Entrega celular intramiocárdico: Observações em murino Corações

Resumo

Entrega célula intramio em modelos murinos de doenças cardiovasculares, como a hipertensão ou o enfarte do miocárdio, é amplamente utilizado para testar o potencial terapêutico de diferentes tipos celulares em estudos de regeneração. Portanto, uma descrição detalhada e uma visualização clara deste procedimento cirúrgico ajudará a definir os limites e as vantagens das análises terapêuticas celulares cardiovasculares em pequenos roedores.

Resumo

Estudos anteriores mostraram que a entrega de células promove a melhora da função cardíaca pela liberação de citocinas e fatores que aumentam a revascularização do tecido cardíaco e sobrevivência celular. Além disso, observações adicionais revelaram que as células estaminais específicos, tais como células estaminais cardíacas, células estaminais mesenquimais e cardiospheres têm a capacidade de integrar no interior do miocárdio circundante através da diferenciação em cardiomiócitos, células de músculo liso e células endoteliais.

Aqui, apresentamos os materiais e métodos para entregar confiantemente células não contrátil na parede do ventrículo esquerdo de camundongos Imunodeprimido. Os passos mais salientes deste procedimento microcirúrgico envolve anestesia e analgesia injeção, intubação orotraqueal, a incisão para abrir o peito e expor o coração e entrega de células por uma agulha estéril de calibre 30 e uma seringa de precisão microlitro.

Processamento de tecidos que consiste em colher coração, embedding, o seccionamento e a coloração histológicos mostraram que a injecção de células intramio produzido um pequeno dano na área do epicárdio, assim como na parede do ventrículo. Células não contrátil foram mantidas na parede do miocárdio de ratos imunocomprometidos e foram rodeados por uma camada de tecido fibroso, para o proteger de pressão cardíaca e carga mecânica.

Introdução

Vários protocolos de entrega de células foram testados em modelos murinos e de ratazana de doenças cardiovasculares, com o objectivo de traduzir a eficiência, a eficácia e segurança deste procedimento experimental em pacientes humanos. Em pequenos corações de roedores, a entrega de células mostrou ser o método mais viável de fornecimento de células ^{de 1,2,} enquanto que no anterógrada coração de rato ³ e infusão de células ⁴ intracoronária retrógrado também pode ser usado. Ambos os métodos têm limitações e vantagens. Entrega celular por via intracoronária tem vantagens teóricas sobre injeção intramuscular direto em promover a disseminação de células mundial ^3, mas também tem o risco de causar ^3,5 embolia coronária. Limitações à entrega intramiocárdica estão associados a danos mecânicos, inflamação aguda e danos ^6,7 miocárdio. Em humanos, as células para o reparo cardíaco são entregues pela injeção transmural através de um epicardial endocárdio ou cirúrgicoaproximar ou por via arterial intracoronária ^8. Injeção por via transvascular é adequado em pacientes com infarto agudo do miocárdio e reperfundido, mas pode não ser possível em caso de oclusões totais ou fluxo de pobres dentro dos vasos do território efetuada ^9. Injeção direta na parede ventricular por injeção transendocárdica ou transepicárdica é tecnicamente viável, dependendo do estado de saúde do paciente. De facto, tem sido demonstrado que esta técnica é segura ^10,11, embora injectável transepicárdica é necessária uma cirurgia de peito aberto e para transendocárdica se aproxima de um mapeamento electrofisiológico para cada paciente é necessário diferenciar sítios de miocárdio isquémico ou cicatrizes viável ^9.

É importante ressaltar que em estudos de terapia celular a escolha do melhor celular para ser transplantado ainda está sob investigação. Análises de curto prazo (4 semanas) mostrou que a injeção de células-tronco cardíacas definidas como cardiospheres 12 ou células população lado da medula óssea induzida ¹³ recuperação funcional cardíaca em murinos ¹⁴ e ratos ¹⁵ modelos de infarto do miocárdio, diminuindo o tamanho da cicatriz e morte celular. Transplante alogênico de cardiospheres em um modelo de infarto do miocárdio de ratos sem imunossupressão foi encontrado para ser seguro, promoveu a regeneração cardíaca, e melhora da função cardíaca através da estimulação dos mecanismos de reparação endógenas ^15. Lin-/c-kit + adultos células progenitoras no coração mostraram-se auto-renovar, clonogénicas, e multipotentes in vitro e in vivo e, quando injectado num coração isquémico rato reconstituído grandes porções da parede do miocárdio lesionado e ¹⁶ tiveram o capacidade de formar artérias coronárias condutora e de tamanho intermediário ^17. Estes dados promissores alimentado fase I e II de ensaios clínicos em seres humanos: A injeção de células-tronco mesenquimais autólogas e alogênicos (MSC) ^{18, 19} cardiospheres, ou células-tronco cardíacas positivas c-Kit (CSC) 20 nos corações humanos isquêmicos cada mostrou efeitos benéficos na função cardíaca em estudos a longo prazo. No entanto, extensivo a longo prazo de acompanhamento e retrospectiva meta-análise demonstrou que a terapia com células-tronco fornece benefício significativo para alguns pacientes, mas não em outros, com uma série de resultados imprevisíveis ^21. É possível que essas limitações necessitará da criação de protocolos específicos de distribuição de célula para cada indivíduo e cada doença.

