Um protocolo de resposta narigudo Extensão para investigar plasticidade comportamental em Insetos: Aplicação para Basic, biomédica e Pesquisa Agropecuária

Muitos insetos aprender sobre estímulos ecologicamente relevantes, e, em seguida, mudar suas respostas comportamentais a esses estímulos, a fim de adaptar-se a novas relações preditivas em seu ambiente. Vários mecanismos diferentes podem estar subjacentes a esta plasticidade comportamental (por exemplo, não associativa, associativa / pavloviano e operante / instrumental ^1). Estes tipos de plasticidade diferem na forma como os estímulos ou comportamentos estão associados com eventos importantes, tais como a ocorrência de comida, um companheiro, ou perigo. Entender essas formas de plasticidade é muito importante para a pesquisa básica sobre como o sistema nervoso muda para codificar novas memórias ^2. Também é importante para a compreensão dos comportamentos adaptativos de insetos que são vetores importantes da doença (por exemplo, tsé-tsé e mosquitos) e insetos que são importantes na agricultura, seja na produção agrícola (abelhas) ou como pragas.

Estudando plasticidade comportamental em qualquer animal requer um nível de controle experimental sobre um número de variáveis ​​que não é viável no campo ^1. É necessário o desenvolvimento de um protocolo de condicionamento robusta que pode ser empregue sob condições mais controladas, mas que ainda são relevantes para o comportamento em condições naturais. O mel de abelha (Apis mellifera) é um excelente modelo de como desenvolver um protocolo para a realização de análises de controlo comportamental ^3,4 plasticidade. O narigudo Extensão Resposta (PER) em abelhas é um reflexo do comportamento natural em que a abelha estende sua tromba em resposta à estimulação da antena com uma solução de açúcar. Durante o forrageamento normal, PER ocorre quando a abelha encontra o néctar em uma flor. Felizmente, as abelhas prontamente apresentar este comportamento simples e facilmente quantificáveis ​​em laboratório. Isso torna possível para estudar, em um ambiente controlado, os mecanismos que influenciam esse comportamento ecologicamente relevante ^5. PER can também ser usado dentro de um protocolo de condicionamento para investigar a percepção do estímulo e aprendizagem e memória em diferentes condições de tratamento, que são projetados para revelar os mecanismos comportamentais e neurais subjacentes à plasticidade ^6.

Desde os primeiros estudos realizados por Kuwabara ^7, PER condicionado tem sido amplamente utilizada para revelar não associativa, associativa e mecanismos operantes que fundamentam a plasticidade comportamental em abelhas ^8. Estes mecanismos são idênticas àquelas reveladas em estudos de que voam livremente abelhas ^9. Ao contrário dos estudos de voar livremente abelhas, protocolos POR condicionado pode ser acoplado com eletrofisiologia ^10,11 ou células vivas imagens de fluorescência ^12-14 do cérebro. Além disso, protocolos por permitir a manipulação experimental de vias neurais através de tratamentos farmacológicos ou genéticos moleculares para testar hipóteses sobre os papéis dos componentes específicos da rede, tais como neuromodulators ^15,16. Protocolos por também ter fornecido uma forma importante de avaliar os efeitos subletais de condições ambientais, bem como toxinas sobre a saúde e a eficiência de forrageamento das abelhas ^17.

Este procedimento descreve dois métodos de entrega de odor em paralelo. Método 1 é uma versão de odor e de estímulo não condicionado (sacarose) de entrega que fornece um método barato e tecnicamente simples para a apresentação do odor e recompensa sacarose. Este método é bom para o treinamento básico e quando a automatização não é possível. É uma excelente maneira de introduzir esta técnica para uma sala de aula ou laboratório de ensino. Durante o condicionamento para experimentos envolvendo tarefas mais difíceis e as avaliações fisiológicas acopladas de percepção de odor, a aprendizagem, ou de memória, é muito importante para a precisão e exatidão regular o início, o tempo de entrega da duração dos estímulos. Para a entrega de estímulo mais fiável, utilizar um meio de automatizar a entrega de um odornd um método preciso de entrega recompensa. Método 2 emprega automatizado entrega odor e entrega de sacarose mais precisa. É tecnicamente mais sofisticado e exige mais para a configuração inicial do método 1, mas aumenta significativamente a coerência entre o calendário ea quantidade de estímulos utilizados para o condicionamento e deve ser usado sempre que possível.

