Indocianina Verde Angiografia (ou AIV), realizado pela injeção veia da cauda fornece imagens de alta qualidade do curso tempo AIV para caracterizar anormalidades no rato coróide.
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Artigo de método
Detectar alterações no coróide Vasculature em um modelo do rato de Degeneração Macular relacionada com a Idade de-curso Tempo Indocianina Verde Angiografia
Neste artigo
Resumo
Resumo
Indocianina Verde Angiografia (ou AIV) é uma técnica realizada por oftalmologistas para diagnosticar anormalidades da coróide e da retina vasculatura de várias doenças oculares, como a degeneração macular relacionada à idade (DMRI). AIV é especialmente útil para a imagem da vasculatura coróide posterior do olho, devido à sua capacidade de penetrar através da camada pigmentada com o seu espectro de infravermelho. Curso de tempo AIV pode ser dividido em início, meio e fases tardias. As três fases fornecer informações valiosas sobre a patologia de problemas oculares. Apesar de curso de tempo AIV por via intravenosa (IV) de injeção é amplamente utilizado na clínica para o diagnóstico e tratamento de problemas de coróide, AIV por injeção intraperitoneal (IP) é comumente utilizado em pesquisas com animais. Aqui demonstramos a técnica para obter imagens de alta resolução do curso em tempo AIV em ratos por injeção venosa cauda e confocal de varredura a laser oftalmoscopia. Usamos essa técnica para a imagem da coróide lesões em um modelo de mouse relacionadas com a idade degeneração macular. Embora seja muito mais fácil de introduzir ICG para a vasculatura do rato por IP, os nossos dados indicam que é difícil obter imagens reprodutíveis do curso tempo ICGA por IP-AIV. Em contraste, AIV via injeção na veia da cauda fornece imagens de alta qualidade ICGA curso em tempo comparáveis aos estudos humanos. Além disso, mostramos que AIV realizado em camundongos albinos dá imagens mais nítidas de vasos da coróide do que aquela realizada em ratos pigmentados. Sugerimos que curso a tempo IV-AIV deve tornar-se uma prática padrão na pesquisa AMD com base em modelos animais.
Introdução
Angiografia com indocianina verde (AIV) é um teste de diagnóstico para problemas de imagem relacionados aos vasos sanguíneos no olho. O espectro de absorção de ICG varia 790-805 nm, enquanto que o espectro de emissão varia 770-880 nm, com o pico de emissão a 835 nm 1. Isto é diferente do outro corante popular, fluoresceína de sódio, cujo espectro cai na gama do visível. O espectro de infravermelho permite ICG para penetrar através do epitélio pigmentar da retina (RPE), fluido serosanguinolento, e exsudados lipídicos, os quais podem bloquear facilmente visualização por angiografia de fluoresceina baseado em fluoresceína de sódio (FA). ICG é de 98% na vasculatura, resultando em menos extravasamento ligado à proteína, permitindo reforçada imagiologia de vasos coroidais e lesões coróide 1,2. AIV é quase a única opção de visualizar vasos da coróide, que é posterior ao RPE. Figura 1 mostra a comparação de AIV e FA na vasculatura imagem em rato olhos. FA pode be utilizado para a imagem do bem vasculatura retiniana mas não a vasculatura de coróide. Em contraste, AIV pode ser utilizado para a imagem da retina e tanto vasculatura coróide. AIV é realizada com sistemas de imagem digital de alta resolução ou oftalmoscópios de varredura a laser (SLO) em conjunto com câmeras de vídeo infravermelho-sensíveis, que usaremos neste estudo.
