Os aneurismas microcirúrgicos da parede lateral em ratos são criados pela anastomose término-lateral de um enxerto aórtico na aorta abdominal. Apresentamos instruções passo a passo e discutimos detalhes anatômicos e cirúrgicos para a criação bem-sucedida de aneurisma sacular experimental.
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Artigo de método
O Helsinki Rat microcirúrgica Sidewall Aneurysm Modelo
Neste artigo
Resumo
Resumo
Modelos de aneurisma sacular experimentais são necessários para testar novas opções e dispositivos de tratamento cirúrgico e endovascular, antes de serem introduzidos na prática clínica. Além disso, os modelos experimentais são necessários para elucidar a biologia aneurisma complexo levando à ruptura de aneurismas saculares.
Vários tipos diferentes de modelos experimentais para os saculares foram estabelecidas em diferentes espécies. Muitos deles, no entanto, exigem habilidades especiais, equipamentos caros, ou ambientes especiais, o que limita a sua utilização generalizada. Um modelo experimental simples, robusto e de baixo custo é necessário, como uma ferramenta normalizada que pode ser usada de uma maneira normalizada em diversas instituições.
O modelo de aneurisma da aorta abdominal lateral rato microcirúrgica combina a possibilidade de estudar duas novas estratégias de tratamento endovascular ea base molecular da biologia aneurisma em um padronizado e baratomaneira. Enxertos normalizado por meio de forma, tamanho e geometria são colhidos a partir da aorta torácica descendente de um rato doador e depois transplantadas para um rato destinatário singénico. Os aneurismas são suturados de ponta a lado com contínuo ou interrompido 9-0 suturas de nylon para a aorta abdominal infra-renal.
Apresentamos instruções processuais passo-a-passo, informações sobre o equipamento necessário, e discutir detalhes anatômicos e cirúrgicos importantes para a criação de microcirurgia sucedido de um aneurisma da aorta abdominal lateral no rato.
Introdução
A ruptura de um aneurisma da artéria cerebral sacular provoca hemorragia ameaçadora da vida levando a acidente vascular cerebral, danos neurológicos permanentes ou morte. A rotura pode ser evitada por qualquer recorte microcirúrgico ou oclusão endovascular de aneurisma. Um tratamento médico para evitar o crescimento de aneurisma e ruptura não foi ainda estabelecida.
Modelos experimentais para os saculares são necessários para estudar a biologia de aneurismas arteriais e para o teste de equipamentos terapêuticos e estratégias. Para estes fins, de vários modelos diferentes em espécies diferentes foram desenvolvidos e publicado em 1. Os modelos de aneurisma maiores em suínos, cães e coelhos são preferencialmente utilizadas para testar inovações endovasculares em arquitetura aneurisma complexo 1,2. Modelos murinos aneurisma, por outro lado, permite testar questões de pesquisa de espécies geneticamente modificadas 3,4 e facilitar a clarificação de aneurisma biologia celular e molecular nonível muito melhor do que as espécies maiores 1. Embora endovascular trans-carótida e a implantação do dispositivo de trans-ilíaca é limitado a ratos maiores (> 400-500 g) e stents menor do que 2,0 mm e 1,5 mm de diâmetro de 5,6, os stents podem ser colocados através de inserção directa para a aorta abdominal segmento abrigar os aneurismas experimentais. Trabalhos anteriores, utilizando o modelo abdominal microcirúrgica aneurisma da aorta de ratos lateral demonstrou sua viabilidade em dispositivos embólicos testes novela e seu uso no estudo da base molecular de aneurisma biologia 3,7.
Muitos dos modelos aneurisma sacular experimentais publicados atualmente exigem equipamentos caros, ambientes especiais (por exemplo, salas de operação estéreis com capacidade de fluoroscopia), a competência radiologia intervencionista, ou o uso de espécies caros. Essas exigências limitam o uso em larga escala desses modelos, e levar ao uso de diferentes modelos, em laboratórios diferentes, que makes comparação de dados e meta-análise difícil, se não impossível. Um modelo experimental simples, robusto e de baixo custo é necessário, como uma ferramenta normalizada que pode ser usada de uma maneira normalizada em vários laboratórios de forma a obter resultados comparáveis de diferentes instituições. Para isso, criamos a aorta parede lateral modelo aneurisma arterial saccular rato.
O objetivo deste relatório é apresentar instruções de procedimento passo a passo, informações sobre equipamentos necessários, além de discutir as características anatômicas e cirúrgicos importantes para a criação de microcirurgia sucesso de aneurisma da parede lateral da aorta abdominal em ratos.