1 Odor Setup Cartucho (estímulo condicionado)

1. No início da experiência, de configuração múltiplos cartuchos de odor para todos os odores diferentes necessárias para os ensaios de condicionamento.
   1. Use um exaustor para diluição odor e preparação cartucho odor. Nunca abra garrafas de odores fora desse exaustor de fumos, uma vez que os odores se espalham rapidamente por todo o laboratório e, potencialmente, expor as abelhas ao odor antes condicionado. Além disso, usar luvas durante a configuração dos cartuchos de odor e lave bem depois para evitar a exposição das abelhas aos odores durante o manuseio deles.
   2. Certifique-se de cada cartucho de odor está claramente marcada com uma etiqueta com um código de cor de odor para o qual é usado pela primeira vez. Nunca usar um cartucho de odor (tambor de seringa ou êmbolo) para mais do que um odor, uma vez que pode haver o odor residual do cartucho.
2. Preparando Odores e odor Misturas
   1. Diluir odores em qualquer hexano ou óleo mineral para o dconcentração esired.
      NOTA: A alteração da concentração do odor ou apresentando as misturas de duas ou mais substâncias odoríferas pode permitir a pesquisa de aspectos adicionais como abelhas sentir os odores e aprender a associação condicionado. Misturas de odores pode ser tão simples como uma mistura binária 50:50 ou tão complexo como vários odores que imitam estímulos olfativos naturais. A redução da concentração do odor também aumenta a dificuldade da tarefa.
      1. Odores vai se esgotam com a reutilização do cartucho (Figura 2). Para evitar problemas de esgotamento fazer cartuchos suficientes para ser capaz de mudar para um novo cartucho de cada 10-12 usa.
3. Preparando Odor Cartuchos
   1. Método 1
      1. Por este método, utilizar 20 ml de seringas de plástico com um círculo de 15 mm de diâmetro de papel de filtro preso à extremidade do êmbolo de borracha para cartuchos de odor.
      2. Retirar o êmbolo da seringa e um pino para prender a peça de filter de papel para a extremidade do êmbolo.
      3. Use uma micropipeta para colocá-10 ul do odor no papel de filtro, e reinserir o êmbolo para dentro do cilindro da seringa. Empurre o êmbolo até a marca de 15 ml na seringa.
   2. Método 2
      1. Por este método, utilizar um vidro cc ou seringas de tuberculina de plástico (ou modificados de pipetas de volume e forma semelhantes) com uma tira de papel de filtro no interior e um restritor de borracha ou silicone na extremidade mais larga do tambor de seringa para os cartuchos de odor.
      2. Retirar o êmbolo a partir de um tambor de seringa de tuberculina de 1 cc. O corpo da seringa será o corpo do cartucho de odor.
      3. Retirar a ponta de borracha preta do êmbolo da seringa e cortar a extremidade fechada da ponta de borracha.
         NOTA: Este anel de borracha irá atuar como um limitador para reduzir a sucção do fluxo de ar na arena, que prematuramente desenhar odor fora do cartucho e sobre a abelha contido. Como alternativa, tubo de silicone (4,8 milímetros outer diâmetro) cortado em seções 5 milímetros funcionam como limitadores.
   3. Lavar o interior do cilindro da seringa e do limitador de borracha / silicone com etanol a 70% (para remover a maior parte do odor residual de utilização anterior) e deixá-las secar.
   4. Coloque um 0,2 x 4 cm tira de papel de filtro para a abertura de largura do cilindro de modo que o papel se estende de 1-2 cm para além da abertura.
   5. Use uma micropipeta para colocá 3-10 ul do odor no papel de filtro, sem que o odor tocar a extremidade do cilindro da seringa. A ponteira pode ser reutilizada para o mesmo o odor, mas certifique-se de usar uma nova dica para configurar o próximo odor.
   6. Ligue o grande abertura do corpo da seringa para cima de modo que o filtro de papel desliza rapidamente para dentro do tubo. Insira o restritor para a ampla abertura da seringa.
      1. Verifique se cada cartucho de odor é claramente marcado com uma etiqueta de código de cor do odor que é usado pela primeira vez para. Nunca use um cartucho de odor (corpo da seringa ou restrIctor) por mais de um odor, uma vez que pode haver o odor residual nele.
   7. Bola-se a extremidade de um tecido sem fibras, embeba-lo com 70% de etanol, e usá-lo para eliminar completamente a superfície exterior do cartucho para remover qualquer odor residual no lado de fora do cartucho.