Em modelos de ratos e ratos, estudos de longo prazo revelaram que a injeção de células não melhorar a função cardíaca (12 meses). Com efeito, os enxertos de células derivadas de cardiomiócitos estaminais embrionárias humanas (células estaminais embrionárias humanas-CM) foram isoladas do hospedeiro do miocárdio por uma camada de tecido fibroso ^22,23. Resultados similares foram observados após o transplante de mioblastos esqueléticos intramiocárdica no coração de ratos infartados ^24. Furthermore, a capacidade de longo prazo de MSCs alogénicas para preservar a função do coração enfartado foi limitado por uma transição de um estado para immunoprivileged imunogénico após diferenciação ^25.

Levando em consideração os desafios e as perspectivas descritas acima, mostramos aqui como entregar as células pela injeção transmural em camundongos. Observamos que as células sem propriedades contráteis de cardiomiócitos não estão relacionadas com o miocárdio hospedeiro e formam uma massa coesa com uma barreira fibrótica fina. Embora, em alguns casos, este resultado pode ser vantajoso, a seguinte análise pode ser útil para compreender como enxerto de células pode ser modulado de modo a gerar estruturas miocárdio funcionalmente ligados bem.

Protocolo

Todos os estudos com animais foram realizados em conformidade com as normas internacionais (Directiva 2010/63/UE do Parlamento Europeu) e nacional (UK Home Office, Act 1986) regulamentos. Os procedimentos descritos neste documento fazem parte do nosso plano de trabalho sob licença autoridades do Reino Unido e que não tenham sido realizadas com a finalidade de gravação.

1. Preparação de Células

Este protocolo descreve a preparação de uma linha celular específica (rim embrionário humano, células HEK293) para fins de demonstração. Protocolos específicos de células deve ser empregue para o cultivo e, eventualmente, diferenciando pluripotentes ou células estaminais adultas em linhagens celulares específicas.

1. Cultivar células em meio DMEM (glucose elevada, 4,500 mg / L) contendo piruvato de sódio 1%, 2 mM de glutamina, 1% de antibiótico de Pen / Strep e 10% de soro fetal bovino (FBS). Uma placa de 10 centímetros deve ser normalmente dividida em 1:03 e meio suplementado fresco a cada dois dias.
2. Trate células levemente com Trypsem 1x e ressuspender em meio DMEM, como descrito em 1.1.
3. Contar as células numa câmara hemocitómetro e recolher 3 x 10 ⁶ células para um tubo separado.
4. Centrifugar em um balanço balde rotor a 100 g por 5 min.
5. Descartar o sobrenadante e lava-se o sedimento de células com tampão de fosfato estéril 2x.
6. Ressuspender em PBS 1x a uma concentração de 10 ^6/50 ^ para ser injectada no ventrículo esquerdo de ratos Imunodeprimido.