Na clínica, AIV tem sido recomendado para o diagnóstico de uma série de distúrbios coriorretinianas envolvendo a vasculatura coroidal incluindo polipoidal coróide vasculopatia (PCV), Retinal angiomatoso Proliferação (RAP), estrias angióides, viteliforme distrofia macular, coriorretinopatia serosa central, hemangioma de coróide, hemorragia da retina macroaneurysms arteriolares, tumores da coróide, e certas formas de uveíte posterior 1,3. A combinação de AIV com FA e Tomografia de Coerência Óptica (OCT) fornecem ferramentas poderosas para os médicos no diagnóstico e tratamento de macular relacionada à idade exsudativadegeneração (AMD) 4-10. AIV é especialmente útil para o diagnóstico de condições que envolvem a coróide. Na verdade, AIV é considerada o padrão ouro para o diagnóstico de PCV, uma variante da DMRI exsudativa 11-13. PCV é caracterizada por uma rede de vasos de ramificação com dilatações polipoidal terminais na vasculatura coróide 11-13. PCV é freqüentemente associada com destacamentos serossanguinolenta recorrentes do EPR e retina com vazamento e sangramento das componentes polipoidal 11,14,15. Recentemente, relataram a geração do primeiro modelo animal PCV por expressar transgenicamente HTRA1 humano, uma serina-protease multi-funcional, no rato epitélio pigmentado da retina (RPE) 16. Nós mostramos que o aumento HTRA1 induzida características do PCV, por exemplo, lesões polipoidal.
Aqui demonstramos o uso do curso de tempo AIV por injeção na veia da cauda em pesquisa AMD usando o nosso modelo HTRA1 mouse. Nossos dados sugerem queIV-AIV é superior a IP (ou subcutânea (SC))-AIV que são actualmente usados no campo de 17,18 para a caracterização de lesões na coróide.
Declaração em Pesquisa Animal
Experimentos em animais foram realizados de acordo com protocolos aprovados pelo Institutional Animal Care e do Comitê Use (IACUC) e foram realizados de acordo com a Declaração de ARVO para o uso de animais em Ophthalmic and Vision Research.
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Protocolo
1. Preparação de Instrumentos
- O procedimento é realizado numa sala de procedimentos numa instalação para animais.
- Usar máscaras, gorros de cabelo, aventais cirúrgicos estéreis, pé-capas, luvas e antes de iniciar o experimento.
- Aquecer a água numa proveta de ~ 40 ° C numa placa de aquecimento.
- Colocar uma almofada azul estéril em cima de uma almofada de aquecimento que vai ser usado mais tarde para manter a temperatura do corpo do rato durante o exame. Ligue a almofada de aquecimento.
- Prepare o Sistema de Imagem:
- Retire a tampa protetora contra poeira e ligar o laser.
- Retire a lente de 55 ° e montá-lo na máquina.
- Abra o software de imagem do computador e insira as informações do mouse para a imagem latente sob a folha de um novo paciente (por exemplo, genótipo, idade, etc.). Em "Tipo de dispositivo", escolha o modo de infravermelho (IR).
Nota: Foi relatado que o uso of uma lente asférica dupla externa pode melhorar a qualidade de imagem 17-20 embora tenhamos nenhum problema na obtenção de imagens de alta qualidade pelo IV-AIV sem o uso de lentes externas (ver resultados representativos, Figuras 1-4).
2. Cauda Veia Injeção de AIV
- Dilatar rato olhos com 1% de solução oftálmica Tropicamida e esperar 5 min.
- Pesar o mouse para determinar a quantidade de anestesia (ketamina / xilazina / acepromazina 65-100/10-20/1-3 mg / kg) necessário.
- Recuperar uma seringa estéril de 1 ml, juntamente com uma agulha G 32. Injectar o rato por via intraperitoneal com os anestésicos (13 mg / ml de cetamina, 2,6 mg / ml de xilazina 0,3 mg / ml de acepromazina, em PBS estéril). Aguarde até que o mouse é totalmente anestesiado (~ 5 min).
- Coloque a cauda do rato em 40 ° C de água quente para causar vasodilatação da veia.
- Recuperar uma seringa de 1 ml com uma agulha G 32. Retirar a quantidade desejada de ICL, tipicamente 50 ul de 1 mg / mL de ICG, a qual é esterilizada por filtração com um filtro de seringa de 0,2 uM para um tubo estéril para um ratinho de 25 g (2 mg / kg). Tenha cuidado para não introduzir qualquer ar dentro da seringa.
- Seque a cauda com um algodão embebido em álcool para esterilizar a área a ser injectado.
- Segurar a cauda com uma mão, de modo que a veia lateral da cauda é ascendente. Com o bisel da agulha virada para cima, a agulha de injectar ~ 2 milímetros para dentro da veia com um ângulo mínimo. Tenha cuidado para não perfurar a veia. Retire-se a seringa ligeiramente e procurar vestígios de fluxo de sangue para dentro do cubo da agulha, o que indica que a agulha foi inserida dentro da veia com sucesso.