2 Coleta, Prender, e alimentação das abelhas

1. Preparando Bee Prender Arreios
   1. Faça arreios de restrição simples para as abelhas de canudos de plástico de refrigerante, tubo de plástico rígido ou tubos de metal usinado (todos são aproximadamente 0,9 cm de diâmetro interno e têm 1-2 mm de espessura de parede). Use cintos mais resistentes para os procedimentos que envolvem a cirurgia.
   2. Corte 3 centímetros seções da tubulação. Em seguida, a guarnição parcialmente afastado cerca de metade dos superiores um centímetro do cinto para torná-lo mais fácil de segurar a abelha no lugar enquanto a fixação do cinto de segurança.
   3. Corte um 0.2 x 6 cm tira de fita adesiva e prenda uma extremidade de um lado do cinto abelha, leacamente a outra extremidade livre.
2. Coleta de Abelhas
   1. Colete trabalhadores da entrada para a colônia como eles pausa antes de sair da colônia ou que retornam de forrageamento.
      NOTA: Colocar um pedaço de malha de arame, com buracos apenas grandes o suficiente para as abelhas operárias para rastejar através, sobre a entrada diminui os trabalhadores que retornam para baixo e torna mais fácil capturá-los antes de entrar na colônia.
   2. Coloque um frasco de cintilação sobre a abelha até que ele voa para cima para ele. Segure o frasco com a sua abertura na horizontal ou para baixo enquanto a tampa é presa para que as abelhas não voa para fora do frasco. Coloque apenas uma abelha em cada frasco. Certifique-se que a tampa tem um buraco no meio para permitir a troca gasosa adequada.
   3. Recolha as abelhas rapidamente para minimizar o tempo que passam nos frascos. Manter os tubos com abelhas em-los em uma pequena caixa na sombra.
   4. Transfira a caixa com os frascos e as abelhas para o laboratório, e coloque os frascos em um sl água geladaUrry até que as abelhas parar de se mover. Uma vez que uma abelha é imóvel, remover o frasco do gelo imediatamente para evitar a exposição excessiva ao frio, e coloque a abelha em um cinto de restrição.
      NOTA: Não é recomendável colocar as abelhas na geladeira ou no congelador, uma vez que é difícil de controlar quando as abelhas se tornar imóvel, resultando em uma exposição excessiva ao frio. Quando aproveitamento mais de 10 abelhas, transferir apenas algumas abelhas à lama de água gelada de cada vez.
3. Restrição das Abelhas
   1. Coloque a abelha na cablagem com o seu tórax dorsal voltada para a porção recortada do tubo e a sua cabeça um pouco acima da parte superior do tubo. Pressione suavemente a abelha perto do tubo de modo que seus aparelhos bucais ultrapassar a borda do tubo. Deslizar a tira de fita adesiva, entre a cabeça e no tórax no lado dorsal da abelha e firmemente prender a extremidade livre do lado do feixe.
      1. Verifique se a fita no chicote é suave e firme. Não deve haver noticeable lacunas entre a frente do feixe de abelha e a fita e a fita deve estabelecer plana no topo do arnês. Se há lacunas a abelha pode não ser capaz de estender sua tromba corretamente ou pode escapar. Além disso, certifique-se as patas dianteiras da abelha não são salientes entre a parte frontal do cinto e da fita adesiva.
4. Alimentando as abelhas ea alimentação para Condicionado Interval
   1. Cerca de 30 minutos após aproveitamento - depois que as abelhas tenham recuperado a partir da configuração inicial - alimentar as abelhas 3-4 mL de 0,5 M de sacarose (em água). Esta quantidade será suficiente para um intervalo de alimentação a-condicionado de 3-4 horas.
      1. Em geral, alimentar 1 ml de 0,5 M de sacarose por cerca de hora em hora de tempo de espera entre a alimentação e condicionamento para garantir que as abelhas sobrevivem ao intervalo ainda está com fome o suficiente no início do condicionamento para estar motivado para aprender a associação condicionado. Num laboratório mantido a uma temperatura quente ou se ucantar uma concentração diferente de sacarose, ajustar a quantidade alimentada ou o intervalo de tempo em conformidade.
         NOTA: Com uma alimentação de intervalo condicionado de 24 horas, verifique se todas as abelhas são alimentadas até a saciedade com 0,5 ou 1 M de sacarose, pelo menos, 24 horas antes do condicionamento começará. À temperatura ambiente, as abelhas necessitam de cerca de 24 horas antes de serem motivado o suficiente para responder bem em um protocolo condicionado.
         NOTA: É uma menor concentração de uma solução de sacarose para alimentar as abelhas do que a concentração utilizada como uma recompensa durante condicionado para evitar que as abelhas se torne menos sensível à concentração de sacarose utilizada durante o condicionamento, o que pode reduzir o desempenho da aprendizagem ^18.
      2. Alimentar as abelhas em uma área bem longe da área de treinamento. A exposição ao estímulo não condicionado (sacarose), no contexto condicionado antes do condicionamento pode influenciar condicionamento subsequente ao odor.
   2. Durante o intervalo de tempo entre a alimentação e conditioning colocar as abelhas na bancada, numa zona tranquila do laboratório para evitar perturbações desnecessárias. Se o laboratório tem baixa umidade do ambiente, colocar as abelhas em um recipiente de plástico com papel-toalha molhada durante o intervalo de tempo. Isto evita a dessecação, uma vez que as abelhas podem morrer se forem expostos a humidade baixa, por períodos de tempo prolongados.
      NOTA: Não altere o protocolo de controlo e alimentação dentro de um experimento! Use apenas um intervalo de tempo específico entre a criação e alimentação das abelhas e começando condicionado para cada experimento para que as abelhas são tratados exatamente da mesma maneira.

