Análise Funcional do circuito de alimentação das larvas em Drosophila</i

Resumo

O circuito de alimentação em larvas de Drosophila melanogaster serve um modelo simples, mas poderosa que permite mudanças na taxa de alimentação a ser correlacionada com alterações no circuito neural stomatogastric. Este circuito é composto por neurónios serotonérgicos centrais que enviam projecções para os ganchos na boca, bem como o tubo digestivo anterior.

Resumo

O circuito de alimentação serotonérgica em larvas de Drosophila melanogaster pode ser usado para investigar substratos neuronais de importância crítica durante o desenvolvimento do circuito. Usando a saída funcional do circuito de alimentação, alterações na arquitectura neuronal do sistema estomatogástrico pode ser visualizado. Comportamento alimentar pode ser registada por meio da observação da taxa de retracção dos ganchos na boca, que recebem a inervação do cérebro. Comportamento locomotor é usado como um controlo fisiológico da alimentação, uma vez que as suas larvas usar ganchos na boca para percorrer através de um substrato de agar. Alterações no comportamento alimentar pode ser correlacionada com a arquitectura axonal das neurites que inervam o intestino. Usando imunohistoquímica é possível visualizar e quantificar essas mudanças. O manuseio inadequado das larvas durante paradigmas de comportamento pode alterar dados como eles são muito sensíveis a manipulações. Imagem adequada da arquitetura neurite inervaçãoo intestino é crítica para a quantificação exacta do número e tamanho das varizes, bem como o grau de nós de ramificação. Análise da maioria dos circuitos de permitir apenas a visualização da arquitetura neurite ou efeitos comportamentais, no entanto, este modelo permite correlacionar a saída funcional do circuito com as deficiências na arquitetura neuronal.

Introdução

Drosophila é um sistema modelo extremamente poderosa para o estudo do desenvolvimento neural circuito devido ao tempo de geração rápidos e de baixo custo experimental, e a capacidade de manipular e controlar os factores genéticos e ambientais. Neurogênese, descoberta caminho neuronal e sinaptogênese são conservados entre os humanos e Drosophila, portanto os mecanismos de criação, manutenção e modificação de circuitos neurais são conservadas também.

Neurotransmissores clássicos, como a serotonina (5-hidroxitriptamina ou 5-HT) podem servir como fatores de crescimento antes de adotar seus papéis como moléculas de sinalização no circuito neural maduro ^1-3 Estudos anteriores demonstraram que os níveis perturbado de 5-HT durante o desenvolvimento embrionário altera a conectividade de neurónios maduros ^4. Outros mostraram que a aplicação ectópica de 5-HT dos neurónios Helisoma reprimir o crescimento de neurites em cultura, bem como sinaptogénese ^5-7. Em Drosophila, desenvolvimento níveis de 5-HT está inversamente relacionada com o número e tamanho varicosidade, bem como o grau de arborização urbana, ao longo do comprimento de neurites que se projectam para o intestino anterior do SNC ^8.

Neurotransmissão serotonérgica foi mostrado para modular comportamentos alimentares em diversas espécies, incluindo Drosophila ^8-9. O circuito de alimentação em Drosophila é um circuito relativamente simples que pode ser usado como um modelo para correlacionar a saída funcional (alimentação) com alterações no desenvolvimento das projecções axonais do cérebro para o intestino anterior. Schoofs et al. têm mostrado que a Drosophila alimentação larval é regulada por geradores de padrão central que influenciam a musculatura ^10. Embora a anatomia muscular específico não é completamente compreendido, tem sido mostrado que o nervo da antena, nervo maxilar, e nervo acessório protorácico são responsáveis ​​pelas metas musculares envolvidos nocomportamento alimentar. A maioria dos dados que envolvem a musculatura e nervo anatomia de alimentação de invertebrados é limitado a larvas Calliphora.

A taxa de alimentação de larvas de segundo instar pode ser avaliada pela retração dos sclerites cefalofaringeano (ganchos na boca), e é reprodutível e de alto rendimento. As placas cefalofaringeano são inervados por fibras do centro de neurônios de 5-HT através do nervo frontal. O proventrículo, ou intestino anterior, é inervado por fibras serotoninérgicos (recurrens nervo) que fasciculada no intestino médio e são responsáveis ​​por contrações do intestino anterior (Figura 1) ^11-12. Alterações na ramificação axonal, e o número e tamanho das varizes ao longo do comprimento da neurite, pode ser quantificada utilizando técnicas de imuno-histoquímica. Manipulando neuronal da 5-HT durante o desenvolvimento, quer directa quer indirectamente, pode alterar a saída funcional do circuito de alimentação, que pode ser avaliada e correlacionadas com as mudanças na morphology da arquitetura neurite.

