml), (referido como DMEM-DNase I).
4. Preparar outra alíquota (10 ml) de meio DMEM com colagenase e dispase (1 mg / mL) (referido como DMEM-collagenase/dispase).
5. Prepare celular endotelial Meio de Cultura (ECCM, 500 ml), suplementado com EGF (5 ug), ECGS (100 mg) e 5 ul de solução de antibiótico-antimicótico. ECCM pode ser armazenado a 4 ° C durante dois meses.
6. Pré-aquecer todos os meios antes de usar.
7. Preparar tampão de purificação: PBS, pH 7,2, com 0,5% de BSA e EDTA a 2 mM. Manter tampão frio (2-8 ° C).

2. Remoção de Embriões e Dissecção da Telencéfalo

Todos os experimentos com animais de laboratório são aprovados pelos cuidados com os animais e uso de comitês de McLean Hospital e em conformidade com as diretrizes do NIH para o cuidado e uso de animais de laboratório.

1. Use ratinhos CD1 grávidas cronometrados (dia embrionário 15). O dia de tampão vaginal descoberta é considerado embrionário dia 0 (E0). Barragens CD1 geralmente produzem grandes ninhadas, então 10-12 embriãos são esperados a partir de uma barragem grávida.
2. Para histerotomia, anestesiar ratas grávidas com uma injecção intraperitoneal de cetamina (100 mg / kg) / xilazina (5 mg / kg). No caso dos ratos, aproximadamente 20-30 g, entregar 0,3 ml de uma solução anestésica de 10 ml / kg de cetamina / xilazina e assegurar que a dor e desconforto é mínima durante as injecções intraperitoneais de anestésico. Use restrição de mão para as injeções.
3. Verifique anestesia profunda por toe pitada. Retirar embriões de ratinhos anestesiados profundamente. Decapitar cada embrião imediatamente após a remoção da mãe. Coloque as cabeças embrionárias em placas de Petri estéreis em PBS gelado.
4. Siga histerectomia por eutanásia imediata com overdose de anestésico (130 mg / kg de pentobarbital, ip), um método de eutanásia, o que é consistente com as diretrizes AVMA para a eutanásia de animais: 2013 Edition.
5. Sob um microscópio estéreo, retirar o cérebro da cabeça com uma tesoura MicroTip finas e uma pinça fina. Nota: A dissecar alta qualidadeião é essencial para remover com sucesso o pial membrana do cérebro embrionário. Isto é conseguido através da prática. Uma pinça fina e tesoura MicroTip também são ferramentas fundamentais para a obtenção de uma boa dissecção.
6. Use a pinça para obter um controle firme sobre o cérebro e as tesouras MicroTip para descascar a membrana pial. Retire o mesencéfalo e metencéfalo e isolar o telencéfalo. Transferir telencéfalo pial-livre de todos os embriões para a 35 milímetros prato de cultura com 2 ml de PBS em gelo.

3. Isolamento celular

1. Picar o telencéfalo em fragmentos de 1-2 mm com uma lâmina de bisturi e recolher o tecido em um tubo Falcon de 15 ml contendo 2 ml de DMEM completo.
2. Dissociar tecido suave mas completamente com uma pipeta de 1 ml até aglomerados desaparecer e uma suspensão leitosa é alcançado.
3. Centrífuga células dissociadas em 800-1.000 xg durante 5 min à temperatura ambiente.
4. Remova cuidadosamente o sobrenadante e ressuspender o pellet em DMEM-DNase I. Gently dissociar a cells novamente utilizando uma pipeta ml e centrifugar a 800-1.000 xg durante 5 min à temperatura ambiente.
5. Ressuspender o sedimento em DMEM completo quente. Células filtrar através de uma malha de nylon estéril 70 mM. Coletar as células filtradas e manter em gelo.
6. Recolher as porções de células retidas na malha e digerir ainda mais com DMEM-collagenase/dispase (2 ml) durante 1-2 minutos à temperatura ambiente. Lavar as células 3x em DMEM-ADNase I através de centrifugação a 800-1.000 xg durante 5 min à temperatura ambiente. Agrupar as células com as células filtrados recolhidos no passo 3.5. Lave as células uma vez com DMEM totais completa. Prossiga para determinar o número de células e etapas de rotulagem magnéticos. Nota: É importante para se obter uma suspensão de célula única antes da marcação magnética.

4. Rotulagem Magnetic

1. Este protocolo mostra a rotulagem magnética de 10 ⁷ células. Para o número de células inferior a 10 ^7, use o mesmo volume de reagente e para o número de células superior a 10 ^7, escala de todos os volumes de reagentes e volumes totaisem conformidade (por exemplo, para 2 x 10 ⁷ células totais, utilizar duas vezes o volume de todos os reagentes indicados). Manter todos os reagentes e as células em gelo.
2. Determinar o número de células com um hemocitômetro.
3. Suspensão de células de centrifugar a 300 xg durante 10 min à temperatura ambiente. Aspirar o sobrenadante completamente.
4. Adicionar 90 μl/10 ⁷ células de tampão de purificação para a pelete de células seguido de 10 ul de MicroBeads CD31. Os Microbeads fornecidos pelo fabricante são conjugados a anticorpo monoclonal anti-CD31 mouse.
5. Misture bem e incubar por 15 min na geladeira. Nota: As temperaturas mais elevadas e / ou aumentando o tempo de incubação, durante a etiquetagem magnético pode resultar numa ligação não específica.
6. Lavar as células por adição de 1-2 ml/10 ⁷ células de tampão de purificação e centrifugar a 300 xg durante 10 min. Remover as células do sobrenadante e ressuspender em 500 ul de tampão de purificação. Vá para a separação magnética ou etapa de purificação.