3. Condicionado

1. Teste de Sensibilidade para Sacarose
   1. Poucos minutos antes de iniciar o condicionamento, testar a motivação das abelhas para alimentar tocando suas antenas com uma pequena gota de solução de sacarose 0,5 M (a mesma concentração usada durante a alimentação). Não permita que eles se alimentam durante este teste. Se eles respondem por exteencontrando seus tromba, eles são provavelmente suficientemente motivados para aprender e podem ser utilizados para o protocolo.
2. Experimento
   NOTA: Este protocolo pode ser modificado para atender a uma ampla gama de protocolos de aprendizagem, a fim de investigar muitos aspectos da capacidade de aprendizagem e memória abelhas do mel ". Entre os vários parâmetros que podem ser ajustados são: intervalo de Inter-julgamento, número de abelhas treinadas em um determinado momento, intervalo inter-estímulos, tipo e concentração e número de odores, tipo e concentração do estímulo incondicionado, o número ea sequência de ensaios (Figura 1, Tabela 1) ^19-21. Ao projetar o protocolo exato para cada ensaio condicionado, é muito importante manter o intervalo inter-julgamento consistente entre os indivíduos. Um intervalo de julgamento entre que é muito curto, muito longo ou inconsistente vai prejudicar o desempenho das abelhas. Veja a discussão para um tratamento completo do tema.
   NOTA: Abelhas vai aprender a tarefa mais rapidamente se eles estão em um ambiente acolhedor. Por conseguinte, a manter a temperatura do ambiente de formação consistente e quente (29-30 ° C, se possível).
3. Cumprindo a Odor (estímulo condicionado)
   1. Método 1
      1. Configurar o Sistema Odor Entrega
         1. Monte o plástico seringa de 20 ml com o papel de filtro tratado com odor por isso, é estável e a pequena extremidade está voltada diretamente para as antenas da abelha. Defina o êmbolo na marca de 15 ml e coloque a seringa de modo que o êmbolo é facilmente acessível.
      2. Apresentar o estímulo do odor
         1. No início de cada ensaio, coloque a abelha no chicote no cabide na arena condicionado com suas antenas apontava diretamente para o cartucho odor. Deixe a abelha se aclimatar à arena para 15-25 segundos antes de iniciar o estímulo odor para reduzir os inconvenientes causados ​​pela mudança abrupta em seus arredores visuais durante o estímulo odor.
            1. Se a abelha começa a reagir com o cartucho de cheiro imediatamente após ter sido colocado na arena condicionado, pode haver odor na ponta do cartucho. Remova o odor contaminar pela lavagem do cartucho com um tecido que não solte fiapos embebido em etanol 70%. Se isso não resolver o problema, substitua o cartucho.
         2. Pressionar o êmbolo da seringa a uma taxa constante de modo que o êmbolo está completamente deprimido dentro de 4 segundos. Monitorar a resposta da abelha ao odor antes de apresentar o estímulo incondicionado.
         3. Após cada ensaio, permitem que a abelha para descansar na arena condicionado para outra 15-25 seg. Mover a abelha muito cedo após o julgamento irá reduzir significativamente a eficácia de cada julgamento condicionado.
   2. Método 2
      1. Configurar o Sistema Odor Entrega
         1. Fluxo de ar de origem e Vazão
            1. À medida que o fluxo de ar de origem para entrega odorusar uma bomba de aquário ou de um arejador bancada de fornecimento de ar pressurizado, caso o laboratório está equipado com ele.
               Observação: Uma bomba de aquário arejador típico terá uma taxa de fluxo de ar perto de 400 ml / min (7 ml / seg); sobre o odor estímulo 4 seg, de 28 ml de ar irá fluir através de um cartucho de 1 ml.
            2. Usar um medidor de fluxo em linha com o tubo do aparelho de fornecimento de ar para regular a taxa de fluxo para o abastecimento de ar. Ajustar o medidor de fluxo até que a taxa de fluxo é de 400 ml / min. Verifique a taxa de fluxo na abertura do cartucho de odor com um medidor de fluxo separado.
            3. Ligue o fluxo de ar para o cartucho de odor através de um sistema de tubagem de plástico e válvulas.
               NOTA: O dispositivo de tempo discutido abaixo abre as válvulas no momento apropriado no julgamento. Conectores de plástico anexar o sistema de fluxo de ar para o cartucho de odor através de um tipo de anexo ao corpo da seringa Luer do cartucho.
            4. Independentemente da origem do fluxo de ar, verifique a vazão periodicamente para make certeza de que a linha está intacta e o caudal é mantido a uma taxa desejada.
      2. Automated Odor Entrega
         1. Utilizar um controlador lógico programável (PLC), para automatizar a entrega do odor.
            NOTA: O PLC é programado para abrir as válvulas para a entrega odor fluxo de ar de 6 segundos após o início do programa (iniciado pressionando um botão), manter as válvulas abertas por 4 s, e emitir um sinal sonoro de alimentação, através de um pequeno alto-falante, 3 segundos após o início do estímulo odor para sinalizar o experimentador para entregar sacarose.
         2. Use um pequeno LED para indicar o momento do estímulo odor durante cada tentativa. Se possível usar um LED vermelho, uma vez que os fotorreceptores das abelhas são deslocadas para longe de mais [red] comprimentos de onda mais curtos e direção [UV] comprimentos de onda de modo que não pode vê-lo bem. Posicione o LED atrás e abaixo da abelha, fora do seu campo visual, para que a luz não vai se tornar uma inadvertida condicionado estímulo.
            NOTA: A light também ajuda a verificar se o PLC está funcionando adequadamente e é útil na análise de gravações em vídeo das respostas das abelhas durante os testes de ensaios.
      3. O sistema de escape
         1. Estabelecer um sistema de escape atrás da abelha para ajudar a puxar o ar pelo abelha e evacuar o ar odor carregado da arena condicionado para manter um calendário discreto para cada apresentação do odor.