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Protocolo
NOTA: Masculino ratos Wistar (peso médio: 356 ± 44 g; 10-14 semanas de idade) foram alojados em sala de animal a 22-24 ° C e 12 horas ciclo claro / escuro com livre acesso a pellet dieta, a água da torneira normal e também recebeu atendimento humanizado, em conformidade com as diretrizes institucionais. Os experimentos foram analisados e aprovados pelo Comitê de Bem-Estar Animal da Universidade de Helsinki, na Finlândia.
NOTA: Para o seguinte demonstração nosso método cirúrgico é como se segue: Anestesiar ratos, por injecção subcutânea de adaptação ao peso de cloridrato de medetomidina (0,5 mg / kg) e a injecção intraperitoneal de cloridrato de cetamina (50 mg / kg). Teste para a falta de um reflexo de igual pitada de confirmar que o rato é completamente anestesiados. Aplicar pomada, prender o local cirúrgico, e limpar a pele com um desinfectante apropriado, por exemplo clorexidina, ou em álcool ou água. Lavar as mãos, vestir roupas de proteção, uma tampa da cabeça e da facemáscara e luvas cirúrgicas estéreis. Tenha uma ajuda de um auxiliar cirúrgico para manter condições de cirurgias assépticas e documentar as características cirúrgicas (conforme listado na Tabela 1). Monitore a profundidade da anestesia a cada 15 minutos durante a cirurgia, seguindo a freqüência respiratória, freqüência cardíaca, ea reação à estimulação nociceptiva (teste pitada tep). A injecção subcutânea de buprenorfina (0,03 mg / kg) foi dada para analgesia pós-operatória e repetidos, se necessário, a cada 12 h.
1. Hardware, Consumíveis e Posicionamento
- Mantenha o animal pequeno da sala de cirurgia tranquila, asséptica, e manter a temperatura ambiente em 23 +/- 3 ° C. Para realizar a cirurgia de aneurisma experimental o seguinte equipamento mínimo é necessário:
- Use uma tabela top microscópio cirúrgico idealmente equipado com um escopo assistente e câmera microscópio digital. Use não porosa superfície operacional reutilizável e lavável superfície instrumento para proteger a bancada do laboratório.
- Prepare consumíveis, tais como desinfetantes da pele, soro fisiológico, compressas de gaze menores e maiores e material de sutura, incluindo 9-0 micro-suturas, um 5-0 não absorvível e sutura absorvível 3-0.
- Utilize os seguintes instrumentos cirúrgicos padrão: tesouras cirúrgicas, fórceps tecido, espalhador de tecidos moles ou autoportantes retrator e duas pinças cirúrgicas Mosquito.
- Use um conjunto básico de microcirurgia instrumento que inclui: titular microagulhas Curvo, uma curva e dois micropinças retas, e uma microtesoura reta ou curva.
- Manter os instrumentos de microcirurgia em um prato de rim preenchido com solução salina estéril para manter o instrumento não colante e limpo durante a cirurgia. O prato de rim é preenchido com tapete de borracha ou uma luva cirúrgica para evitar danos nas pontas dos micro-instrumentos. Certifique-se de que todas as fontes são estéreis e o procedimento é realizado com técnica asséptica de acordo com as recomendações atuais para cirurgia de sobrevivência em animais de laboratório 8-10.
- Além disso, utilizar um aplicador de clipe vascular e três grampos vasculares temporárias atraumáticas. É importante que os grampos utilizados têm um poder de fecho baixa para evitar lesão à parede muito fina da aorta de ratos. Também preparar um governante com barras de meio milímetro de escala, uma pequena almofada de borracha colorida, e uma agulha romba curta.
- Coloque os ratos em decúbito dorsal, imobilizar frente e nas patas traseiras com esparadrapo sem aplicar estiramento ou compressão sobre a pele, e dobrar a sua volta com um marcador grosso ou caneta cautério, colocando-o sob a região de madeira serrada das costas. Isso é importante para se obter o máximo de lordose da coluna lombar como possível, a fim de melhorar a exposição retroperitoneal e o acesso à aorta infra-renal o que facilita a anastomose de microcirurgia. Este posicionamento é recomendado para a criação do aneurisma da aorta abdominal, mas não é necessário para a colheita do enxerto torácica.
