Técnicas fisiológicas e anatômicas são demonstrados para lidar com a função e estrutura para proprioceptores articulares e receptores de tensão muscular em membros de passeio de crustáceos.
Artigo de método
Propriocepção e tensão Receptores em Caranguejo Limbs: Exercícios Laboratório Student
Neste artigo
Resumo
Resumo
O principal objetivo desses procedimentos é o de demonstrar para fins de ensino e pesquisa como gravar a atividade dos neurônios sensoriais primários vivendo responsáveis pela propriocepção como eles estão detectando posição conjunta e movimento, e tensão muscular. A atividade elétrica de proprioceptores crustáceos e receptores de tensão é gravado por instrumentação neurofisiológica básico, e um transdutor é usado para medir simultaneamente força que é gerada pela estimulação de um nervo motor. Além disso, demonstramos como marcar os neurônios para uma rápida avaliação de sua disposição anatômica ou para fixação permanente. Coloração revela organização anatômica que é representante de órgãos chordotonal na maioria dos crustáceos. Comparando as respostas nervosas tensão às respostas proprioceptivo é uma ferramenta de ensino eficaz na determinação de como estes neurónios sensoriais são funcionalmente definidos como a anatomia e está correlacionada com a função. Três técnicas de coloraçãosão apresentados permitindo aos pesquisadores e instrutores para escolher um método que é ideal para o seu laboratório.
Introdução
A propriocepção é a sensação de posição dos membros e movimento que permite que o comportamento motor coordenada. Propriocepção consistem em posição (estático) e movimento (cinestésicas) receptores. Em insetos e crustáceos, os órgãos chordotonal são as estruturas que fornecem essas informações para o SNC 1. Nem todos os órgãos chordotonal abrangem um conjunto, mas eles ainda podem monitorar movimentos articulares devido ao seu apego às apodemes (tendão como estruturas), que abrangem todo o conjunto e se movem em associação com o músculo esquelético e articulação conjunta. Pernas de caranguejo tem seis articulações, cada uma tendo um ou dois órgãos chordotonal 2. Normalmente, um órgão chordotonal tem 60-100 ou mais neurônios sensoriais embutidos dentro de um fio elástico, neurônios que sinalizam posição conjunta estática, direção e velocidade do movimento 3-6. A entrada a partir de órgãos chordotonal em cada junta e perna é então processado centralmente permitindo movimentos coordenados dos animais.
As forças que produzem os músculos da perna durante as contrações isométricas e isotônicas são detectados por receptores de tensão associados com as fibras musculares e seus anexos a apodemes7-9. Nos protocolos de curta perna de crustáceos que se seguem apresentamos metodologia para gravações de neurônios sensoriais primários que monitoram a propriocepção e os neurônios que respondem a forças geradas por fibras musculares. Também é apresentada uma técnica para activar os movimentos das pernas e quantificar a geração de forças, bem como técnicas de anatómicas que podem ser utilizados para caracterizar o arranjo destas estruturas do sistema nervoso periférico.
Os procedimentos demonstrados abaixo permitem a análise estrutural e funcional dos neurónios que enervam os dois tipos de receptores em relação à sua localização sobre um fio elástico e chordotonal apodeme. Para ilustrar, usamos o propodite-dactylopodite (PD) órgão chordotonal, o órgão que abrange o segmento mais distal da perna de caranguejo 3.Embora estudos eletrofisiológicos detalhados começou na década de 1930 e ainda estão sendo realizadas hoje, alguns aspectos tornaram-se conhecidos sobre as conexões segmentares de proprioceptores nas diversas articulações e seus papéis no controle coordenado de muscles10-16. Estabelecer a relação estrutura-função entre os órgãos proprioceptivos, músculos e do sistema nervoso irá ainda ajudar a definir esses papéis. Por exemplo, a rotulagem do somata e terminações distais dos neurônios tensão inseridos no apodeme irá revelar sua localização em relação às fibras musculares 8,17-21.
Apresentamos três técnicas de coloração para as pernas de crustáceos que podem ser utilizados na investigação ou laboratórios acadêmicos. Coloração azul de metileno fornece o contraste adequado para músculos e nervos e é recomendado como uma técnica simples para os alunos aprenderem anatomia. Labs, que têm configurações de microscopia de fluorescência pode realizar a coloração mais neuronal selectiva expondo brevemente o nervos para o corante vital 4-di-2-ASP. A terceira alternativa é CoCl 2 aterramento, que mancha e corrige os neurônios, e não necessita de imagens de fluorescência. Embora seja trabalho e tempo intensivo, este processo de coloração dá alto contraste e especificidade para os nervos que são preenchidos. Juntas, essas técnicas podem ser usadas para comparar vários órgãos chordotonal, não apenas dentro de um membro ou entre os membros, mas também entre outros crustáceos e insetos espécies 20-22. Caranguejos azuis (C. sapidus) usados em gravações fisiológicas e para a coloração anatômica estão prontamente disponíveis em todo a fronteira sul e sudeste dos Estados Unidos. Esta espécie serve como um representante dos arranjos nervosas chordotonal e tensão encontrados na maioria dos caranguejos. Laboratórios na costa oeste vai preferir usar o muito maior caranguejo Dungeness (magister Câncer) para estes experimentos.