            Nota: Se existir um sistema de vácuo no laboratório, modificar o porto de vácuo e anexar uma conduta de secador de tubo para proporcionar o fluxo de ar necessário para evacuar a arena condicionado. Se não houver um sistema de vácuo, uma pequena ventoinha eléctrica alojados em linha com a tubagem secar levou a um exaustor ou através de uma janela será suficiente.
      4. No início de cada dia, verifique as conexões elétricas e de ar do sistema de entrega de odor e do sistema de escape. Pressione o botão de início do sistema de entrega de odor e controlar o tempo entre pressionar obotão e quando as válvulas abertas (um clique calma ea luz LED acende) e quando a deixa para apresentar o estímulo incondicionado (um tom audível) soa. Verifique o fornecimento de ar, colocando um dedo húmido em frente do conector que irá ser ligada ao cartucho de odor. Deve haver uma forte corrente de ar apenas quando as válvulas estão abertas. Verifique o sistema de escape, mantendo-se um tecido que não solte fiapos para a abertura do sistema de escape para verificar se o fluxo de ar é forte o suficiente para evacuar adequadamente o ar condicionado da arena.
   3. Montagem do cartucho Odor
      1. Colocar um pouco de massa de modelar ou sobre a bancada ou em um pequeno Plexiglas ficar para posicionar o cartucho de abelha e odor diretamente na frente do sistema de escape. Coloque a seringa de vidro odor no barro e ajustá-lo para a abertura da grande final está apontado para a cabeça da abelha. A extremidade da seringa deve ser de 1-2 cm da abelha. Escolha uma distância dentro desta faixa e ser constante.
      2. Colocar firmemente o encaixe de ligação do cartucho para o tubo de ar e um sistema de válvula através da extremidade esmerilada estreita da seringa.
   4. Apresentar o estímulo do odor
      1. No início de cada ensaio, coloque a abelha aproveitado no cabide na arena condicionado com suas antenas apontava diretamente para o cartucho odor. Deixe o resto abelha na arena para 15-25 segundos antes de iniciar o estímulo odor para permitir que ele se acostumar com seu novo ambiente.
         NOTA: Se a abelha começa a reagir com o cartucho de odor imediatamente depois de ser colocado na arena condicionado, pode haver odor na ponta do cartucho. Remova o odor contaminar pela lavagem do cartucho com um tecido que não solte fiapos embebido em etanol 70%. Se isso não resolver o problema, substitua o cartucho.
      2. Pressione o botão Iniciar para iniciar o mecanismo de tempo para entrega odor. Monitorar a resposta da abelha para o odor após estímuloinício e antes da apresentação do estímulo incondicionado.
      3. Após cada ensaio, permitem que a abelha para descansar na arena condicionado para outra 15-25 segundos para permitir a formação da memória inicial. Mover a abelha muito cedo após o julgamento irá reduzir significativamente a eficácia de cada julgamento condicionado.
4. Cumprindo a Sacarose (Incondicionada Estímulo)
   1. Método 1
      1. Por este método, utilizar um palito para entregar a sacarose.
         NOTA: É melhor usar um palito de plástico desde os palitos de madeira pode ter um odor que vai influenciar as respostas das abelhas para o estímulo condicionado.
      2. Mergulhe a ponta do palito na solução de sacarose, e, quando é o momento para apresentar o estímulo incondicionado, segurar o palito na frente da abelha e permitir que a abelha lamber a sacarose do palito para cerca de 1 seg.
      3. Substitua o palito regularmente para evitar o acúmulo de sucrose.
   2. Método 2
      1. Sacarose Delivery System
         NOTA: A forma mais precisa para entregar o estímulo incondicionado é através do uso de seringas micrométricas, que podem administrar com precisão pequenas quantidades (décimos de um microlitro) da recompensa de sacarose.
         1. Enrole a micrómetros de seringa para trás, na medida do possível. Carregar o barril micrómetro seringa com a solução de sacarose. Certifique-se de que não haja bolhas na parte de vidro e montar a seringa. Encher o cubo da agulha com a solução de sacarose antes de o colocar na extremidade mais estreita do corpo da seringa. Para assegurar que o fluido no interior da agulha é, na verdade, a sacarose e não a água de lavagem da agulha, enrolar o micrómetro frente 1-2 ul antes de começar a experiência.
   3. Sacarose Apresentação
      1. Manter a ponta da agulha aproximadamente 2 cm da abelha enquanto o odor é apresentado. Utilizar a borda da pista de treino para impedirsacudindo a seringa como o movimento pode distrair a abelha. Não fique com a agulha muito perto, em antecipação do sinal de alimentação, uma vez que também vai mudar prematuramente a atenção da abelha do odor da sacarose.
      2. Assim que o sinal de alimentação sons, tocar levemente a antena até que a abelha estende sua tromba, em seguida, alimentar a abelha. Isto deverá requerer apenas um toque muito leve ou dois para as antenas.
         1. Use uma quantidade recompensa entre 0,2 e 0,8 mL. A abelha deve facilmente consumir toda a gota dentro do período de tempo previsto para o estímulo incondicionado (~ 1-2 segundos). Não use "ad libitum" alimentando de uma grande gota, que a abelha se alimenta por alguns segundos, mas não pode inteiramente consumir.
         2. Preste atenção para a sacarose construir em cima da antena, o que reduzirá a resposta da abelha para apresentações posteriores da recompensa. Modifique o procedimento de alimentação se isso ocorrer.
         3. Para assegurar o emparelhamento exacto do odorcue ea recompensa de sacarose, certifique-se de apresentar a gota de solução de sacarose para a abelha mais rapidamente possível após o sinal.
            NOTA: O sincronismo entre o início do CS (odor) e Estados Unidos (sacarose) é fundamental. O ideal é que a apresentação odor e apresentação de sacarose devem sobrepor-se brevemente. Se mais do que alguns segundos decorrido entre o fim da entrega de CS e os EUA, desempenho de condicionamento diminuirá.

