Artigo de método

Geração de cisalhamento Adesão Mapa Usando SynVivo Networks microvasculares sintético

DOI:

10.3791/51025

⸱

25 de maio de 2014

 ,  , 
1Biomedical Technology, CFD Research Corporation

Neste artigo

Resumo

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As câmaras de fluxo usadas em experimentos de adesão geralmente consistem em caminhos de fluxo lineares e requerem vários experimentos em diferentes taxas de fluxo para gerar um mapa de adesão de cisalhamento. O SynVivo-SMN permite a geração de mapa de adesão de cisalhamento usando um único experimento utilizando volumes de microlitros, resultando em economia significativa de tempo e consumíveis.

Resumo

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Ensaios de adesão celular / partículas são fundamentais para a compreensão das interações bioquímicas envolvidas na fisiopatologia da doença e têm aplicações importantes na busca pelo desenvolvimento de novas terapias. Os ensaios com condições estáticas não conseguem captar a dependência da adesão em cisalhamento, limitando a sua correlação com o ambiente in vivo. Câmaras de fluxo de placas paralelas que quantificam a adesão sob fluxo de fluido fisiológico precisar de vários experimentos para a geração de um mapa de adesão ao cisalhamento. Além disso, elas não representam a escala in vivo e morfologia e requerem grandes volumes (~ ml) de reagentes para os experimentos. Neste estudo, demonstramos a geração de mapa de adesão ao cisalhamento de um único experimento usando uma rede microvascular baseado dispositivo micro, SynVivo-SMN. Este dispositivo recria o complexo na vasculatura vivo incluindo escala geométrica, elementos morfológicos, as características de fluxo e interações celulares em umin vitro formato, proporcionando assim um ambiente biologicamente realista para pesquisa básica e aplicada no comportamento celular, distribuição de medicamentos, e descoberta de drogas. O ensaio foi demonstrada pelo estudo da interacção das partículas de 2 um revestido com biotina com as superfícies revestidas com avidina da microplaca. A gama inteira de corte observada na microvasculatura é obtido com um único ensaio permitindo adesão versus mapa de cisalhamento para as partículas sob condições fisiológicas.

Introdução

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Os ensaios correntes para estudar a célula-célula e as interacções célula-partículas tipicamente envolvem formato bem prato estático, em que as partículas ou as células são incubadas em matrizes de proteínas ou células aderentes. No final do tempo de incubação específico, o número de partículas aderentes ou células são quantificados usando microscopia 1. Mesmo que estes ensaios fornecem um panorama significativo para os processos bioquímicos por trás dessas interações, uma limitação importante é a falta de fluxo de fluido fisiológico (típico da microcirculação) e seu impacto sobre a adesão de partículas.

Para superar esta limitação, na câmara de fluxo in vitro têm sido desenvolvidos nos últimos anos. Um elemento comum destas câmaras de fluxo é um aparelho transparente perfundidos a baixo número de Reynolds para combinar taxas de cisalhamento de parede observadas nos vasos sanguíneos in vivo 2. A parede do vaso é modelado por qualquer revestimento de biomoléculas ou crescimento de células numa superfície do fluxo cHamber 3. Partículas 4-7 ou células 8-16 são então fluiu na faixa desejada de taxas de fluxo para quantificar o número de aderir partículas sob várias taxas de cisalhamento.

No entanto, a utilização de câmaras de fluxo de placa paralelas para estudar e validar os fenómenos bioquímicos é bastante dispendioso e moroso. Isto é principalmente devido ao fato de que as múltiplas experiências devem ser conduzidas para gerar um mapa de cisalhamento de fluidos em relação ao número de partículas / células aderidas. Além disso, as câmaras de fluxo de placa requerem grandes volumes de reagentes, devido ao seu grande tamanho (altura> 250 um e largura de> 1 mm),. Finalmente, estes dispositivos não modelar de forma precisa (por exemplo, características geométricas, bifurcações) e as condições de fluxo (por exemplo, contra os fluxos divergentes convergentes) que estão presentes in vivo.