Protocolo
1. Dissecção e registro da atividade elétrica do nervo Propodite-dactylopodite (PD)
- Segure o caranguejo em toda a carapaça por trás, e evitando as garras, aperte a parte proximal do meropodite com uma pinça. A perna vai autotomize para evitar que o animal sangrando até a morte. Tenha cuidado ao manusear caranguejos azuis como eles são bastante agressivo e muito rápido.
Figura 1. Primeiro andar perna de um caranguejo. A localização anatômica de órgãos chordotonal (regiões nascidos) estão sobrepostos a este esquema. A cabeça de seta dupla indica onde transecto a perna para os experimentos nervosas PD. Clique aqui para ver a imagem ampliada . - Faça um corte entre o propodite e carpodite. Descarte o carpopodite e t ele anexa meropodite (Figura 1).
- Cortar uma grande janela na cutícula no lado pigmentado (lateral) da propodite com um bisturi, com uma lâmina de # 11 (Figura 2 e 3) Nota:. Não corte profundamente.
- Remover a camada de cutícula por deslizamento por baixo da lâmina de bisturi e paralelo à cutícula. Este separa as fibras musculares associadas à cutícula.
- Usando a mesma técnica cortar uma pequena janela no lado pigmentless (medial) do propodite, mas deixe o côndilo (o conjunto de soquete ou dobradiça entre os segmentos) penhora intacta.
Figura 2. Corte ao longo da linha pontilhada no propodite. Clique aqui para ver a imagem ampliada .
n "src =" / files/ftp_upload/51050/51050fig3.jpg "width =" 500px "/>
Figura 3. Exponha o nervo na janela (as setas delinear o feixe de nervos). Clique aqui para ver a imagem ampliada . - Prepare um prato Sylgard-alinhado que contém caranguejo salina para fixar a preparação para baixo Nota:. Ver Tabela 1 para espécies receitas salinos específicos.
- Localize o órgão PD cuidadosamente sondagem com as agulhas de vidro polido de fogo. O fio elástico abrangendo o conjunto tem uma aparência de prata.
- Retire as fibras musculares que obscurecem a sua visão do órgão a partir de ambos os lados do tendão. Tenha muito cuidado para não ferir o órgão PD ou a coragem.
- Uma vez que este foi realizado, com firmeza recolocar a preparação para o prato com o lado do pigmento (lateral) voltada para cima (Figura 4).
Figura 4. Exposed órgão PD e nervo. Clique aqui para ver a imagem ampliada . - Siga o nervo órgão PD no propodite tanto proximal quanto possível, a fim de libertar-se de um longo período de nervo (1,5 cm) para fins de registro. Este é o melhor feito enquanto o nervo PD ainda é ligado ao principal nervo da perna.
- Depois de separar o nervo PD da principal nervo da perna com a ajuda de agulhas de vidro, cortar o nervo PD proximal com a tesoura de íris Nota:. Não esticar ou puxar no nervo durante a dissecção.
- Mover o dactylopodite para uma posição estendida e totalmente flectido. Tome nota sobre o local onde as posições de flexão e extensão são extremas e um ponto no meio do caminho para uso posterior.
- Coloque um fio de terra no interior do banho de solução salina.
- Ligue o ehardware de gravação lectrophysiology / software Nota:. Nossa instalação foi descrito anteriormente 23.
- Posicionar o microscópio de modo que ela é com vista a platina do microscópio. Uma vez que o prato preparação é colocada no palco, você terá que ajustar a posição do feixe de iluminador de alta intensidade para melhor visualizar a preparação.
- Posicione o micromanipulador para que o conjunto de eletrodos de sucção ligado terá fácil acesso ao banho de solução salina e preparação. O eléctrodo de sucção é construído como se mostra numa linha de vídeo 24.
- Para detectar a atividade neural, desenhe o corte final do nervo PD para o eletrodo de sucção.
- Mova o dactyl todo posições estendidas e flexionadas para vários ciclos, com o auxílio de uma sonda de vidro ou passador de madeira.
- Em seguida observar a atividade quando o dáctilo é fixado nas posições estendidos, flexionados e meados.
2. Registro da atividade elétrica da tensãoNerve enquanto Monitoramento da força,
- Determinar o lado medial e lateral da perna. O lado medial tem uma textura macia, que pode ser sentida por aperto suave na região meropodite com uma unha.
- Coloque este cutícula macia voltada para cima no prato. O nervo motor excitador que inerva o músculo abridor também inerva o músculo maca no carpopodite.
- A fim de estimular o músculo abridor o nervo motor maca na região carpodite é isolado e estimulado com um eletrodo de sucção. A parte proximal da perna é removida por seccionar o meropodite com uma tesoura.
- Remover uma secção da cutícula na região do carpo, no lado interior (o lado medial, Figura 5A).
- Corte o apodeme do músculo bender e remover o músculo cuidadosamente para não puxar o principal nervo da perna para fora da cavidade perna (Figura 5B, C observe as setas para onde Bender apodeme é separado). O principal nervo da perna e um sutiãNCH para o músculo tensor pode então ser observado (Figura 5D).
- Encontre o nervo ramificação do feixe de nervos para o músculo principal maca (Figura 5E, a seta). Isso pode ser cortado próximo ao músculo ea puxou para um eletrodo de sucção para estimular (Figuras 5F e G, a seta mostra o ramo).
- Provoque uma secção do nervo que se projeta para o abridor sem beliscar o nervo. Transecto o nervo motor maca / abridor.