4 Teste

1. Após uso condicionado ensaios de teste não reforçada para avaliar como as abelhas aprenderam e / ou lembrar a associação condicionado.
   NOTA: Consulte a discussão para uma explicação detalhada sobre a importância de analisar as respostas dos ensaios de teste não reforçada, além das abelhas "as abelhas desempenho nos ensaios condicionado e uma explicação da finalidade do número de ensaios de teste e odores de teste.
2. Consolidação Tempo
   1. Na sequênciacondicionado, ou administrar um ensaio de teste imediato ou permitir que as abelhas para descansar por um período de consolidação.
      NOTA: A duração do período de consolidação, o intervalo de tempo entre o condicionamento e ensaio, vai depender do objectivo da experiência. Se o objetivo é investigar as diferenças de aprendizagem ou memória de curto prazo, o desempenho das abelhas em ensaios de teste pode ser avaliada imediatamente após ou várias horas após o condicionamento. Se o experimento envolve a investigação memória de longo prazo, as provas do teste deve ser feita pelo menos 24 horas após o final de condicionamento.
   2. Se os ensaios de teste são mais de 24 horas após condicionado, alimentar as abelhas até a saciedade com 0,5 M de sacarose seguinte condicionado e pelo menos uma vez por dia depois até 12-24 horas antes dos ensaios de teste.
      1. Para certificar-se que as abelhas chegaram a saciedade, alimentar cada um deles várias vezes diferentes até que não mais estender suas tromba em resposta a tocar sua antenaum e com sacarose. Eles podem consumir até 40 mL para atingir a saciedade.
   3. Mantenha as abelhas em um recipiente umedecido para evitar a sua dessecação e morrer durante o período de consolidação.
3. Trials Teste
   1. Use cartuchos de odor só recentemente preparados para o teste.
      NOTA: Os cartuchos usados ​​para a aquisição pode ser diferencialmente esgotado, de modo que o estímulo de teste não será consistente em todos os ensaios, odores e abelhas individuais e, portanto, podem afetar significativamente a consistência e robustez dos resultados.
   2. Durante o teste, manter o mesmo intervalo inter-ensaio e de outros parâmetros como utilizado na fase de condicionamento do experimento.
   3. Não apresentar o estímulo incondicionado durante os ensaios de teste, uma vez que a presença de uma recompensa vai alterar a resposta das abelhas para o estímulo condicionado, potencialmente mascarar efeitos mais sutis do protocolo condicionado ou um tratamento.
   4. Gravar vídeos de todos os Of os ensaios de teste para ser capaz de medir depois múltiplos aspectos respostas das abelhas para o odor (es).

5. registrar as respostas das abelhas

1. Binary (presença / ausência) Scoring de PER
   1. Use um sistema de pontuação PER binário durante os ensaios condicionado e durante os testes ensaios. Pontuação respostas como positivo ou negativo; isto é satisfatório para muitos tipos de análises com um tamanho de amostra de 20-40 abelhas em cada grupo de tratamento. A topologia exacta das respostas pode ser complexa ^22. É importante estabelecer uma fácil de ver e marcar critério para uma resposta positiva.
      1. Marque a resposta de uma abelha como positivo (+) quando a abelha estende sua tromba para além da linha feita ligando as pontas das mandíbulas abertas. Só marcar uma resposta positiva quando a abelha estende sua probóscide após o início odor, mas antes da compensação odor.
      2. Pontuação de resposta de uma abelha como negativa (-), quando não existe extension dos probóscide durante o julgamento ou se a tromba é prorrogado após a compensação do odorante.
      3. Evite tentar marcar respostas parciais. Para fazer distinções mais sutis no comportamento das abelhas, use a técnica de análise de vídeo descrito abaixo.
2. Análise de Vídeo de Medidas adicionais por (Filme 1)
   1. Reúna informações adicionais a partir de testes de comportamento, analisando vídeos de respostas de uma abelha a um odor.
      NOTA: As medições também pode fornecer uma resolução temporal maior, para exame de respostas das abelhas para os odores, particularmente quando não existe uma diferença na pontuação presença / ausência de PER entre os grupos de tratamento.
   2. Gravando os vídeos
      1. Utilize sempre os ensaios de teste ou extinção sem reforço para gravações de vídeo. A presença da recompensa irá alterar a resposta das abelhas para o odor, a modificação do tempo de extensão tromba.
      2. Definir uma câmera de vídeo em um tripé acima da arena de treinamento e focar a câmera na parte frontal da cabeça da abelha, por isso as antenas e tromba estão em foco.
      3. Posicione a pequena luz LED, o que indica odor apresentação do estímulo, em uma área atrás da abelha que é visível no vídeo, a fim de usá-lo para identificar início odor e deslocamento durante a análise.
      4. Começar a gravar 20 segundos antes do início odor e continuar gravando por pelo menos 20 segundos após a compensação odor antes de perturbar a abelha.
   3. Análise de Vídeo
      1. Faça o upload dos vídeos em software de edição de vídeo, como o iMovie ou Final Cut Pro, com a capacidade de medir intervalos de tempo entre os quadros específicos no vídeo.
      2. Analisar a resposta das abelhas para o odor por um período de tempo discreto começando no início do estímulo odor (por exemplo, 10 ou 20 segundos).
      3. Use as seguintes medidas comuns para avaliar PER:
         1. Medir oduração da tromba extensão, que é o tempo total em que a tromba se estende para além da linha da mandíbula para mandíbula (descrito acima).
            NOTA: Uma abelha pode aumentar e diminuir sua tromba várias vezes durante a janela de tempo de 10-20 segundos. Meça cada extensão tromba individualmente e calcular a duração total. Analisando o número ea duração de cada extensão tromba indivíduo também pode fornecer informações valiosas.
         2. Meça a latência de extensão probóscide, que é o tempo entre o início odor, quando a luz LED acende, ea primeira prorrogação tromba.
         3. Contagem e extensões de tempo glossal relativos ao aparecimento de odorante, a primeira extensão, ou outros parâmetros de tempo.
         4. Acompanhe movimentos antenais ^23, que também mostram mudanças orientadas para o odor característico.
            NOTA: No filme 1, os movimentos da antena foram captados com software de monitoramento de vídeo para ilustrar a mudança de movimentos antenais in resposta a um estímulo de odor.