- Lentamente injetar ICG na veia. Deve haver resistência mínima ao injetar. Retire a agulha e aplique uma compressa de álcool diretamente ao local da injeção para ~ 5-10 seg para evitar qualquer sangramento. O mouse está pronto para a imagem latente. No fim de pegar a primeira fase (0-4 min após a injeção), é ESSEntial a imagem com o mouse rapidamente.
Nota: Mouse olhos podem facilmente ficar seca e pode desenvolver catarata sob anestesia. É importante manter o olho húmido através da aplicação de PBS estéril, durante o procedimento. Limpe o excesso de PBS com um cotonete estéril antes da gravação AIV. Outros laboratórios têm usado uma lente de contato para evitar a desidratação da córnea 17-20.
3. ICG Angiografia
- Comece a tirar fotos de 30-40 segundos após a injeção ICG, o que permite a captura da fase inicial de enchimento de coróide até circulações da retina e coróide são com brilho máximo (0-4 min). A vasculatura da retina é melhor visualizado em foco ~ 35-45 dioptrias e vasculatura coroidal é visualizado em 10-15 dioptrias.
Nota: Durante o primeiro exame de um modelo animal, recomenda-se a captura de imagens de todos os ângulos (nasal, temporal dorsal e ventral) para identificar todos abno possívelrmalities na vasculatura. Durante a fase inicial, ambas as artérias e veias da coróide médias e grandes são bem visualizados. No modelo animal usado neste protocolo, as lesões da coróide (por exemplo polipoidal dilatações) podem começar a aparecer 1 min para a fase precoce. - Defina o foco da imagem na vasculatura. Controle de brilho e foco usando o módulo de controle e botão de foco, respectivamente. Estes valores são ajustáveis digitalmente e são facilmente mantidos constantes. Mantenha a distância do olho do rato para a lente da câmara constante para assegurar uma qualidade de imagem é reprodutível utilizando a técnica que se segue.
Nota: Uma vez que o dispositivo só pode uma imagem de parte do olho posterior, vamos tentar manter o foco, o brilho, ea distância entre a lente da câmera eo olho do rato constante à medida que a imagem inteira do olho posterior a partir de ângulos diferentes. A chave para isso é alinhar a luminescência em forma de círculo emitida pelo ICG através do olho com o campo de view da câmara. Isto é realizado, fazendo da esquerda para a direita, os ajustes para cima e para baixo, e em-e-para fora da posição da câmera até que a imagem inteira não tem áreas escuras. Quando o luminescência e do campo de visão da câmara estão alinhados, a distância do olho para a lente vai ser reprodutível para o próximo conjunto de imagens, bem como a uma distância óptima para a imagem de qualidade. - Uma vez que a vasculatura está em foco, capturar os quadros de imagem, premindo o botão preto redonda sobre o módulo de aquisição. O botão redondo preto também pode ser usado para reduzir ou aumentar o sinal de ICG para a melhor qualidade de imagem.
- Determine o ângulo de visão ideal e profundidade de focagem para lesões coróide imagem. É importante manter a posição do olho, a profundidade de focagem, e outras configurações de dispositivos fixos de todo o curso de AIV-tempo. As imagens são salvas pressionando botão adquirir no painel da tela de toque do módulo de aquisição.
- Adquirir imagens na fase intermediária de 6-15 min popainjeção er.
Nota: Tanto a coróide e vasos da retina tornam-se menos distinta. Vasculatura coróide aparece fluorescência difusa. Lesões da coróide expositoras hiperfluorescência emergir em contraste com o desvanecimento circundante normal, a fluorescência de fundo. - Adquirir as imagens da fase tardia de 17-25 minutos após a injeção.
Nota: hiperfluorescência desaparece. Ambos os vasos da coróide e da retina não são mais visíveis. A cabeça do nervo óptico torna-se preto. Lesões coróide hiperfluorescente tem contraste máximo com o fundo desaparecendo. - Depois de terminar a aquisição de imagens, aplicar um gel lubrificante ocular claro para rato olhos e deixar o mouse em uma almofada de aquecimento para a recuperação.