- Puxe o nervo motor para o eletrodo de sucção e depois estimulá-lo.
- Para expor o músculo abridor e tensão nervosa remover o músculo mais próximo e na região ventral do propodite. Corte o músculo mais estreita com um bisturi com lâmina n º 11, no propodite (Figura 6) Nota:. Não corte profundo na região proximal, pois pode danificar o nervo motor abridor.
Figura 5. Passos de dissecação para a exposição do neurônio motor para estimular o músculo opener. Clique aqui para ver a imagem ampliada .
Figura 6. Corte a cutícula na metade ventral do propodite para expor o músculo mais próximo para que ele possa ser removido. Clique aqui para ver a imagem ampliada . - Troque a solução salina com soro fisiológico resfriado fresco durante todo o processo de dissecção para manter os neurônios vivos. Para mais dissecção, coloque a preparação prato sob um microscópio de dissecação e usar iluminação de fibra óptica.
- Retirar cuidadosamente o tendão mais perto do seu apego ào dáctilo com uma tesoura de tamanho médio pontiagudo.
- Tenha muito cuidado para não perturbar os ramos para o músculo abridor da principal nervo da perna, que deve ser claramente visível.
- Remova e descarte o músculo mais perto e tendão.
- Faça um buraco no dáctilo com um pino de dissecação. Este furo irá ser mais tarde utilizado para ligar o pino de metal sobre a tensão (força) do transdutor, mas é necessário para fazê-lo nesta fase do procedimento.
- Localize o ramo do nervo que se projeta para o músculo abridor e apodeme na região distal do músculo opener. Sondar cuidadosamente o nervo com a ferramenta de vidro polido-fogo.
- Observar a tensão nervosa que surge a partir da extremidade distal do apodeme e prossegue para o feixe de nervos motores.
- Para detectar a atividade neural, preencher um eletrodo de sucção com caranguejo salina e desenhar o corte final do nervo tensão abridor para o eletrodo. Verifique se o eletrodo de sucção se encaixa bem no nervo.
- Examine para a Neural correlato de tensão passiva no apodeme abridor. Durante a gravação da atividade elétrica do nervo tensão, gire o dactyl rapidamente num conjunto alargado (ou seja, o alongamento do músculo abridor).
- Em seguida, teste de desenvolvimento força ativa em relação à freqüência de estimulação.
- Fixe firmemente um gancho de metal para que a ponta do anzol passa por um pequeno buraco no dáctilo.
- . Conecte a outra extremidade do gancho de metal para o transdutor de força Nota: Certifique-se o transdutor está em um ângulo de 90 ° de cada vez, de modo que o pino é perpendicular ao transdutor de detecção máxima da força gerada.
- Puxar o gancho e dactyl de modo que é de cerca de um ângulo de 45 ° em relação ao conjunto de abertura.
- Agora estimular o nervo motor a 100 Hz para 250 ms e medir a força, bem como a freqüência de disparo do nervo tensão.
- Colocar o conjunto para uma posição completamente estendida, de modo que as fibras musculares abridor flácido.
- Stimulate o nervo motor a 100 Hz para 250 ms e medir a força, bem como a freqüência de disparo do nervo tensão.
- Dobre / flexionar a articulação para que ele seja totalmente flexionado (~ 90 °). Nesta posição, as fibras musculares do abridor está completamente esticado. Pode haver alguma força medida pelo transdutor devido a este estiramento passivo do músculo.
- Estimular o nervo motor a 100 Hz para 250 ms e medir a força, bem como a freqüência de disparo do nervo tensão.
- Depois de medir uma força, proceder de uma série de frequências diferentes: 20, 40, 60, 80 e 100 Hz durante 8-10 segundos em cada posição da articulação.
- Meça a resposta com uma liberação de tensão rápida. Organizar a preparação, de modo que o gancho sobre o transdutor de força pode ser facilmente empurrado para fora do furo no dactyl.
- Dobre / flexionar a articulação para que ele seja totalmente flexionado (~ 90 °). Agora estimular o nervo motor de 100 Hz, com uma estimulação contínua de 5 seg.
- Após o primeiro em segundad ou menos, como a tensão se acumulou no músculo abridor, empurrar o pino para fora do buraco no dáctilo.
- Examine a gravação nervo tensão antes e depois da liberação do pino segurando o dáctilo.
- Efeitos moduladores de substâncias neuroactivos, tais como a octopamina, serotonina, e proctolin, que alteram a produção de neurónios de tensão, pode ser determinada pela adição destas moléculas para os meios de comunicação de banho sobre o músculo abertura exposta e repetindo as experiências.
- Usar uma pipeta de gotejamento e 1-2 ml durante a preparação.
3. Estruturas do Sistema Nervoso Periférico Coloração em Crustáceo Andando Legs
- Técnica de azul de metileno
- Diluir solução estoque de cloreto de azul de metileno uma parte (0,25%) com duas partes de água destilada.
- Adicione esta mistura de cinco partes de salina. Completamente irrigar a área de interesse.
- Dissecar uma perna de acordo com o protocolo na seção 1. Incubar a préparação da solução de azul de metileno a 12-13 ° C.
- Examine a preparação a cada 10-15 min com o microscópio de dissecação com uma iluminação de baixa intensidade para acompanhar o progresso da coloração. Em alguns casos, a coloração será concluída em uma hora, em outros, pode tomar durante a noite.