2. Graft colheita
- Uanestesia geral nder, abrir a cavidade torácica (início enxerto tempo de isquemia). Aplique uma pitada toe nocivo para confirmar que o rato não responde antes de prosseguir com os passos seguintes. Cortar através da parede abdominal médioventral, identificar o diafragma logo acima do fígado, e cortar o tecido conjuntivo na base do diafragma para permitir o acesso à caixa torácica. Com grandes tesouras, lado sem corte para baixo, cortam costelas apenas um centímetro para a esquerda e direita da linha média da caixa torácica e abrir a cavidade torácica. Os pulmões são mobilizados para o lado direito do coração. Sacrificar os ratos por overdose com injeção intracardíaca de cetamina hydrochloride.Pulmonary tronco, veia subclávia esquerda, veia cava cranial esquerda, ea veia ázigos interferem com a colheita da aorta torácica proximal.
- Caudal para as veias proeminentes há um bom ponto de entrada para iniciar a dissecção da aorta torácica descendente usando micro-tesouras e micropinças.
- Trace o torácica aorta back da parede dorsal do tórax, para cima, para o arco aórtico por retracção sem corte suave e dissecção com o grampo cirúrgico do mosquito.
- Grampo e depois cortar as veias com uma tesoura. Manter os grampos nas veias e utilizar como um retractor para expor o arco aórtico subjacente.
- Coloque um não-absorvível 6-0 seda ligadura apenas acima da primeira artéria intercostal deixando a aorta.
- Corte a aorta descendente, imediatamente abaixo da artéria subclávia esquerda e, em seguida, abaixo da ligadura. A compensação pode ser feito de modo a obter uma geometria normalizada aneurisma perpendicular, ou, se necessário, para obter um determinado ângulo entre o eixo do aneurisma da aorta e. Medir o enxerto na sua largura e comprimento.
NOTA: Colhida enxertos podem ser imediatamente transplantadas em ratos receptores ou tratados posteriormente para alcançar descelulação da parede do enxerto. Decelularizados podem ser armazenados a -4 graus Celsius até re-implantação em uma data posterior (Figura 1). The descelularização da parede do aneurisma foi mostrado para predispor o aneurisma para ampliar 11.
3. Graft Descelularização
- Congelar enxertos de dadores em solução salina tamponada com fosfato, a -4 ° C.
- No dia seguinte, descongelar os enxertos, enxaguar com água destilada e desionizada, à temperatura ambiente, e incubar durante 10 horas a 37 ° C em 0,1% de dodecil sulfato de sódio.
- Finalmente, lava as tratadas com enxertos de dodecil sulfato de sódio, três vezes, com agitação suave, recongelar em tampão fosfato salino, e manter a -4 ° C até à sua utilização.
4. Aneurysm Criação
- Dissecção da Aorta Abdominal
- Depois o animal foi anestesiado, o clipe de pele a partir do local da cirurgia e limpar a pele com um desinfectante apropriado. Teste para a falta de uma resposta de igual pitada antes da incisão na pele. Comece a incisão proximal um centímetro para os órgãos genitais in posição médioventral (hora de início de operação). Cuidadosamente separar a pele a partir dos músculos subjacentes. Fim dissecção 1-2 centímetros abaixo do esterno.
- Com cuidado, mas com firmeza puxar para cima os músculos abdominais subjacentes para evitar danos aos órgãos subjacentes. Estender o corte longitudinal ao longo da linha alba para cima, para o processo xifóide e terminar em direção caudal ao nível da bexiga.
- Delicadamente, aplique pressão na bexiga para esvaziá-lo, a fim de facilitar o acesso ao espaço retroperitoneal.
- Mova o intestino delgado e do ceco de destaque para a direita ou a esquerda. Identificar o intestino grosso ou seja, do cólon descendente no canto inferior esquerdo da cavidade abdominal.
- Cortar o ligamento entre o intestino delgado e o cólon descendente em direcção craniana para permitir uma maior exposição da parede do corpo dorsal. Coloque um afastador auto-retenção para segurar os intestinos à parte.
- A localização ideal de end-to-side anastomose aneurisma is encontrados no nível entre o iliolombar renal e veias. A aorta abdominal reside retroperitoneal incorporado no tecido adiposo. Durante uma dissecção de prestar especial atenção aos pares quase transparentes ureteres e vasos testiculares.
- Se for necessária uma retração dos intestinos, use swaps gaze maiores. A lordose da coluna lombar induzida durante o posicionamento colocando uma caneta cautério ou um objecto semelhante sob a parte inferior das costas do rato, reduz significativamente a necessidade de retracção do intestino.