- Retornar ratos para suas gaiolas e área de espera. Exportar imagens como arquivos TIFF ou JPEG, para posterior análise.
Nota: O tempo de cada fase não é absoluta. Descobrimos que o tempo de eAfase ch pode mudar, dependendo da quantidade de ICG injetado. Mais ICG tende a prolongar a cada fase. A melhor maneira de definir uma fase é de acordo com as principais características de cada uma das fases acima.
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Resultados
Foi realizado curso de tempo AIV em camundongos transgênicos HtrA1 e ninhada WT de controle, sendo que ambos estão no fundo CD1. O fundo CD1 albino foi escolhida para facilitar a angiografia com indocianina verde (AIV) imagem (ver discussão). Alguns aneurisma como dilatações começaram a aparecer na fase inicial do rato HTRA1 (Figura 2, uma seta vermelha indica a dilatação na ponta de um navio e um círculo vermelho indica uma lesão polipoidal tipo cluster). Os vasos coróides são claramente visíveis em am...
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Discussão
Neste estudo, demonstramos o uso de AIV a imagem lesões coróide em camundongos transgênicos HtrA1. As características do início, do meio e fases tardias da AIV no nosso modelo do rato corresponde ao longo do tempo bem em estudos humanos 1. Isso é importante para fazer melhores comparações entre patologia e animais fenótipos humanos, que são de valor inestimável para a pesquisa sobre mecanismos fisiopatológicos e estratégias de tratamento de condições relacionadas com a coróide como AMD.
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Divulgações
YF é um inventor de duas patentes pendentes que são relevantes para o modelo do rato AMD utilizado neste trabalho. SK, ZB, e ADJ tem nada a revelar.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pelo NIH conceder 1R01EY022901, o Prêmio de Desenvolvimento de Carreira de Investigação para Prevenir Cegueira (RPB), CMReeves & MA Reeves Foundation, E. Matilda Ziegler Foundation for the Blind, Cavaleiros Templários Fundação Eye, e um donativo incondicional ao Departamento de Oftalmologia na Universidade de Utah do RPB. Agradecemos Balamurali Ambati para assistência técnica no Spectralis Multi-Modalidade Imaging System e Zhang Tao para discussões e comentários sobre o manuscrito.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Sistema de imagem multimodal Spectralis | Heidelberg Engineering, Alemanha | SPECTRALIS HRA+OCT | |
| (1%) | Bausch & Lomb | NDC 24208-585-64 | para dilatação de pupilas |
| GenTeal Gel | Genteal | NDC 58768-791-15 | Gel Lubrificante Transparente para os Olhos |
| Cetamina | Vedco Inc | NDC 50989-996-06 | |
| Xilazina | Lloyd Laboratories | NADA 139-236 | |
| Acepromazina | Vedco Inc | NDC 50989-160-11 | |
| 32-G Agulha | Steriject | PRE-32013 | |
| Seringa de 1 ml | BD | 309659 | |
| Indocianina Verde | Pfaltz & Bauer | I01250 |
Referências
- Duane, T. D., Tasman, W., Jaeger, E. A. Chapter 4a, Indocyanine Green Angiography. Duane's clinical ophthalmology on CD-ROM. , Lippincott Williams & Wilkins. Philadelphia. (2002).
- Alfaro, D. V. Age-related macular degeneration : a comprehensive textbook. , Lippincott Williams & Wilkins. (2006).
- Yannuzzi, L. A. Indocyanine green angiography: a perspective on use in the clinical setting. Am. J. Ophthalmol. 151, 745-751 (2011).
- Destro, M., Puliafito, C. A. Indocyanine green videoangiography of choroidal neovascularization. Ophthalmology. 96, 846-853 (1989).
- Scheider, A., Schroedel, C. High resolution indocyanine green angiography with a scanning laser ophthalmoscope. Am. J. Ophthalmol. 108, 458-459 (1989).
- Guyer, D. R., et al. Digital indocyanine-green angiography in chorioretinal disorders. Ophthalmology. 99, 287-291 (1992).
- Yannuzzi, L. A., Slakter, J. S., Sorenson, J. A., Guyer, D. R., Orlock, D. A. Digital indocyanine green videoangiography and choroidal neovascularization. Retina. 12, 191-223 (1992).