2. Condições pré-cirúrgicas

1. Manter camundongos Imunodeprimido (NOD.CB17-Prkdscid/JHliHSD) com grânulos estéreis de alimentos e água em um isolador de temperatura controlada (22 ° C; Tabela 1) antes de cada cirurgia.
2. Realizar a cirurgia de camundongos Imunodeprimido sob uma capela de fluxo laminar. Limpe a área de trabalho com 70% de etanol e autoclave instrumentos cirúrgicos (pinças e tesouras).
3. Ligue almofadas de aquecimento para a cirurgia e para a recuperação. Almofadas de aquecimento são importantespara bloquear a redução da temperatura corporal que ocorre durante e pós-cirurgia.
4. Coloque uma gaiola limpa e esterilizada no bloco de recuperação-aquecimento.
5. Transportar os ratos em suas gaiolas originais do isolador para a sala de cirurgia em uma bolsa estéril autoclavada.
6. Pesa-se o rato e de acordo com o peso corporal injectar por via subcutânea (sc) de uma solução contendo cloridrato de cetamina e medetomidina, diluída em solução salina estéril a 0,9%, para anestesiar o rato, assim como para relaxar a musculatura (medetomidina 1 mg / kg; cloridrato de cetamina 75 mg / kg).
7. Remover o rato da gaiola quando totalmente anestesiados (dentro de 1-2 min, nenhum reflexo toe-pitada após estimulação)
8. Aplicar creme de depilação no lado esquerdo do peito e da área da garganta. Depois de uma quantidade adequada de tempo (cerca de 2-5 min), limpe os cabelos soltos com um tecido molhado em água.
9. Posicione o mouse no painel de cirurgia em decúbito dorsal. A partir deponto de vista do cirurgião, a posição é vertical, cauda para baixo da cabeça para cima.
10. Injectar solução analgésica em 0,1-0,2 ug / g diluídos em solução salina estéril (buprenorfina) subcutaneamente no membro posterior e cobrir a área raspada com a solução de iodo povidona asséptica usando um aplicador com ponta de algodão.
11. Concentre-se o microscópio (objetiva 2.5X) na área da garganta.

3. Condições cirúrgicas

1. Com uma tesoura sem corte fazer uma incisão na pele ventral mediana de cerca de 0,5-1 cm de comprimento um pouco abaixo da cartilagem cricóide. Separa-se a pele do tecido conjuntivo para visualizar as glândulas salivares.
2. Dividir as glândulas salivares em sua divisão de linha média naturais puxando simultaneamente cada parte para um lado com retrator peito pinça e magnético e expor a traquéia.
3. Puxar a língua suavemente para o lado a expor a laringe. Deslize o tubo de intubação com cuidado na traquéia. A ponta do tubo é visível através da l exibidoarynx e traquéia. Mais importante, se o tubo está no, mas não são claramente visíveis, é no esófago. Removê-lo e alterar a posição da ponta do tubo.
4. Conectar o tubo à máquina de ventilação. Defina o volume de curso a 200 mL e 150 AVC / min. Fixe o tubo de ventilação no painel cirurgia com uma fita.
5. Com uma tesoura sem corte e uma pinça, faça uma cauda vertical para cabeça 1 - a 1,5 cm da pele de longa incisão sobre a área do tórax esquerdo.
6. Solte a pele das camadas de tecido / musculares e conjuntivos as maiores e menores músculos peitorais sem fazer incisões.
7. Toracotomia entre as terceira e quarta costela como se segue:
   1. Perfurar a camada de músculo intercostal beliscando e arranhando com pequenas pinças arredondadas.
   2. Uma vez que a camada de músculo intercostal é perfurado, coloque o afastador peito para abrir ao máximo a cavidade torácica. As partes superior e médio do ventrículo esquerdo (VE) com a sua orelha sobrejacente (átrio) sãoagora visível.
8. Prepara-se uma seringa de precisão com as células. A seringa deve ser capaz de fornecer uma quantidade de volume de 10 ul de cada injecção. Lançar uma agulha G 30, com a ponta da seringa.
9. Fixar com fita adesiva uma pequena cânula de plástico (de um Introcan-W 20 L) em que a agulha, deixando exposta apenas 1 mm, incluindo a ponta aberta da agulha. Isto vai evitar que a agulha perfura a parede do ventrículo esquerdo e toda a injecção das células no interior da cavidade do ventrículo esquerdo.
10. Com a ajuda de um objetivo 5X, visualizar com este aumento, o ventrículo esquerdo e injetar as células na parede do ventrículo esquerdo em 5 locais diferentes (cada injeção vai entregar 10 ul para um total de 106 células injetadas). Se a injecção for bem sucedido, uma área branca e na ausência de grande retrolavagem das células será visível (se a injecção, não foi bem sucedida, o animal seriam excluídos da análise funcional).
11. Retire o afastador. Feche a parede torácica by juntando as duas nervuras separadas com dois pontos de sutura de seda 6-0.
12. Hidratar os músculos peitorais e pele com um cotonete embebido em PBS 1x e gentilmente colocou os músculos de volta para a posição original com a pinça.
13. Feche a pele com 3-4 pontos de sutura 6-0 seda. Suturar a incisão na garganta com 2-3 pontos para fechar a pele.
14. Injetar atipamezole (1 mg / kg de concentração final) para reverter os efeitos anestésicos.
15. Assim que o rato começa a respirar de forma autônoma, tirar o tubo da traquéia e coloque o mouse sobre o seu lado direito. O mouse deve se recuperar em poucos minutos.
16. Quando o rato começa a girar e andar, colocá-lo na gaiola de recuperação quente (gaiola pequena IVC com top filtrada fechado) por uma hora.
17. Deixar os animais durante a noite numa caixa aquecida controlada (37 ° C).
18. Encha um prato com água e alimentos pellet para apoiar a recuperação durante os primeiros 2 dias após a cirurgia.