Os recentes avanços na litografia baseada microfabricação 17-19 aceleraram o campo de lab-on-a-chipdispositivos 20-21. Estes dispositivos têm sido fundamentais para o desenvolvimento de uma versão em miniatura da câmara de fluxo de placas paralelas com dimensões no regime micrômetro. A redução da dimensão também produz benefícios significativos em termos de volumes de reagentes, células ou partículas necessária para os experimentos. No entanto, uma limitação chave dos dispositivos actualmente disponíveis é a utilização de canais lineares para modelar microvasos, que não mimetizam a microvasculatura complexo observada in vivo.

Recentemente, desenvolveu uma nova metodologia para a recriação de redes microvasculares sobre substratos de plástico descartáveis, resultando em representação sintética das condições in vivo. Estes dispositivos denominado Redes microvasculares SynVivo-sintéticos (SMN) são desenvolvidos utilizando PDMS processo soft-litografia baseia. Dispositivos SynVivo-SMN pode ser usado para obter mapa de adesão ao cisalhamento de celular / partícula adesão 22, o estudo direcionado a entrega da droga e 23 have foi validado contra dados in vivo 24-25. Neste artigo, apresentamos um protocolo que permite a geração do mapa de adesão ao cisalhamento de um único experimento em volumes tão pequenos quanto 1-5 mL, assim, resultando em significativa economia de recursos e tempo.

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Protocolo

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1. Priming o dispositivo micro-SynVivo SMN

  1. Cada porta (entrada / saída) do dispositivo é constituída por duas portas paralelas - uma para fluir em porções de revestimento de superfície (moléculas de adesão, as matrizes de crescimento, etc) e / ou de células de sementeira e o outro para a execução do ensaio (Figura 1A ).
  2. Completamente submergir o dispositivo de microfluidos SynVivo-SMN (Figura 1B) em uma placa de Petri contendo estéril desionizada (DI) e colocar o prato num exsicador de vácuo. Permitir que o exsicador para rodar até que todo o ar foi removido dos circuitos do dispositivo. Isso deve levar cerca de 15 min.
  3. Antes de retirar o dispositivo da água, coloque tubos Tygon (OD de 0,06 "e ID de 0,02") preparado com água em cada porta do dispositivo com uma pinça de ponta fina. O tubo deve ser de aproximadamente 1 cm em comprimento. O dispositivo pode agora ser removido a partir da água. Figura 1C mostra uma imagem do multenviar um e com o tubo.

2. Revestimento do dispositivo micro com proteína desejada (por exemplo, Avidin)

  1. Usando uma pipeta, colocar uma gota de água (cerca de 100 ul) à volta da base do tubo de uma porta de entrada. Remova cuidadosamente o tubo usado para preparar o dispositivo. A gota de água vai impedir que o ar que entra no dispositivo.
  2. Prepara-se uma seringa de 1 ml carregada com avidina a uma concentração de 20 ug / ml. Conecte a seringa a uma agulha de aço inoxidável 24 G e tubos. Inserir o tubo a uma das portas de entrada do dispositivo. Prenda a porta de entrada não está sendo utilizada com uma braçadeira da mandíbula.
  3. Injectar avidina a uma taxa de fluxo de 1 mL / min durante 10 min para permitir a perfusão completa do dispositivo. No final do tempo de escoamento, apertar o tubo com o grampo de mandíbula e colocar o dispositivo a 4 ° C durante a noite.

3. Fluindo o Biotinylated Partículas para experimentos de adesão

  1. Permitir que o dispositivovoltar à temperatura ambiente. Colocar o dispositivo sobre um microscópio invertido de fluorescência equipado com um estádio motorizado e uma câmara de alta performance.
  2. Prepara-se uma solução de 2 mM partículas biotinilados numa concentração de 5 x 10 6 / ml, em partículas de Tampão Fosfato Salino (PBS). Carregar as partículas numa seringa de 1 ml. Prepara-se uma segunda seringa de 1 ml de PBS apenas. Coloque cada seringa em uma bomba de seringa e se conectar a agulha e tubos.
  3. Usando uma pipeta, colocar uma gota de água (cerca de 100 ul) à volta da base do tubo da porta de entrada. Cuidadosamente remover a tubagem utilizada para o revestimento do dispositivo. A gota de água vai impedir que o ar que entra no dispositivo.
  4. Insira com cuidado o tubo de partículas para biotinilados e PBS a partir do passo 3.2 em cada uma das portas de entrada. Figura 2A mostra imagem do set-up.
  5. Começam a injectar partículas biotinilados a um caudal de 2,5 mL / min. Monitorar a porta de entrada no microscópio. Ao primeiro sinaldas partículas, começa a contagem regressiva e continuar o fluxo por 3 min.
  6. No final dos 3 minutos, parar o fluxo de partículas biotinilados enquanto simultaneamente encarando o fluxo de PBS a uma taxa de fluxo de 2,5 mL / min. Permitir PBS a fluir no dispositivo por 3 min para lavar partículas livres.