Protocolo

1. Manutenção de Gaiolas População

1. Manter gaiolas população a 25 ° C num ciclo de luz-escuro de 12 h. Enquanto os grupos de controlo e experimentais estão expostas às mesmas condições de iluminação, esta técnica pode ser realizada em ambiente de laboratório padrão.
2. Permitir fêmeas põem ovos durante a noite em placas de ágar-suco de maçã.
3. Recolha de larva, mantendo as placas com os ovos depositados recentemente, a 25 ° C durante 24 hr. Colocar uma pequena dose de levedura no meio da chapa para atrair as larvas eclodidas.
4. Recolhe 1 ^r larvas que migraram para a pasta de levedura, no centro da placa de sumo de maçã. Use uma espátula de metal para transferi-lo para uma placa de suco de maçã fresca. Pasta de levedura adicional pode ser adicionado para garantir que não é uma alimentação adequada até que os ensaios são realizados. Placas de sumo de uva, também pode ser usado no lugar de placas de sumo de maçã.
5. Obter tarde 2 ^ª e início 3 ^º instar larvae permitindo 1 ^º ínstar de idade para 40-48 horas. Dentro desta faixa das taxas de alimentação são constantes ^13. A idade pode ser confirmado por meio de exame dos ganchos na boca uma vez que existem alterações distintas na estrutura desta com cada um muda de larvas.
6. Tarde 2 larvas 3 ^{ª nd-precoce} são coletados para ensaios de comportamento suavemente e extensivamente lavando pratos suco de maçã com água e coleta de larvas em um filtro de malha. As larvas são então transferidos para uma placa de ágar.
7. Todas as análises são realizadas em paralelo com o controlo e animais experimentais.

2. Paradigma Comportamental - Locomotion

1. Colocar uma única larva de instar 3 ^rd sobre um substrato de agar a 2% em 100 milímetros de cultura de tecidos de prato e permitir a larva para aclimatar-se durante 30 seg. Larvas usar seus sclerites cefalofaringeano (ganchos boca) para impulsionar seus corpos em toda a superfície do substrato de ágar. Isso é feito em um prato separado, porque eut é mais difícil de visualizar as contracções do corpo na solução de levedura como o animal é quase a mesma cor que a levedura.
2. Observar e registrar cada posterior ao movimento anterior sobre o substrato por um período de 1 min. n = 20 para cada genótipo. Não mais do que 10 animais deverão ser analisadas por placa.

3. Comportamento Paradigma - Alimentação

1. Usando rombas Inox # 5 pinças, transferir cuidadosamente o estádio de larva 3 ^rd da placa de agar locomotora para o centro de uma placa de ágar-cheia coberto com 5 ml de solução de 2% de levedura de padeiro activado. Certifique-se de que a solução é homogênea como o fermento vai resolver com o tempo. Quando na solução de levedura, as larvas em grande parte permanecem no local e alimentação, facilitando a observação do comportamento. A taxa de contracções gancho boca correlaciona-se directamente com a quantidade de alimento ingerido ^14.
2. Permitir larva para se aclimatar para 30 seg.
3. Observar e registrar o número decontrações gancho na boca por um período de 1 min. n = 20 para cada genótipo.