- Técnica 4-di-2-ASP
- Corantes fluorescentes podem ser usados para fazer a encher o neurónio PD ou manchar directamente a preparação do banho. No entanto, um microscópio adequado com habilidades para ver a mancha fluorescente é necessária.
- Dissecar uma perna de acordo com um protocolo na seção 1.
- Incubar a preparação numa concentração de 10 uM de solução de 4-Di-2-ASP e deixar a preparação no frigorífico durante 15 min. Use solução apenas o suficiente para cobrir a preparação.
- Fotografar os preparativos rapidamente e evitar o excesso de exposição à luz de mercúrio. Este corante fluorescente diminui relativamente depressa.
- Técnica de cloreto de cobalto
- Exponha o nervo PD de acordo com o protocolo na seção 1 e mantê-lo imerso em solução salina fria.
- Faça uma vaselina bem para segurar o CoCl 2. Se qualquer CoCl 2 transborda para o banho salina toda a preparação vai manchar preto, ea preparação deve ser descartada.
- Deslizamento um pequeno corte de uma folha de poliestireno, para fazer uma plataforma de plástico, e fixá-lo de tal forma que não irá flutuar ou tornar-se imerso no banho de solução salina (Figura 7).
Folha de poliestireno Figura 7. Com pinos para segurar no lugar no prato. Clique aqui para ver a imagem ampliada . - Ejetar vaselina de uma agulha hipodérmica fina presa a uma seringa descartável,em seguida, fazer uma barreira (um círculo pode funcionar bem), que deve ser de cerca de 1-1,5 mm de altura, exceto para um "V" raso no ponto médio onde o nervo será envolto em, em cima do recibo de poliestireno.
- Adicione uma pequena poça de solução salina em ambos os lados da barreira perto do "V". Tomando cuidado para não esticar ou comprimir o nervo, levante com cuidado o nervo do prato e colocá-lo na poça salina na vaselina também.
- Trabalhe rapidamente para que a secção do nervo não secar, cuidadosamente ejetar vaselina para cobrir o nervo exposto. Agora teste a barreira com soro fisiológico e se certificar de que não está vazando.
- Blot distância salina no interior da barreira e ver se ele enche quando o banho de solução salina é elevada em torno da parede de vaselina para ter a certeza de que os dois lados estão isoladas uma da outra (Figura 8).
ng> Figura 8. Vaselina bem com nervo salina e PD abrangendo o bem. O nervo PD não foi cortado ainda. Clique aqui para ver a imagem ampliada . - Pavio fora a solução salina na cavidade usando um pedaço de papel de seda. Evite deixar o papel de embrulhar o nervo.
- Faça uma nova poça usando algumas pequenas gotas de água destilada e, em seguida, corte a extremidade do nervo. Tenha muito cuidado para não puxar o nervo através da barreira ao fazer o corte. O choque osmótico da água destilada vai "balão" os axônios.
- Dentro de 30 segundos adicionar uma pequena gota de CoCl 2 para a água, absorver essa solução, e em seguida, adicione 2 CoCl suficiente para formar uma poça sobre esta seção reduzida do nervo (Figura 9). Os preparativos são melhor mantidas resfriadas a 13 ° C por 12-24 horas.
"width =" tp_upload/51050/51050fig9.jpg 500px "/>
Figura 9. Nervo O PD corte serem expostos a CoCl2. O nervo corte incha na presença de água, que facilita e acelera o movimento das moléculas de corante através dos axônios para os corpos celulares dos neurônios. Clique aqui para ver a imagem ampliada . - Retire as poças umidificação. Blot afastado da solução de cobalto através de um tecido e lavar os restos de cobalto, com várias mudanças de solução salina.
- Transferir a preparação isolada de um pequeno prato de vidro de Petri contendo cerca de 10 ml de solução salina de caranguejo. Os neurónios são lavadas e os passos seguintes são realizados in situ. Boas ferramentas de metal não devem ser usadas para lidar com a preparação após esta etapa (você deve usar ferramentas específicas que não são para ser usado em um momento posterior para a fisiologia).
- Adicionar 1-2 gotas de sulfureto de amónio (NH4) 2 S para a solução salina. Tampe o (NH 4) 2 S garrafa com força e colocar de volta no capô. Observe a reação na preparação sob um microscópio de dissecação
- Dentro de 1-2 min, os neurônios cheios de cobalto e seus processos devem começar a aparecer, porque eles vão manchar preto.
- Depois de 5-10 min, substitua a solução de desenvolvimento com solução salina fresca.
- Certifique-se que a solução de desenvolvimento que você tenha derramado no ralo da pia é seguido por água corrente por alguns minutos ou em um frasco de resíduos com tampa.
- Despeje a solução salina e fixar a preparação nervo por cerca de 15 min, com duas mudas de solução fixadora de Bouin. Para tecidos maiores, como o músculo-rolhas (para corar tensão neurónios), aumentar a duração da fixação de 30 min.
- Desidratar em uma série de ordem crescente da concentração de etanol com início em 70% (isto é, 70%, 80%, 90%, 100%). Cerca de 10 minutos a cada concentração é suficiente parapequenas tecidos.
- Após cerca de 10-15 minutos em duas mudanças de etanol a 100%, limpar o tecido através da substituição de etanol com 100% de salicilato de metilo. A preparação vai ficar nesta solução permanente para a visão repetida. Com o tempo, as células preenchidas serão mais evidentes, porque o tecido circundante se tornará mais claro. Métodos de intensificação pode ser usado para ajudar a evitar o desbotamento ao longo do tempo 25.
