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Artigo de método

Cecal ligadura e punção induzida Sepsis como um modelo para estudar a autofagia em Ratos

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DOI:

10.3791/51066

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9 de fevereiro de 2014

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1Department of Medicine, Division of Pulmonary and Critical Care Medicine, Brigham and Women's Hospital, 2Department of Medicine, Renal Division, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School, 3First Department of Critical Care Medicine and Pulmonary Services, University of Athens Medical School, Evangelismos Hospital, Athens, Greece

Neste artigo

Resumo

Sepse experimental pode ser induzida em camundongos usando a ligadura e punção do ceco método (CLP). Protocolos correntes para avaliar a autofagia in vivo no contexto de sepsia induzida por CLP são aqui apresentados: Um protocolo para medir autofagia utilizando ratinhos (GFP)-LC3, e um protocolo para medir a formação de autophagosome por microscopia electrónica.

Resumo

Sepse experimental pode ser induzida em camundongos usando a ligadura e punção do ceco método (CLP), que causa a sepse polimicrobiana. Aqui, um protocolo é fornecido para induzir sepsia de gravidade variável em ratinhos utilizando a técnica de CLP. A autofagia é uma resposta do tecido fundamental para o estresse ea invasão do patógeno. Dois protocolos correntes para avaliar a autofagia in vivo no contexto de sepsia experimental também são aqui apresentados. (I) camundongos transgênicos expressando a proteína fluorescente verde proteína de fusão (GFP)-LC3 são submetidos a CLP. Realce localizada do sinal GFP (puncta), tal como ensaiado ou com imuno-histoquímica ou confocal, pode ser utilizado para detectar a formação de autophagosome aumentado e, assim, a activação da via alterada autofagia. (II) aprimorado vacúolo autofágico (autophagosome) formação por área de tecido da unidade (como um marcador de estimulação autofagia) pode ser quantificado usando microscopia eletrônica. O estudo das respostas autofágicos a sepse é uma amostra críticaonent de compreensão dos mecanismos pelos quais os tecidos respondem à infecção. Os resultados da pesquisa nesta área pode vir a contribuir para a compreensão da patogênese da sepse, o que representa um grande problema em medicina intensiva.

Introdução

Sepse, uma resposta inflamatória sistêmica à infecção, representa uma das principais causas de morte em pacientes criticamente doentes 1. Infecções intra-abdominais, muitas vezes levando à sepse polimicrobiana, são responsáveis ​​por 20% dos casos de sepse, que têm uma mortalidade significativa de até 60% 2. Mortalidade associada à sepse resulta principalmente de disfunção de múltiplos órgãos com falência de órgãos posterior 3,4. Investigações adicionais sobre o mecanismo patogênico da doença é urgentemente necessária para promover o desenvolvimento de novas terapias e mais eficazes.

O método de ligadura e perfuração cecal (CLP) é um procedimento comumente utilizado para sepse modelagem in vivo. Como o ceco é cheia de bactérias, os seus resultados de punção em peritonite polimicrobianas, a translocação de bactérias no sangue (bacteremia), choque séptico, disfunção de múltiplos órgãos e, em última análise, a morte 5. É geralmente aceite que a CLP reflete clínicarealidade com mais precisão do que as técnicas anteriores, como a injeção de endotoxina ou bactérias ainda purificadas em roedores, Assim, CLP é considerada o padrão-ouro (embora não sem limitações) 6 para a indução experimental e, portanto, a investigação da patogênese da sepse. Nesta monografia, descrevemos os protocolos destinados a avaliar se os mecanismos patogênicos de sepse incluem autofagia.

A autofagia, um processo celular evolutivamente conservada, facilita o volume de negócios de proteínas e organelas como as mitocôndrias danificadas e desempenha um papel importante na depuração de patógenos intracelulares incluindo bactérias 7,8. Durante a autofagia, proteínas ou organelas citosólicas são seqüestrados em vesículas ligadas à membrana dupla chamadas autofagossomas, que são posteriormente entregues aos lisossomos para degradação 9. Um número de proteínas foram identificadas como os seus homólogos de mamíferos de genes relacionados com a autofagia (ATG),originalmente identificado em leveduras, que regulam o processo de autofagia. A conversão de microtúbulos associados protein-1 cadeia leve 3B (LC3B) (homólogo de Atg8) a partir de-I LC3B (forma livre) para LC3B-II (forma fosfatidiletanolamina conjugado) representa um grande passo na formação autophagosome 9. Disfunção autofágica é associado com o envelhecimento e doenças humanas, incluindo câncer e doenças neurodegenerativas 10. Além disso, a autofagia afecta a imunidade inata e adaptativa, tais como apresentação de antigénio, o desenvolvimento de linfócitos e a secreção de citoquinas pelas células imunes 8. Assim, parece razoável que a autofagia pode também desempenhar um papel na resposta inflamatória sistémica à infecção (isto é, em sépsis).