Apresentam-se dois exemplos de utilização dos protocolos POR descritos acima. O primeiro exemplo, feito uso do método 2 para estudar o modo como as abelhas perceber odores diferentes como uma função da semelhança molecular de odor utilizado como o CS 5,24,25. O segundo é um exemplo do uso do método 1 e algumas das precauções que devem ser tomadas quando começar a usar PER experimentos de condicionamento no laboratório de pesquisa.

Estudos como este têm sido usados ​​para descrever o 'espaço perceptivo "olfativa das abelhas e mariposas em conjunto com bioimaging 13 ou eletrofisiológico analisa 26. As abelhas do mel (n = 20) foram condicionados a associar o odorante decanal com reforço de sacarose ao longo de 12 ensaios para a frente emparelhamento condicionado (Figura 3A). Aproximadamente 10% das abelhas respondeu "espontaneamente" no primeiro ensaio, que é normal. Depois que o percentual que Responded aumentar ao longo dos próximos ensaios até 100% das abelhas respondeu na quinta tentativa e cada posterior julgamento. Vários estudos têm demonstrado que este aumento na resposta é específica para a condição para a frente o emparelhamento (Figura 1), em relação a vários processos de controlo importantes 3. Após a fase de aquisição, cada abelha foi submetido a uma série de ensaios teste não reforçada (Figura 3B), que envolveu a exposição ao odor CS e para vários outros odorantes que sistematicamente se diferenciou do CS em estruturas moleculares. As abelhas do mel responderam mais fortemente para o CS. Suas respostas para as outras odorants diminuiu em função das mudanças sistemáticas na estrutura, com as menores respostas aos odores menos como o CS.

Na Figura 4, os resultados de um recente workshop em que os alunos aprenderam, pela primeira vez, como condicionar as abelhas utilizam o método 1 são ilustrados. Estudantes abetos t condicionado abelhas por frente emparelhamento methycyclohexanone (HCM), ou octanol (OCT) com reforço de sacarose (Figura 4A). Respostas por cento foram menores no primeiro julgamento e aumentou em julgamentos posteriores, indicando que as abelhas aprenderam a associação odor-sacarose. Houve diferenças no grau que as abelhas aprenderam a associação condicionada pelos diferentes grupos de alunos. Na nossa experiência, estes tipos de diferenças podem ser devido ao odor, que foi usado como o CS, para os elementos imprecisos no método (Método 1), ou para o nível de formação dos experimentadores. No terceiro caso, o desempenho rapidamente torna-se mais consistente com o aumento da experiência dos pesquisadores. Após o condicionamento, cada abelha foi testado duas vezes com cada odor. Em grupos de abelhas que havia sido condicionado com emparelhamento frente de outubro ou MCH, a resposta foi, como esperado, o mais forte para o odor condicionado (Figura 4B).

ent "> O segundo grupo de abelhas que passaram para a frente de emparelhamento para outubro foi acondicionado em paralelo a um outro grupo no qual o odor outubro foi para trás combinado com sacarose. emparelhamento para trás é um dos vários tipos de procedimentos de controle para demonstrar que o aumento da resposta é específica de transmitir o emparelhamento e não devido a um outro processo, como a excitação não-específica de sensibilização. Para o emparelhamento para trás, os EUA sacarose e odor CS são apresentados em ordem inversa ao que é mostrado na Figura 1. Aquisição de Dados de emparelhamento para trás são não mostrado porque o RC não podem ser marcados dada a apresentação do odor SC após a apresentação de sacarose. Como seria previsível para o condicionamento associativo, os níveis de resposta para outubro foram maiores no grupo para a frente emparelhado em relação ao grupo de trás (Figura 4C).