4. Dissecções Gut larval

1. Faça uma solução fixação em formol EM-grau 4% em tampão fosfato 1x (PBS) e coloque em um copo ponto 3 poços.
2. Dissecar cuidadosamente vagando tarde 3 ^º instar coragem de larvas em um prato de vidro 3-bem com solução PBS 1x, certificando-se de cada vez que o proventrículo é deixada intacta. Com uma pinça, segure a extremidade posterior, e com a outra, segure os ganchos na boca. Enquanto segura o imóvel extremidade posterior, puxe delicadamente sobre os ganchos na boca para ter acesso a coragem. Remova todos os tecidos associados (glândulas salivares, cérebro, corpo de gordura, etc), em seguida, transferir cada intestino para o prato 3 poços contendo a correção formaldeído. Vagando 3 ^º instar larva são usados ​​porque nesta fase de desenvolvimento, a larva deixa de se alimentar em preparação para pupariation, eo proventrículo é limpo de levedura.
3. Incubar entranhas a 4 ° C durante a noite numa caixa de cultura de tecido opaco.
4. Antes de retirar solução fixação em formol a partir de poços, remova o ceco gástrico e prenda o intestino médio ~ 150 ï ¿½ ² do proventrículo de modo que as projeções podem ser claramente vistos sem impedimento.
5. Retirar correcção de formaldeído a partir de poços e substituir com 1x PBT (1x PBS, 0,1% livre de protease de albumina de soro bovino, X-100 0,1% de Triton) solução tampão. Lave coragem 6x por 10 min em 1x PBT. Coloque amostras de tecido em um rotor mecânico ao fazer lavagens.
6. Incubar a 4 ° C durante 1 hora em 10 ^-6 M de 5-HT para melhorar a sinalização da serotonina. Lave coragem 6x por 10 min em 1x PBT. Estudos anteriores demonstraram que esta concentração de exógena 5-HT não afeta a arquitetura neuronal ou densidade varicosity em análises de imuno-histoquímica e simplesmente aumenta o sinal de ruído ^15-16.
7. Incubar a 4 &# 176; C durante a noite em anticorpo primário anti-serotonina (monoclonal criado em mouse ou policlonal em coelho). Lave coragem 6x por 10 min em 1x PBT. Coloque amostras de tecido em um rotor mecânico ao fazer lavagens.
8. Incubar a 4 ° C durante 90 min, em anticorpo secundário (Alexa Fluor 568 anticorpo de cabra anti-ratinho ou anti-IgG de coelho, diluição 1:400). Lave coragem 6x por 10 min em 1x PBT. Coloque amostras de tecido em um rotor mecânico ao fazer lavagens.
9. Incubar em carbonato de sódio 4 mM durante 10 min num rotor mecânico, em seguida, montar em 4% de n-propilo gallate/20 mM de carbonato de sódio, e vista sob fluorescência. O carbonato de sódio é utilizada para converter as amostras para o tampão e o pH utilizado nos meios de montagem.
10. Capturar imagens de amostras de tecidos com a ampliação de 400X imunocoradas para análise.

5. Análise de Neural dos circuitos

1. Fibras de neurites foi quantificado (número e tamanho das varizese grau de ramificação) usando Neuroleucida e Neuroexplorer. No entanto, isso também pode ser feito manualmente ou utilizando o Simple Neurite Tracer (um aplicativo gratuito que pode ser baixado online).
2. Trace as projeções de fibra individuais do cérebro para o proventrículo e quantificar número varicosity, ramos e do número de grandes varizes por unidade de comprimento. As fibras axonais projetando a partir do cérebro são empacotados no nervo recurrens e não são acessíveis para análise até atingirem o proventrículo, onde eles se separam e fasciculada.

Resultados

O circuito de alimentação serotoninérgica no larva Drosophila pode servir como um modelo extremamente eficaz para observar a influência de fatores específicos no desenvolvimento do sistema nervoso. Quantificando taxa de alimentação, é possível ligar a arquitectura axonal do circuito de alimentação, com a sua saída funcional (Figura 1). O ensaio locomotor é usado como um controlo fisiológico para as retracções dos ganchos na boca, uma vez que as suas larvas usar ganchos na boca para impulsionar-...

Discussão

Desenvolvimento aberrante do circuito stomatogastric serotoninérgica, que ocorre durante o final de embriogênese, afetará a sua função madura. As alterações na arquitectura de neurites que inervam o intestino pode ser correlacionada com a saída funcional do circuito, que é a taxa de alimentação (medido por contracções gancho boca numa solução de levedura) (Figura 1). O uso do sistema bipartido UAS-Gal4 em Drosophila torna possível visar especificamente para cima ou para baixo regulado a express...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Microscópio Eclipse E-800	Nikon Instruments
Neuroleucida	MBF Biosciences	NL-15	Usado para analisar a arquitetura da fibra intestinal, não é necessário ter
software	de imagem Northern	Eclipse Empix Inc
G-2E/C TRITC EX 528-553	Nikon Instruments	96312	Filtro para anticorpo
secundário específicoN.A. 0,75; W.D. 0,72 mm; Prisma DIC: 40xI, 40x I-C; Objetiva de Nikon	Instruments	MRH00400	mola usada para imagens
Simple Neurite Tracer	NIH Image J		http://fiji.sc/Simple_Neurite_Tracer

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