4. As análises pós-cirurgia

Dez corações injectados com células de controlo e 10 corações não injectados são analisados ​​histologicamente como se segue:

1. Realizar a análise das células enxertadas de 1 semana após a injecção (Figuras 1 e 3).
   1. Após a eutanásia por overdose de isoflurano, perfuse os corações com 20 ml de paraformaldeído 4% (PFA) para fixar o tecido. Desidratar o tecido fixado em percentagens crescentes de etanol (70-100%) e incorporar em blocos de parafina.
   2. Seção dos corações em parafina com um micrótomo a 5 mM e mancha com hematoxilina e eosina para análise morfológica.
   3. Visualize tecido conjuntivo usando tricrômico de Masson.
   4. Analisar as imagens em um microscópio scanner de slides (Figuras 1A, 2A, 3A, 3B e 3C) e visualizar todo o coração em eixo curto usando um microscópio scanner de slides digitais (FiguRes. 1B e 1C).
2. Após as análises acima, Retire a parafina os tecidos do coração em xileno, re-hidratados, submergindo as amostras em percentagens decrescentes de etanol (a partir de 100% de água) e um processo para a Microscopia Electrónica de Varrimento (SEM), da seguinte forma:
   1. Incubar blocos desparafinadas com 1% de ácido tânico, em tampão fosfato 0,1 M durante 1 hora.
   2. Desidratar espécimes em percentagens crescentes de etanol (25-100%).
   3. As amostras secas com HMDS (hexametildisilazano).
   4. Monte os espécimes em Stubbs com Acheson Prata Dag e revesti-los com ouro-paládio.
   5. Veja amostras em um microscópio eletrônico de varredura analítica (Figura 2B).

Resultados

Nós injectadas células HEK293, que são distinguíveis das células do coração pela sua morfologia diferente (Figura 1), com uma forma de paralelepípedos em comparação com os cardiomiócitos alongadas (Figura 1A). Células HEK293 foram mais reativas para corante hematoxilina (cor azul) em comparação com os cardiomiócitos (cor-de-rosa), provavelmente por causa de seu aumento do conteúdo nuclear (Figura 1A). Para além disso, distinguir as células injectadas a partir do tecido ...

Discussão

Neste manuscrito, nós mostramos como realizar injeção intramiocárdica de células nos corações murinos. Como prova dessa metodologia, temos usado células HEK293. É importante ressaltar que as células HEK293 não são usados ​​em qualquer estudo de terapia celular e, portanto, as conclusões deste manuscrito não são apropriados para tradução direta para uma abordagem terapêutica. No entanto, o facto de as células HEK293 não são células contrácteis e não transdiferenciar em outros tipos de células chama a atenção para os aspe...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Isolador	Pfi Systems		Cotação necessária
Almofada de aquecimento	Vet Tech Solutions	HE006	Para pequenos animais
Medetomidina	Serviço		Prescrição veterinária é necessária
Cloridrato de cetamina	Serviço		Prescrição veterinária é necessária
Atipamezol	Serviço Veterinário Nacional	A prescrição veterinária é necessária
Microscópio Eletrônico de Varredura	Jeol	JSM-6610
Tesoura romba	FST	14084-09
Minivent	Harvard Apparatus	73-0043	Incluindo adaptador Y pequeno (73-0027) e cânula de intubação (73-2844)
Fórceps	FST	11052-10
Sistema de retração	FST	18200-20	Kit para animais de até 200 g
30 G 12 mm; ½ polegadas	BBraun	A210	Seringa de
microlitro	ESSLAB	81201	Também inclui um dispensador de repetição Hamilton PB 600-1 Número de catálogo 83700
6-0 Sutura de seda	Ethicon	W1614T

Veterinário Nacional Veterinário Nacional Creme de depilação lojas comerciais Buprenorfina NVS Prescrição veterinária é necessária Microscópio Leica MZFLIII Leica Modelo S6E Com suporte de braço oscilante TS0 Hamamatsu Nanozoomer scanner de slides digital Série Hamamatsu RS amarela fina