Até à data, vários métodos têm sido descritos para avaliar o papel da autofagia em lesão de tecidos in vivo. Estes incluem o uso de proteína de fluorescência verde (GFP)-LC3 expressando camundongos ea quantificação de autophagosomes em tecidos por microscopia electrónica (estes dois métodos são descritos na presente monografia). Métodos adicionais incluem a quantificação da expressão da proteína autophagic em homogenatos de tecidos, e a análise de fluxo autophagic (como descrito noutro local) 11-13. O objetivo desta revisão é fornecer protocolos atuais para avaliar a autofagia in vivo, no contexto da sepse experimental.

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Protocolo

Nota: A Comissão Institucional Animal Care e Use a Brigham and Area Hospital / Harvard Medical School da Mulher aprovou os seguintes procedimentos.

1. Cecal ligadura e punção

Use os ratos do mesmo fundo (C57Bl / 6), do sexo masculino, 8-10 semanas de idade. Camundongos fêmeas são mais resistentes do que os homens contra a letalidade induzida por sepse. Ratos com idade superior a 8 semanas produzir resultados menos variáveis ​​do que os ratos mais jovens, em termos de sobrevivência após CLP. Aproximadamente N = 10 ratos por grupo de comparação deve ser utilizado para a análise de sobrevivência. N = 3-5 ratinhos é adequado para ensaios autofagia.

  1. Use pequenos instrumentos cirúrgicos estéreis (ou seja, bisturi, tesouras e pinças anatômicas sem corte), que deve ser apropriado para a cirurgia de roedores.
  2. Prepare a mistura de anestesia: A 7,95 ml de PBS, adicionar 150 mL de xilazina (AnaSed injecção de 100 mg / mL) e 700 mL de cetamina (Ketaset   CIII, 100 mg / mL).
  3. Para garantir condições de assepsia durante o procedimento, use luvas, máscara e bata cirúrgica.
  4. Pesar animais. Anestesiar los através da injecção intraperitoneal (ip), a mistura mencionada no passo 3, em uma dosagem de ul (10x o peso corporal em g). Por exemplo, para um rato pesando 22 g, administrar 10x22 = 220 ul da mistura de anestésico. Assim, as doses finais de xilazina e cetamina são 17 e 80 mg / kg de peso corporal, respectivamente. Certifique-se de que a anestesia é adequada, sem flexão da extremidade deve ser produzido após toe pitada Nota:. Use pomada oftálmica nos olhos para evitar a secura sob anestesia.
  5. Coloque os animais em uma superfície de trabalho limpa em suas costas. Tails e patas traseiras são orientadas para o investigador. Desinfetar a pele abdominal com álcool (solução de EtOH 70%) Nota:. Área cirúrgica deve ser completamente raspada, para evitar a contaminação da ferida através do contato compele. Além disso, de forma ideal, uma almofada de água quente circulante devem ser utilizados para manutenção da temperatura dos ratos anestesiados durante a cirurgia.
  6. Usando um bisturi, fazer uma pequena incisão na pele longitudinal paralelo e aproximadamente 1 cm para a esquerda para a linha média. Não penetram ainda para dentro da cavidade peritoneal. Use pequenas tesouras para alargar a incisão inicial.
  7. Identificar os músculos abdominais e dissecá-los para ganhar acesso para a cavidade peritoneal.
  8. Usando uma pinça anatômica sem corte, identifique o ceco e movê-lo para fora da cavidade peritoneal. Tenha cuidado para não danificar os vasos sanguíneos mesentéricos (isso pode levar a hemorragia letal).
  9. Ligadura de 60% do ceco para atingir um grau médio sépsis. Ligando igual ou superior a 75% do ceco geralmente resulta em septicemia alto grau, enquanto que ligando igual ou inferior a 25% dos resultados do ceco em sépsis de baixo grau. Tenha cuidado para não ligadura a válvula ileocecal (o que poderia bloquear a continuidade intestinal).
  10. Ao utilizar um21 G agulha, perfurar o ceco por um através-e-através de punção (dois furos) perto da ligadura. A direcção da perfuração deve ser da mesentérica para o lado anti-mesentérica do ceco. Tenha cuidado para não furar os vasos sanguíneos mesentéricos.
  11. Retirar a agulha. Suavemente espremer o ceco ligado para confirmar a permeabilidade através dos dois orifícios, apenas uma pequena quantidade de fezes devem ser extrudido através deles.
  12. Mover o ceco ligado e perfurado no interior da cavidade peritoneal.
    Nota: Para os ratos sham, pule as etapas de 1,10-1,12.
  13. Use seda suturas cirúrgicas 6-0 com agulha cortante para fechar musculatura abdominal. Use seda suturas cirúrgicas 6-0 com agulha cortante para fechar a pele abdominal.
  14. Injectar 1 mL de pré-aquecido (37 ° C) ip soro fisiológico normal para substituir o calor e hidratação perdida durante o processo. Coloque os ratos sob uma lâmpada de calor até a sua reanimação Nota:. Idealmente, um dispositivo de aquecimento mais seguro (such como uma rampa de água quente circulando) pode ser usado em vez de uma lâmpada de calor.
  15. No pós-operatório injetar buprenorfina (0,05 mg / kg de peso corporal sc.) Para alcançar analgesia Nota:. Um animal não deve ser deixado sozinho até que ele recuperou a consciência suficiente para manter decúbito esternal. Um animal que tenha sido submetido a tratamento cirúrgico não deve ser devolvido para a companhia de outros animais até que esteja totalmente recuperado.
  16. Coloque os animais de volta em suas gaiolas com acesso ilimitado a comida e água. Ratos serão sacrificados quando se tornam moribundo (indicado por sinais clínicos como a incapacidade de se mover quando tocado ou cianose). Verifique camundongos cada 4 horas para evitar que eles morram antes da eutanásia.