- Utilizar o mesmo processo para encher o nervo tensão com CoCl2. No entanto, alterar a solução de etanol várias vezes em cada passo de desidratação de etanol e incubar a preparação no interior de álcool para cerca de 20 minutos para cada etapa de desidratar completamente os músculos e permitir-lhes para limpar bem.
Resultados
Quando o órgão de DP é estirada, estendendo totalmente o conjunto, a actividade do nervo PD é robusta durante o movimento, conforme mostrado para o primeiro segundo a Figura 10. Alguma actividade permanece enquanto é ainda mantida na posição de aberta. Esta atividade é a partir dos neurônios sensíveis à posição estáticos (segunda metade da gravação mostra a Figura 10). Movimento evoca uma resposta durante o deslocamento, e o disparo é principalmente presente durante o alongamento da cadeia chordotonal (Figura 11).
Uma análise mais aprofundada dos picos podem ser prontamente abordado por triagem as amplitudes relativas. Esta é uma abordagem para demonstrar diferentes populações de neurônios sensoriais sendo recrutados para posições ou tipos de movimentos 5. Amplitudes típicas variam 0,25-1,5 mV, mas esses valores estão dependentes da resistência (isto é, aperto) da vedação do eléctrodo de sucção. A freqüência de picos de tele várias faixas de tamanho também pode ser representado graficamente para análise.
Forças geradas pelo músculo abertura no que diz respeito à frequência de estimulação pode ser comparado pela sobreposição dos respectivos vestígios de tempo de tensão em cima umas das outras (Figuras 13A e B). Isto também pode ser realizado para cada posição de articulação em cada dada frequência de estimulação. Actividade do nervo tensão pode então ser correlacionado com a quantidade de força relativa gerada em cada frequência de estimulação, e para cada posição de articulação. Como no nervo PD, uma variedade de amplitudes de pico são vistas em resposta à contracção do músculo do abridor (Figura 13C).
Arranjo anatômica de neurônios na perna curta é claramente observado com a coloração azul de metileno (Figura 14). Observe o fio e tensão neurônio chordotonal elástica que fica perto da apodeme. Vários somata com diferentes diâmetros umd locais específicos também são visíveis nesta figura. O curso total do nervo e tensão nervosa motora maca são mostrados na Figura 15. Neurónios individuais do nervo PD são mostrados com maior contraste, utilizando 4-Di-2-ASP (Figura 16) e CoCl2 (Figura 17) Backfill técnicas. Em alta ampliação das terminações sensoriais pode ser visto dentro dos scolopales de apoio (Figura 16B) 21,22,26.
Figura 10. Mova e mantenha a 0 °. Os neurônios dinâmicos são robustos em disparo durante o movimento e picos de neurônios sensíveis estáticos estão presentes, enquanto o conjunto é mantido aberto. Clique aqui para ver a imagem ampliada </ A>.
Figura 11. Rápida aberta e fechamento de totalmente flexionado na posição estendida (90-0 º). Clique aqui para ver a imagem ampliada .
Figura 12. Picos extracelulares gravados a partir do nervo PD. A junta está totalmente estendido e, em seguida, moveu-se rapidamente para um ½ posição de flexão e, em seguida, realizou ainda. Observe a atividade durante o movimento e diminuição da atividade, quando estático. Clique aqui para ver ampliado image.
Figura 13. As forças relativas que são desenvolvidos com a articulação totalmente flexionado e estimulado nas várias freqüências. (A) os traços de tensão em tempo do transdutor de força são mostrados com cada freqüência de estimulação. (B) Os traços no painel A são sobrepostas em cores diferentes para facilitar a comparação. (C) em tempo de tensão vestígios de atividade elétrica gravados a partir do nervo tensão quando o nervo motor foi estimulada a 80 Hz. Nota do padrão regular dos artefactos do estímulo em comparação com a actividade neuronal. Além disso, observe as várias amplitudes das respostas neurais. Clique aqui para ver a imagem ampliada .
Figura 14. Metileno mancha azul da preparação curta perna. Somas individuais são mostrados com suas terminações sensoriais projetando para o fio elástico. Perto do apodeme um neurônio tensão é mostrado. Clique aqui para ver a imagem ampliada .
Figura 15. O nervo tensão decorrente da extremidade distal (setas vermelhas) e juntando-se o nervo motor (seta verde). Clique aqui para ver a imagem ampliada .
Figura 16. (A) Um back-preenchimento do nervo PD em Cancer magister com 4-Di-2-ASP. (B) Maior aumento de terminações sensoriais. Clique aqui para ver a imagem ampliada .
Figura 17. Os neurónios que foram preenchidos com CoCl2 e processados (A). Esboço rastreada da preparação manchado mostrado (B). Clique aqui para ver a imagem ampliada .
| Salina | g / L |
| NaCl | 27.29 |
| KCl | 0,81 |
| MgSO 4 • 7H 2 O | 4,81 |
| CaCl 2 2H 2 O • | 1.85 |
| Na 2 SO 4 • 10H 2 O | 0,97 |
| Dextrose (D-glicose) | 1.982 |
| Ácido HEPES | 0,476 |
| HEPES sal | 2.08 |
| Ajustar a pH 8,1 com NaOH ou HCl |
Tabela 1. Receitas para caranguejo salina.