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Figura 1: Diagrama de projeto experimental para o condicionamento usando a frente de emparelhamento. Ver Tabela 1 para a definição dos termos usados ​​nesta figura. (A) O CS (odor) precede e se sobrepõe com os EUA (solução / água sacarose). A relação entre o CS e US mostrado é o ideal para as abelhas produtoras de mel condicionado e mariposas. Mas o ISI ideal pode depender do protocolo condicionado e espécie animal 1. (B) Composição e temporização relativa de CS, CR, US e UR. O CR que ocorra antes da apresentação US ou durante os ensaios sem reforço 'test' é a medida depende de protocolos experimentais.

Figura 2 esgotamento Odor com reaproveitamento de cartuchos. Para esses dados, cartuchos de odor foramset-up com hexanol, como descrito no texto. Hexanol é comumente usado como um CS nos estudos por; no entanto, a taxa efectiva de depleção dependerá do odor e do solvente. Os cartuchos foram então usados ​​uma vez para 4 seg a cada minuto mais de 8 ensaios (assumindo 5 abelhas / trial em um experimento padrão que seria igual a 40 usos). As diluições no solvente indicado, que eram relativamente norma para experiências POR, foram de 2,0 M (A) e 0,2 M (B). (A, B) O odor foi amostrada após o primeiro e oitavo ensaios por adsorção sobre uma fase sólida microextração (SPME) de fibra que foi então dessorvido em um cromatógrafo a gás. As áreas relativas sob os picos foram superiores após o primeiro ensaio em relação ao oitavo para ambos os solventes e para ambas as concentrações (Wilcoxon pares assinado teste rank p <0,05 [*] ou superior), o que mostra que menos odor foi entregue a partir do cartucho depois de o cartucho ter sido utilizado um número de vezes. (C, D) Os mesmos dados que mostram apenas o oitavo tr ial com o eixo y expandido. Ela mostra que a depleção foi ligeiramente maior para hexano relativo ao óleo mineral, mas apenas a uma concentração mais baixa.

Figura 3 Aquisição e teste usando decanal como o CS e método 2 para condicionado. (A) Teste-de-ensaio de resposta (CR) ao longo de 12 ensaios de emparelhamento para a frente (Figura 1). Os dados são de abelhas n = 20 mel condicionado em quatro grupos de cinco abelhas cada. O ISI foi de 3 segundos e o ITI foi 6 min. (B), utilizando testes não reforçada odores que diferem decanal pelo comprimento e / ou na posição do carbono do carbonilo da cadeia de carbono. Os odores foram apresentados numa série ao acaso entre os quatro grupos e foram intercaladas com ensaios reforçados com decanal (cada dois a três ensaios), a fim de evitar a extinção da CR.

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Figura 4. Dados de um seminário durante o qual pós-graduação foram treinados para condicionar as abelhas usando PER método 1. dados (a) Aquisição de três grupos de abelhas condicionados a octanol (n = 23 e 15 para GPS 1 e 2, respectivamente) e metilciclohexanona (n = 10) (B) CRs durante os testes não reforçados com ambos os odores.; quatro ensaios apresentados na série aleatória entre os grupos. (C) sem reforço testes com ambos os odores em dois grupos de abelhas, um para a frente emparelhado (Gp 1, n = 23) e um para trás pareado (n = 25).

Prazo (abreviação)	Definição	Exemplo relevante
Estímulo condicionado (CS)	Aestímulo que provoca pouca ou nenhuma resposta às primeira e sinaliza US	CHEIRO
Resposta condicionada (CR) uma	A resposta ao CS após associação com os EUA	PROBOSCIS EXTENSÃO
Estímulo incondicionado (US)	Um estímulo biologicamente significativo que provoca uma resposta	Solução de sacarose / ÁGUA
Unconditioned Response (UR) a	A resposta para os EUA	PROBOSCIS EXTENSÃO
Inter-Stimulus Interval (ISI)	O tempo entre o início do CS e início de os EUA	CHEIRO de intervalo SACAROSE
Inter-Ensaio Interval (ITI)	O tempo entre sucessivos emparelhamentos CS-americanos para um único animal	CHEIRO (trial n) CHEIRO (trial n + 1) intervalo

Tabela 1 Importante Terminologia. Consulte a Figura 1 para uma ilustração destes termos. um lucro por condicionar o CR e UR são os mesmos, embora para outros tipos de associações e reflexos do CR e UR podem ser diferentes.

Filme 1. Um vídeo de uma abelha do mel realizando PER depois de ter sido condicionado a responder a um odor. Observe a resposta PER da abelha aproximadamente 1,5 seg após o início odor. Acompanhando software mapeados os movimentos da antena, em resposta à apresentação do odor. As linhas traçadas no canto superior direito do vídeo mostram os movimentos reais da antena. Os dois gráficos na parte inferior da tela mostram movimentos antenais no X (à esquerda) e Y (direita) coordena. As linhas verticais no gráfico mostrado no vídeo indicam, da esquerda para a direita, a luz ON, PER, luz apagada e probóscide retração.

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.