2. Tissue Colheita e Fixação

  1. Prepara-se uma solução de 4% de paraformaldeído (PFA): Para 889 ml de PBS, adicionar 111 ml de 37% de PFA.
  2. Sacrifício camundongos usando CO narcose induzida de 2 ou cetamina / xilazina slução numa dosagem elevada.
  3. Imobilizar os ratos sobre uma superfície de trabalho limpa. Pulverizar a pele abdominal e torácica com solução EtOH 70% desinfectá-lo.
  4. Usar um bisturi e pequenas tesouras para remover a pele abdominal e torácica, bem como a pele que cobre a área da traqueia.
  5. Revelar traquéia, removendo seus tecidos circundantes (músculos e tecido conjuntivo).
  6. Coloque uma sutura (sem agulha cortante) em torno da traquéia. Não aperte ainda.
  7. Use um cateter venoso periférico pequeno (20 g) a traquéia 'entubar'. Tenha cuidado durante a inserção do cateter para evitar desgaste traqueal. Note-se que o maior diâmetro da traquéia está logo abaixo da cartilagem cricóide.
  8. Apertar a sutura em torno da traqueia / cateter. Remover a agulha, deixando apenas a cânula de plástico do cateter na traqueia. Agulha serviu apenas como um guia-fios para a inserção da cânula de plástico.
  9. Depois de ter assegurado a cânula de plástico na traquéia, corte ºe musculatura abdominal, abrir o abdômen e revelar o diafragma.
  10. Usando uma agulha, perfure o diafragma para a produção de pneumotórax (isto é, inserção de ar na cavidade pleural). Pulmões deve então ser recolhido.
  11. Com uma tesoura pequena, retire o diafragma, corte ao longo do esterno (esternotomia), remova a caixa torácica e revelar o coração e os pulmões.
  12. Através da cânula de plástico inserido na traqueia, corrigir os pulmões com uma solução de formaldeído a menos de 30 cm de H 2 O de pressão.
  13. Retirar os pulmões e colocá-los no PFA a 4% durante 24 horas e subsequentemente em 70% de solução de EtOH até à transformação.
  14. Identificar e remover coração, fígado e rins. Da mesma maneira, a colocá-los em PFA a 4% durante 24 horas e subsequentemente em 70% de solução de EtOH até à transformação.