Discussão
O objectivo deste conjunto de experimentos é 1) para ensinar e expor os princípios fundamentais de gravações extracelular de um órgão proprioceptivo identificáveis e nervo tensão e 2) de salientar a importância do mapeamento anatômico em relação à função fisiológica de sistemas sensoriais particulares. Esta abordagem experimental e os modelos animais utilizados são relativamente baratos e fáceis de conduzir, em laboratórios de ensino neurofisiologia.
Os neurônios dos órgãos chordotonal são de dois tipos funcionais específicos, aqueles que respondem ao movimento e aqueles que respondem a posições estáticas. Gravações celulares solteiro a partir de uma variedade de órgãos chordotonal, não importa qual conjunto é examinada, têm mostrado que este seja o caso 3,5. De fato, os órgãos chordotonal associados às articulações antenares de lagostas revelar os mesmos dois tipos sensoriais e anatomia básica 27. Além de haver dois tipos de neurônios (movimento e positidiante), os neurônios compartilham o mesmo arranjo anatômico em seus respectivos cordões elásticos. A grande somata localizado proximalmente na costa tendem a pertencer aos neurônios sensíveis dinâmicas de movimento. Os neurônios que sinalizam posições estáticas têm pequena somata e estão localizados distalmente. Estas células são tonicamente ativo. A joint PD contém apenas um único órgão chordotonal enquanto há dois órgãos chordotonal no carpo-própodo (PB) e merus-carpo (MC) articulações.
A dissecção de expor estruturas proprioceptivas em caranguejos azuis (C. sapidus) para a gravação eletrofisiológico requer uma estratégia que permite movimentos articulares a ter lugar nas posições naturais durante a gravação de neurônios sensoriais. O nervo para o músculo tensão abridor na perna curta é muito bom nervo composta por vários neurônios. A menos que se tenha o cuidado, o nervo tensão, bem como o nervo motor que inervam o músculo a ser estimulado, pode ser danificado durante o esvaziamento. Paragravações óptimas os eléctrodos de sucção têm de ser adaptados ao tamanho do nervo. As gravações são facilmente acessíveis em um laboratório estudante usando um de 30 40X microscópio ampliação de dissecação e micromanipuladores low-end.
Futuros experimentos que seriam interessantes para prosseguir com os órgãos chordotonal conjuntas seria examinar os perfis estruturais e fisiológicas durante a regeneração perna em várias espécies em diferentes fases do ciclo de vida como um acompanhamento para um estudo inicial que utilizou Cancer magister 19,26 . Perguntas restantes a serem abordados são: 1) que a distribuição e organização dos neurônios regenerados dependem da idade do animal quando regenerar um membro, 2) são as projeções axonais para o CNS (cordão nervoso ventral) em um galho de regeneração funcional ou o faz levar tempo e utilização conjunta para estabelecer conexões funcionais, e 3) o que acontece com os axônios cortados proximal ao plano autotomy quando o membro é autotomized? 28
Crustáceos estar de acordo com as condições ambientais e sua temperatura circundante, mas não está claro como eles manter a coordenação dentro de um circuito neural como neurônios alteram sua atividade em resposta a mudanças de temperatura. A baixa taxa de mudança pode permitir que o animal algum tempo para aclimatação ao passo que uma mudança rápida pode not29 de 30. As alterações fisiológicas no pH ou osmolaridade devido ao metabolismo, o comportamento de 31, ou o impacto ambiental pode apresentar desafios semelhantes aos circuitos neurais envolvidos na propriocepção. Estas preparações de crustáceos são ideais para enfrentar esses tipos de problemas, porque a sua função é bem caracterizado em um nível de uma única célula.
Neste protocolo, têm demonstrado a importância fisiológica dos neurônios tensão no monitoramento força gerada pelo músculo abridor. Esses receptores de tensão pode ser atribuída a sua localização dentro do apodeme usando procedimentos de coloração. Estesneurônios, como em mamíferos, detectar vigor em vários níveis e recrutar neurônios à medida que a força aumenta. A freqüência da atividade está relacionada com a freqüência de estimulação do neurônio motor até à saturação na recepção é atingido. Usando um protocolo de liberação rápida com a articulação dactylus flexionado, atividade tensão desaparece rapidamente, mas, em seguida, retorna após recuperar a tensão em uma joint totalmente estendida. Este é um procedimento experimental clássico para ilustrar a força medida pelos receptores de tensão. Vários neuromoduladores pode ser aplicado para a preparação ver como efetua o desenvolvimento de força e a resposta neuronal. Um dos aspectos importantes é a forma como as respostas neurais são processados e integrados no sistema nervoso central e o seu impacto sobre a actividade de neurónios motores. As técnicas que têm mostrado permitem começar a tratar mais informações sobre a tensão (sensorial) função do circuito neuronal do nervo motor, ou seja, sinal de uma perna intacta para o gânglio e de voltapara o músculo.
Os procedimentos de coloração demonstrados são a chave para a compreensão da fisiologia dos neurônios sensoriais que inervam órgãos proprioceptivos. Disposição anatómica dos neurónios baseados em função do tamanho e da soma são semelhantes em vários órgãos chordotonal dentro das pernas de caranguejo. Não se sabe se os arranjos neuronais semelhantes também são encontrados em outras espécies de crustáceos e insetos. Combinando gravações fisiológicas a partir de células individuais e mapear a localização permite relações de função estrutura direta. A preservação de longo prazo da disposição anatômica com CoCl 2 marcação e fixação permite repetidamente fazer medidas e avaliar o arranjo estrutural.