5. Purification

1. Coloque coluna MS no campo magnético de MACS Separador.
2. Lavar coluna com 500 mL de tampão de purificação.
3. Aplicar a suspensão de células para dentro da coluna. Carregar número adequado de células para a coluna MS como o número de células mais elevada pode obstruir a coluna. Cuidado: Cada coluna MS pode acomodar um número máximo de 2 x 10 ⁷ células, para um número de células superior, utilizar mais colunas.
4. Coletar e descartar flow-through contendo células não marcadas.
5. Lavar coluna com 500 ul de tampão de purificação de três vezes. Durante as etapas de lavagem, certifique-se de que o reservatório da coluna está vazia antes de adicionar alíquotas tampão de purificação posteriores.
6. Remover coluna do separador MACS e coloque-o em um tubo Falcon de 15 ml.
7. Um êmbolo é fornecido juntamente com a coluna MS. Pipeta 1 ml de tampão de purificação na coluna de MS e imediatamente lavar as células magneticamente rotulados com firmeza empurrando o êmbolo para a coluna.
8. Placa celsl em uma placa de cultura de 35 milímetros pré-revestidos com colagénio do tipo 1 e crescer células em ECCM numa incubadora a 37 ° C com 95% _de O2 e 5% de CO _2.
9. Troca da mídia a cada quatro dias. Use PVECs para experiências ou subcultura após 10-12 dias, quando o prato é confluente.

6. Subcultura de PV ECS

1. Retire o ECCM e lavar a monocamada de PVECS com 1-2 ml de PBS estéril.
2. Adicionar cuidadosamente 1,5 ml de 0,25% de solução de tripsina-EDTA para cobrir a monocamada de células.
3. Devolver o prato para a incubadora. Dentro de 5-7 minutos, as células irão separar da superfície do prato.
4. Após as células terem destacado, imediatamente adicionar um volume igual de inibidor de tripsina e tritura-se várias vezes.
5. Transferência das células para um tubo estéril de 15 ml Falcon. Centrifuga-se o tubo a 500 xg durante 5 min.
6. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 1 ml de pré-aquecido ECCM.
7. Semente das células para a expansão da cultura, imenvelhecimento ou outros ensaios.

Resultados

A caracterização fenotípica dos PVECs do dia 1-12 é mostrado por microscopia óptica de contraste de fase (figura 2). As células ligadas ao prato no dia 1 mostra a morfologia característica de divisão celular (Figura 2A). Entre 5-8 dias, PVECs transição de pedra de calçada ao fuso morfologia em forma típica de células endoteliais e mais parecido com o seu estado in vivo (Figuras 2B e 2C). Por volta do dia 12, a cultura atinge PVEC confluência co...

Discussão

PVEC do são mais fisiologicamente relevante do que as células endoteliais adultas do cérebro e células endoteliais provenientes de outras fontes de tecidos para estudos sobre interações neurovasculares e também têm potencial terapêutico. Para a preparação PVEC, é princípio fundamental com dissecção de trabalhar rápido para conseguir uma boa viabilidade desde as células mortas pode ligar de forma inespecífica a MicroBeads CD31. Além disso, se a suspensão de uma única célula não é conseguido antes da etapa de marcação mag...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
DNase I	Sigma	D-4527
Colágeno, solução tipo 1 de cauda de rato	Sigma	C3867
DPBS	Quality Biologicals	114057-131
EDTA	Fisher Scientific	M4055
BSA	Sigma	A2058
Coluna MS	Miltenyi Biotech	130-042-201
Microesferas CD31	Miltenyi Biotech	130-097-418
Separador MACS	Miltenyi Biotech	130-042-102
Suporte múltiplo MACS	Miltenyi Biotech	130-042-303
Filtro de células 70 µ m	BD Bioscience	352350
Solução antibiótica e antimicótica	Sigma	A5955
	FBS Sigma	F4135
Colagenase/Dispase	Roche	10269638001
DMEM	Lonza	12-604F
Placa de cultura de 35 mm	BD Bioscience	353001
Tubo Falcon de 15 ml	BD Bioscience	352097
Tubo Falcon de 50 ml	BD Bioscience	352098
Kit ECCM	BD Bioscience	355054	Kit Inclui suplemento de crescimento de células endoteliais, EGF, e Inibidor de Tripsina de Soja
Suplemento de Crescimento de Células Endoteliais (ECGS)	BD Bioscience	354006
Aplicações de Células	RBECGM	R819-500
DMEM F12	Tecnologias de Vida	10565-018
GlutaMAX	Life Technologies	305050-061
Água para cultura de tecidos	Life Technologies	15230162
0,25% Tripsina	Life Technologies	15050
Inibidor de tripsina de soja	BD Bioscience	5425
Matrigel	BD Bioscience	354234
Kit de Etiquetagem de Células Qtracker 655	Life Technologies	Q25021
Membrana de Plasma CellLight-RFP, BacMam 2.0	Life Technologies	C10608
Anticorpo biotinilado Isolectina B4	Sigma	L2140
Fator Anti-Von Willebrand	Sigma	F3520
Anti-CD31/PECAM-1	BD Pharmingen	550274
Mídia de Montagem Rígida VECTASHIELD com DAPI	Vector Laboratories	H-1500
Ketamine	Butler Schein Animal Health Supply	44028
Xilazina	Lloyd Laboratories	1009
Estereomicroscópio	Motic	SMZ-168
Hemocitômetro	Fisher Scientific	267110
Microscópio invertido	Olympus CK-40	CK-40
Microscópio fluorescente	Olympus FSX-100	FSX-100
Pinças finas	Roboz Surgical Instrument	7 inox
Tesoura microtip fina	Roboz Instrumento Cirúrgico	RS5611