4. Aquisição de Imagens e tornando a área de interesse (AOI) Medidas Usando Software Imaging (NIKON Elements)

  1. Use a função "imagem grande varredura" no software de imagem para obter a imagem de todo o dispositivo.
  2. Número sequencialmente as bifurcações do dispositivo e criar uma AOI circular com duas vezes o diâmetro dos canais. Neste caso, definir o diâmetro AOI a 200 um, uma vez o diâmetro do canal é de 100 um.
  3. Use a função de contagem automática no software de imagem para exportar o número de partículas em cada AOI para uma folha de MS Excel.
  4. Da mesma forma, usar o recurso de contagem automática para exportar o número de partículas em toda adispositivo.

5. Partículas Análise de Fluxo Utilizando Dinâmica dos Fluidos Computacional (CFD) Modelos

  1. Simulações de CFD são executados através de software disponível comercialmente (CFD-ACE +, ESI Inc.) para a topologia dispositivo SynVivo-SMN. Os resultados são armazenados numa base de dados para a análise de observações experimentais. Os resultados da simulação armazenar informações sobre as taxas de cisalhamento de parede, velocidade, fluxo de partículas e de adesão no dispositivo.
  2. Os resultados de simulação são usados ​​para determinar o número de partículas que entram cada AOI com base em uma dada concentração de partículas de entrada.

6. Geração de cisalhamento Adesão Mapa

  1. Calcular% de adesão através da divisão das partículas aderentes na bifurcação das partículas que fluem na bifurcação, como mostrado na equação 6.1.
    figure-protocol-1
    em que o número de partículas aderidas e as partículas fluem são obtidos a partir de protocolo os passos 4.3 e 5.2, respectivamente.
  2. Traçar o mapa de adesão ao corte com base na taxa de cisalhamento em cada bifurcação das redes obtidas a partir da base de dados na etapa (5.1) e os valores de aderência% obtidos a partir da equação 6.1.

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Resultados

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A Figura 1A mostra uma de uma imagem de campo brilhante e esquemática do dispositivo SynVivo-SMN. Figura 1B mostra o dispositivo SynVivo-SMN montado sobre uma lâmina de vidro. Figura 1C mostra o dispositivo com tubo seguinte priming com água num exsicador de vácuo.

A Figura 2A mostra uma imagem do experimental-configurado. Figura 2B mostra um típico dispositivo revestido de avidina SynVivo-SMN após a ligação...

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Discussão

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Câmaras de fluxo de placas paralelas, proporcionando insights significativos sobre as interacções célula-célula e célula-partículas, sofrem de várias limitações, tais como o elevado consumo de reagentes e a necessidade de vários ensaios experimentais para gerar um mapa de adesão de cisalhamento. O uso de redes microvasculares SynVivo-sintéticos (SynVivo-SMNs) permite a geração de um mapa de adesão ao cisalhamento de um único experimento em condições que imitam as condições in vivo. Além disso, uma economia sign...

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Divulgações

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Taxa de publicação deste artigo patrocinado pela CFD Research Corporation.

Agradecimentos

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Tecnologia SynVivo foi desenvolvido sob concessão # 2R44HL076034 do NHLBI.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
CFDSynVivo-SMNSMN-001Exclusiva na CFDRC
CFD-ACE+ESI Inc.N/A
AvidinInvitrogen43-4401Qualquer fonte de avidina funcionará para este ensaio
Partículas BiotiniladasPolysciences24173-1Qualquer fonte de partículas biotiniladas funcionará para o ensaio
Tygon TubingVWR63018-044O tamanho é típico para uso com SynVivo-SMN
Elementos NIKON InstrumentosNIKONN/AQualquer outra imagem software pode ser usado
Pesquisa de

Referências

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