3. Ratos GFP e visualização de GFP Slides

  1. Realize CLP e cirurgia fictícia em camundongos GFP-LC3 como descrito no passo 1, e procedimento pós-operatórios como descrito no passo 2 do protocolo.
  2. Incorporar os tecidos (nomeadamente os pulmões, coração, fígado e rins) em parafina e corte-os em série 5 mm de.
  3. Quando pronta para a coloração de GFP, incuba-se a 60 ° C durante 30-60 minutos até se derrete parafina e tecido parece translúcida.
  4. Retire a parafina com série graduada padrão de xileno ou xileno substitutos, 5 min xileno 1, 2, xileno e xileno 3 então 3 min incubações em série graduada de EtOH: 100%, 95%, 75%, e depois enxaguar em água destilada.
    Nota: Após desparafinização evitar a dessecação do tecido, o que aumenta o fundo da amostra.
  5. Executar a recuperação de antigénio utilizando um tampão de ácido cítrico (ácido 10 mM de citrato de sódio, 0,05% de Tween 20, pH 6,0), por microondas durante 10-20 min. Tenha cuidado para substituir tampão periodicamente para evitar a dessecação dos tecidos.
  6. Deixa-se arrefecer por 20 min no banco para completar recuperação antigênica.
  7. Lavar 2-3x com PBS. Retire o excesso de tampão e transfer desliza da cremalheira para a posição horizontal em uma caixa de slide ou outra câmara úmida para evitar a dessecação.
  8. Bloquear 45-60 min à temperatura ambiente com 10% de soro de burro normal (também 5% de albumina de soro bovino, ou de preferência a partir de soro animal, em que o anticorpo secundário foi gerado) em PBS.
  9. Incubar as amostras de anticorpo GFP primário em uma diluição de 1:100 em PBS durante a noite a 4 ° C em câmara húmida. Gentilmente aplicar pequenos pedaços de Parafilm sobre o tecido com o anticorpo para promover o contato homogêneo com o tecido e evitar a evaporação.
    Nota: Os restantes passos são realizados à temperatura ambiente.
  10. Lavar 5x com PBS para remover excesso de anticorpo primário. Incubar com anticorpo secundário 1:500-1:1,000 em PBS durante 1-2 horas à temperatura ambiente.
  11. Lavar 5x com PBS para remover excesso de anticorpo secundário. Se desejado, as lâminas contracoloração neste passo.
  12. Se estiver usando anticorpo secundário fluorescente, incubar 0,1% Sudan Black em 70% EtOH fou 15-20 minutos para reduzir autofluorescência. Limpe o excesso de Sudan Black de todo o tecido e lave 5x com PBS mais de 20 min.
  13. Monte amostra com lamela e armazenar na horizontal, até solução de montagem definiu.

4. Protocolo Alternativa: Detecção direta de GFP-LC3

  1. Canular e inflar os pulmões com um ~ 500 ml de 50/50 v / v outubro PBS.
  2. Encaixe em OCT, colocando uma pequena quantidade de OCT na parte inferior de um cryomold.
  3. Com cuidado, coloque o complexo pulmonar dissecado no molde.
  4. Lentamente congelar methylbutane refrigerados, utilizando gelo seco.
  5. Adicionar mais outubro até que o tecido está completamente coberto e sólido congelado. Manter em gelo seco e armazenar a -80 ° C.
  6. Usando um cryomicrotome, corte de 5-10 mm de espessura protegendo as seções da luz. Seções da loja e tecido remanescente a -80 ° C.
  7. Para preparar os slides para imagens, remova a seção do freezer e aplique imediatamente uma gota de PBS para evitar a dessecação.
  8. Correção para 30 min com PFA 4%. Lavar com PBS.
  9. Aplicar DAPI / Hoescht para 10 min. Lavar 3x com PBS.
  10. Monte amostra com lamela e armazenar na horizontal, até solução de montagem definiu.
  11. Imagem utilizando epifluorescência ou microscópio confocal. Armazenar as amostras a 4 ° C durante até um mês.