Propriocepção e recepção da tensão dos músculos do esqueleto são modalidades sensoriais que permitem comportamentos coordenadas e as respostas ao ambiente externo e interno para animais articulados em uma variedade de configurações do músculo esqueléticos. O órgão receptor muscular no abdômen do lagostim é uma outra preparação bem documentado (ver o Projeto Crawdad; http://www.crawdad.cornell.edu/ ) para fins de ensino de propriocepção com apenas dois neurônios por hemi-segmento abdominal 23 . Ser capaz de gravar a partir de neurônios individuais para feixes de nervos sensoriais fornece mais detalhes que ajudam na compreensão dos princípios básicos da recepção sensorial. Estas preparações de crustáceos relativamente simples permitem abordar aspectos fundamentais da propriocepção e monitoramento de tensão, com o potencial para determinar os circuitos neurais que permitem a integração centro de insumos proprioceptivos e outros sensoriais 9-12, 32, 33.
Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Os autores são gratos pelas contribuições artísticas de Hyewon Cooper.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Sylgard | Dow Corning | 182 kit | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| Ácido HEPES Sigma | 3375 | Ácido livre, base HEPES cristalina | |
| Sigma | |||
| D-Glicose | Sigma | G7021 | |
| MgSO4• 7H2O | Sigma | M2643 | |
| Na2SO4• 10H2O | Sigma | 246980 | |
| Bouin' Sigma | HT10-1-32 | Cuidado: Material perigoso (custo de envio especial necessário) | |
| CoCl2 | Sigma | Cuidado: Material perigoso. Siga o descarte adequado de acordo com os regulamentos locais e federais. | |
| Cloreto de azul de metileno | Matheson Co., Inc | Basic Blue 9, C.I. 52015 | |
| 4-Di-2-ASP | Sondas Moleculares | 4- (4-dietilaminostyril) -N-metilpiridínio iodeto | |
| Bleach | Sigma-Aldrich | Para cloreto de fio de prata | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 221465 | Para ajustar o pH |
| HCl | Sigma-Aldrich | H1758 | Para ajustar o pH |
| de dissecação | de | ||
| Sonda | |||
| Gaiola | |||
| Pinos de insetos | Fine Science Tools, Inc | 26001-60 | |
| Lâmpada | |||
| Espelho | Para direcionar o feixe de luz para a preparação. | ||
| Eletrodos | de vidro Sigma-Aldrich | CLS7095B5X | Caixa de 200, eletrodos de sucção |
| Micromanipulador | World Precision Instruments | MD4-M3-R | Pode fixar para base ou em uma haste de metal |
| Suporte | |||
| Fio de prata (10/1.000 polegadas) | A-M Systems | 782500 | |
| Computador | Qualquer empresa | ||
| Amplificador diferencial AC/DC | A-M Systems | Modelo 3000 | |
| PowerLab 26T | AD Instruments | 27T | |
| Transdutor de força | AD Instruments | 0-50g | MLTF050/ST |
| Head stage | AD Instruments | Vem com amplificador AC/DC | |
| LabChart7 | AD Instruments | ||
| Cabos elétricos | Qualquer empresa | ||
| Ferramentas de vidro | Faça-se para | manipular nervos | |
| Cabo e conectores | Qualquer empresa | ||
| Pipetas com lâmpadas | Fisher Scientific | 13-711-7 | Caixa de 500 |
| Copos | Qualquer empresa | ||
| Cera ou massa de modelar | Qualquer empresa ou lojas | ||
| Estimulador | Grass Instruments | SD9 ou S88 | |
| Ponta de plástico para eletrodo de sucção | Loja de ferragens local (Watt' s marca) | ¼ polegadas OD x 0.170 polegadas ID | Corte em pequenos pedaços. Puxe sobre uma chama e corte a ponta no tamanho correto |
Referências
- Whitear, M. Chordotonal organs in Crustacea. Nature. 187, 522-523 (1038).
- Alexandrowicz, J. S. The comparative anatomy of leg propriocetors in some decapod Crustacea. J. Mar. Biol. Assoc. U.K. 52 (3), 605-634 (1972).
- Hartman, H. B., Boettiger, E. G. The functional organization of the propys-dactylus organ in Cancer irroratus Say. Comp. Biochem. Physiol. 22, 651-663 (1967).
- Cooper, R. L., Hartman, H. B. Responses of the bender apodeme tension receptors in the Dungeness crab, Cancer magister. Comp. Biochem. Physiol. A Physiol. 109 (2), 479-486 (1994).
- Cooper, R. L. Mapping proprioceptive neurons on chordotonal organs in the crab, Cancer magister. Crustaceana. 81 (4), 447-475 (2008).
- Burke, W. An organ for proprioception and vibration sense in Carcinus maenas. J. Exp. Biol. 31, 127-138 (1953).
- Hill, A. V. First and Last Experiments in Muscle Mechanics. , Cambridge University Press. Cambridge, U.K. (1970).
- Stuart, D. G., Mosher, C. C., Gerlach, R. L., Reinking, R. M. Mechanical arrangement and transducing properties of Golgi tendon organs. Exp. Brain Res. 14 (3), 274-292 (1972).