- Regillo, C. D., Benson, W. E., Maguire, J. I., Annesley, W. H. Indocyanine green angiography and occult choroidal neovascularization. Ophthalmology. 101, 280-288 (1994).
- Scheider, A., Kaboth, A., Neuhauser, L. Detection of subretinal neovascular membranes with indocyanine green and an infrared scanning laser ophthalmoscope. Am. J. Ophthalmol. 113, 45-51 (1992).
- Kuck, H., Inhoffen, W., Schneider, U., Kreissig, I. Diagnosis of occult subretinal neovascularization in age-related macular degeneration by infrared scanning laser videoangiography. Retina. 13, 36-39 (1993).
- Imamura, Y., Engelbert, M., Iida, T., Freund, K. B., Yannuzzi, L. A. Polypoidal choroidal vasculopathy: a review. Surv. Ophthalmol. 55, 501-515 (2010).
- Ciardella, A. P., Donsoff, I. M., Yannuzzi, L. A. Polypoidal choroidal vasculopathy. Ophthalmol. Clin. N. Am. 15, 537-554 (2002).
- Spaide, R. F., Yannuzzi, L. A., Slakter, J. S., Sorenson, J., Orlach, D. A. Indocyanine green videoangiography of idiopathic polypoidal choroidal vasculopathy. Retina. 15, 100-110 (1995).
- Coppens, G., Spielberg, L., Leys, A. Polypoidal choroidal vasculopathy, diagnosis and management. Bull. Soc. belge d'Ophtalmol.. , 39-44 (2011).
- Tsujikawa, A., et al. Pigment epithelial detachment in polypoidal choroidal vasculopathy. Am. J. Ophthalmol. 143, 102-111 (2007).
- Jones, A., et al. Increased expression of multifunctional serine protease, HTRA1, in retinal pigment epithelium induces polypoidal choroidal vasculopathy in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 14578-14583 (2011).
- Alex, A. F., Heiduschka, P., Eter, N. Retinal fundus imaging in mouse models of retinal diseases. Methods Mol. Biol. 935, 41-67 (2013).
- Seeliger, M. W., et al. In vivo confocal imaging of the retina in animal models using scanning laser ophthalmoscopy. Vision Res. 45, 3512-3519 (2005).
- Fischer, M. D., Zhour, A., Kernstock, C. J. Phenotyping of mouse models with OCT. Methods Mol. Biol. 935, 79-85 (2013).
- Jian, Y., Zawadzki, R. J., Sarunic, M. V. Adaptive optics optical coherence tomography for in vivo mouse retinal imaging. J. Biomed. Opt. 18, 56007 (2013).
- Ciardella, A. P., Donsoff, I. M., Huang, S. J., Costa, D. L., Yannuzzi, L. A. Polypoidal choroidal vasculopathy. Surv. Ophthalmol. 49, 25-37 (2004).
- Sasahara, M., et al. Polypoidal choroidal vasculopathy with choroidal vascular hyperpermeability. Am. J. Ophthalmol. 142, 601-607 (2006).
- Silva, R. M., et al. Polypoidal choroidal vasculopathy and photodynamic therapy with verteporfin. Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 243, 973-979 (2005).
- Yannuzzi, L. A., et al. Polypoidal choroidal vasculopathy masquerading as central serous chorioretinopathy. Ophthalmology. 107, 767-777 (2000).
- Janssen, A., et al. Abnormal vessel formation in the choroid of mice lacking tissue inhibitor of metalloprotease-3. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 49, 2812-2822 (2008).
- Ding, X., Patel, M., Chan, C. C. Molecular pathology of age-related macular degeneration. Prog. Retin. Eye Res. 28, 1-18 (2009).
- Grossniklaus, H. E., Kang, S. J., Berglin, L. Animal models of choroidal and retinal neovascularization. Prog. Retin. Eye Res. 29, 500-519 (2010).
- Pennesi, M. E., Neuringer, M., Courtney, R. J. Animal models of age related macular degeneration. Mol. Aspects Med. 33, 487-509 (2012).
- Elizabeth Rakoczy, P., Yu, M. J., Nusinowitz, S., Chang, B., Heckenlively, J. R. Mouse models of age-related macular degeneration. Exp. Eye Res. 82, 741-752 (2006).
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Reimpressões e permissões