5. Preparação de Tecidos para Microscopia Eletrônica

  1. Cortar tecidos em aproximadamente 1 mm cubos para a fixação.
  2. Fixar o tecido em formaldeído a 2%, glutaraldeído a 2,5% em tampão de cacodilato de sódio 0,1 M, pH 7,4.
  3. Lave com tampão cacodilato de sódio 0,1 M, durante 1-2 horas.
    Nota: o tecido fixa pode ser armazenado em 0,1 M de cacodilato de sódio a 4 ° C.
  4. Publique correcção em 1% de tetróxido de ósmio em tampão de cacodilato de sódio 0,2 M durante 1 hora.
  5. Enxaguar em tampão de cacodilato de sódio 0,2 M durante 10 min 3x.
  6. Desidratar em etanol 70%, 20 min 2x. Desidratar em EtOH a 90%, 2x 10 minutos. Desidratar em EtOH a 100%,20 min 2x.
  7. Incubar com óxido de propileno (propano epóxi) durante 10 minutos em 2x.
  8. Incubar com a mistura de resina de óxido de propileno / epóxi (50:50), durante 1 hora. A mistura de resina epoxi é: 24 g de Agar de resina de 100, 13 g de anidrido dodecenilsuccínico, 13 g de anidrido methylnadic e 1 ml de N-benzildimetilamina. Misture bem em uma taça descartável com uma espátula de madeira.
  9. Incube com Epoxy overnight resina vials estreantes (deste permite algum óxido propileno restante evaporar).
  10. Incorporar em cápsulas marcados com resina preparada na hora. Polimerizar a 60 ° C durante 48 hr.
  11. Cortes de tecido fotografia usando um microscópio eletrônico de transmissão em 80 kV ou 60 no filme microscópio eletrônico. Imprimir as imagens em papel fotográfico ou armazenar mídia como digitais.
  12. Analisar a formação autophagosome em células intactas contendo núcleo. Campos de baixa potência (e. G. 2,000-4,000 X) pode ser usada para identificar células nucleadas. Normalmente 6,800-10,000 imagens X são usados ​​para poé a quantificação autophagosome. Contagem autofagossomas por unidade de área 15-30 campos de representação estatística adequada. Autofagossomas tem estrutura de membrana dupla, onde autophogosomes fase tardia assemelhava vacúolos preenchidos.

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Resultados

Bacteremia está presente em camundongos, já em 6 horas após a sepse induzida por CLP 14. Os sinais clínicos de sepse (incluindo calafrios, taquipnéia e atividade motora) aparecem cerca de 12 horas após o procedimento. Ratos submetidos a CLP começam a morrer em cerca de 18 horas após a indução da peritonite. O mais grave é a sepse é o mais aumentou a letalidade 15. Em detalhe, sepse alto grau provoca uma mortalidade de 100% dentro de 2-3 dias, enquanto que os resultados de sépsis, de granulometria m...

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Discussão

A principal vantagem do CLP é que ele permite que os pesquisadores para investigar sepse de diferentes gravidades (ou seja, de baixo para médio e alto grau). A gravidade da sepsia induzida é afectada pelo comprimento do ceco ligado (que o determinante mais importante), o tamanho da agulha utilizado para punção e o número de orifícios 15 realizados. Além disso, a tensão do mouse e sexo podem ter impacto sobre a gravidade da sepse; várias cepas são mais suscetíveis do que outras e os homens são geralme...

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Divulgações

Os autores não têm concorrentes interesses financeiros para declarar

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado pelo NIH HL108801 subsídios P01, R01-HL60234, R01-HL55330, R01-HL079904, a AMK Choi. S. Ryter recebeu apoio salário do Instituto de Pesquisa Respiratória Lovelace.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Camundongos transgênicos GFP-LC3Riken (Japão)RBRC00806GFP-LC3 # 53
XilazinaHenry-Schein568-0606Injeção de xilazina HCl Vet
CetaminaHenry-Schein995-2949Ketaset Inj 100 mg / ml
EtOHFisherA405-20Grau de histologia
EtOHFisherA407-1para esterilização
suturas cirúrgicas de seda 6-0Owens & Menor2300-0078OG, 017624
buprenorfina-HClHenry-Schein614-5157Buprenex Ampolas
paraformaldeído (37%) soluçãoJT BakerS898-09
xilenosFisherX3P-1GAL
anticorpo monoclonal anti-GFPLife TechnologiesG10362
HoeschtSigma944403
DAPIInvitrogenD1306
OCTVWR científico25608-930
Sudão PretoSanta Cruzsc-203760
EM grau Glutaraldeído 2,5% em cacodilato de sódioMicroscopia eletrônica Ciências15960
óxido de propilenoSigma240397
Agar 100 resinaAgar científico R1045
Sigma46346
anidrido metilnádicoSigma45359
N-benzildimetilaminaSigma185582
Anidrido dodecenilsuccínico

Referências

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Reimpressões e permissões

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