- Macmillan, D. L., Dando, M. R. Tension receptors on the apodemes of muscles in the walking legs of the crab, Cancer magister. Mar. Behav. Physiol. 1 (1-4), 185-208 (1972).
- Bévengut, M., Simmers, A. J., Clarac, F. Central neuronal projections and neuromuscular organization of the basal region of the shore crab leg. J. Comp. Neurol. 221 (2), 185-198 (1983).
- El Manira, A., Cattaert, D., Clarac, F. Monosynaptic connections mediate resistance reflex in crayfish (Procambarus clarkii) legs. J. Comp. Physiol. A. 168 (3), 337-349 (1991).
- Le Bon-Jego, M., Cattaert, D. Inhibitory component of the resistance reflex in the locomotor network of the crayfish. J. Neurophysiol. 88 (5), 2575-2588 (2002).
- Ray, D. L., Clarac, F., Cattaert, D. Functional analysis of the sensory motor pathway of resistance reflex in crayfish. I. Multisensory coding and motor neuron monosynaptic responses. J. Neurophysiol. 78 (6), 3133-3143 (1997).
- Wiersma, C. A. G. Vergleichende Untersuchungenüber das periphere Nerve-muskelsystem von Crustaceen (Comparative studies on the peripheral nerve-muscle system of crustaceans). J. Comp. Physiol. 19, 349-385 (1933).
- Wiersma, C. A. G. Movement receptors in decapod crustacea. J. Mar. Biol. Assoc. U.K. 38 (01), 01-143 (1959).
- Hartman, H. B. Tension receptors on the closer muscle apodeme in the walking legs of the blue crab Callinectes sapidus. J. Comp. Physiol. A. 157 (3), 355-362 (1985).
- Holsinger, R. The effect of regional phenotypic differences of Procambarus clarkii opener muscle on sarcomere length, fiber diameter, and force development MSc thesis [dissertation]. , University of Kentucky. (2013).
- Parsons, D. W. The morphology and ultrastructure of tension receptors in the walking legs of the crab, Carcinus maenas. Cell Tissue Res. 211 (1), 139-149 (1980).
- Parsons, D. W. Responses and central interactions of tension receptors in the leg muscle of Carcinus. Comp. Biochem. Physiol. A Physiol. 72 (2), 391-399 (1982).
- Tryba, A. K., Hartman, H. B. Dynamic responses of series force receptors innervating the opener muscle apodeme in the blue crab, Callinectes sapidus. J. Comp. Physiol. A. 180 (3), 215-221 (1997).
- Whitear, M. The fine structure of crustacean proprioceptors. I. The chordotonal organs in the legs of the shore crab, Carcinus meanas. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 245 (725), 291-325 (1962).
- Whitear, M. The fine structure of crustacean proprioceptors. II. The thoracico-coxal organs in Carcinus, Pagurus and Astacus. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 248 (752), 437-456 (1965).
- Leksrisawat, B., Cooper, A. S., Gilberts, A. B., Cooper, R. L. Muscle Receptor Organs in the Crayfish Abdomen: A Student Laboratory Exercise in Proprioception. J. Vis. Exp. (45), e2323(2010).
- Baierlein, B., Thurow, A. L., Atwood, H. L., Cooper, R. L. Membrane Potentials, Synaptic Responses, Neuronal Circuitry, Neuromodulation and Muscle Histology Using the Crayfish: Student Laboratory Exercises. J. Vis. Exp. (47), e2322(2011).
- Delaney, K., Gelperin, A. Cerebral interneurons controlling fictive feeding in Limaxmaximus; I. Anatomy and criteria for re-identification. J. Comp. Physiol. A. 166, 297-310 (1990).
- Hartman, H. B., Cooper, R. L. Regeneration and molting effects on a proprioceptor organ in the Dungeness crab, Cancer magister. J. Neurobiol. 25 (5), 461-471 (1994).
- Hartman, H. B., Austin, W. D. Proprioceptor organs in the antennae of Decapoda Crustacea. J. Comp. Physiol. 81 (2), 187-202 (1972).
- Cooper, R. L. Development of sensory processes during limb regeneration in adult crayfish. J. Exp. Biol. 201 (Pt 11), 1745-1752 (1998).
- Chung, Y. -S., Cooper, R. M., Graff, J., Cooper, R. L. The acute and chronic effect of low temperature on survival, heart rate and neural function in crayfish (Procambarus clarkii) and prawn (Macrobrachium rosenbergii) species. Open J. Mol. Int. Physiol. 2 (3), 75-86 (2012).
- Blundon, J. A. Effects of temperature and thermal history on neuromuscular properties of two crustacean species. J. Comp. Physiol. B. 158 (6), 689-696 (1989).
- Cooper, R. M., Schapker, H., Adami, H., Cooper, R. L. Heart and ventilatory measures in crayfish during copulation. Open J. Mol. Int. Physiol. 1 (3), 36-42 (2011).
- Bierbower, S. M., Cooper, R. L. The mechanistic action of carbon dioxide on a neural circuit and NMJ communication. Journal of Experimental Zoology. , (2013).
- Bierbower, S. M., Shuranova, Z. P., Viele, K., Cooper, R. L. Sensory systems and environmental change on behavior during social interactions. Brain Behav. 3 (1), 4-13 (2013).
Reimpressões e permissões