- A superfície ventral da parede dorsal do corpo é coberto com uma fina peritoneu parietal. Uma vez que este é aberto, visualize a aorta logo abaixo. Durante a dissecção romba afiado e cuidado da aorta abdominal de grandes veias adjacentes agarrar apenas a adventícia para evitar danos à parede do vaso.
- Raramente, as pequenas artérias lombares surgem como vaso segmentar a partir da superfície dorsal da aorta abdominal e interferir com a preparação. Ligadura e corte do navio é needed para evitar escorrendo retrógrado durante a sutura aneurisma. O uso de micro-pinças curvas pode facilitar a colocação de ligadura na profundidade.
- End-to-side Anastomose
- Coloque uma almofada de borracha colorida debaixo da aorta abdominal e estofar o com uma pequena compressa de gaze. Remover o tecido conjuntivo frouxo e adventícia, a nível do local da anastomose planeada.
- Prenda a aorta abdominal, a anastomose em primeiro lugar, em seguida, proximal (iniciar tempo de pinçamento aórtico). Isto assegura um enchimento firme do recipiente e facilita arteriotomia subsequente.
- Realize a arteriotomia usando ou micro-tesouras retas ou curvas. Um micro-pinças mantém-se um pequeno pedaço da parede do vaso para cortar uma forma elíptica.
- Lave a artéria completamente com soro fisiológico em ambos os sentidos utilizando uma agulha de ponta romba.
- Colocar os dois primeiros suturas deste anastomose término-lateral na extremidade proximal e distal da arteriotomia (início da anastomose). Evitar agarrar da parede do vaso, com os micro-fórceps sempre que possível. Certifique-se de que cada fio de sutura é colocado através de todas as camadas da parede do vaso.
- Realizar a sutura seja como suturas contínuas ou interrompidas. Se sutura interrompida é escolhido em seguida, coloque a parte de trás do lado de nove o`clock sutura primeiro. Suturas subsequentes podem ser espaçadas de partida adjacente ao primeiro fio de sutura. Segure a adventícia com cuidado. Evite apertar / apreensão da íntima.
- Quando a parede de trás estiver concluída, verifique a parte endoluminal da anastomose para suturas extraviado. Executar os mesmos procedimentos descritos na mesma ordem no lado da frente. Certifique-se que o primeiro de um total de três nós por sutura é firme, mas não muito apertado.
- Hemostasia e fechamento
- Depois do fim-anastomose está completa (o tempo anastomose término), lavar o local com soro fisiológico e remover o grampo distal primeiro a permitir o refluxo (aórtica final de aperto tempo e enxerto final isquemia time).
- Se o sangramento óbvio ocorre por refluxo um ponto adicional pode ser necessária (hora de início da hemostasia). Em caso de menor exsudação, hemostasia, com uma leve pressão no local da hemorragia utilizando um pequeno pedaço de um cotonete gaze.
- Retire o grampo vascular proximal, lavar o local da anastomose, mais uma vez, e cortar as pontas restantes da ligadura na cúpula aneurisma.
- Confirme a permeabilidade do aneurisma pela observação do aumento do volume do aneurisma durante a onda de pulso arterial de pico. Avaliar desobstrução da artéria abdominal distal através do "teste de ordenha" direta.
- Retire a folha de plástico e um pequeno chumaço de gaze por baixo. O turbilhão de sangue pulsando dentro do aneurisma criado é claramente visível.
- Cubra linhas de sutura em torno da anastomose com pequenos pedaços de tecido adiposo ou Spongostan para hemostasia adicional se pequeno escorrendo ainda está presente (tempo final da hemostasia).
- Remover o disseminador e gaze cotonetes de tecidos moles.Coloque o intestino delgado, ceco, ea massa de gordura na sua posição correta.
- Feche os músculos abdominais de linha média, utilizando 5-0, 4-0, 3-0 ou suturas absorvíveis ou não absorvíveis seguidos de pele fechamento da ferida utilizando a técnica de sutura contínua com 3-0 reabsorvível sutura polyfilament (tempo de operação final). Nota: Em nossos ratos experiência tolerado suturas reabsorvíveis melhores do que as suturas monofilamento não absorvível.
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Resultados
Uma série piloto era composto por 14 ratos. Posteriormente, um total de 84 animais foram operados de acordo com o protocolo apresentado em vários projectos de investigação, entre Março e Setembro de 2012. adicionais 29 animais serviram como doadores de enxertos arteriais saculares. Os demais experimentos foram realizados utilizando enxertos pré-tratados colhidas e armazenadas a partir de experiências anteriores com ratos do mesmo sexo, tensão, peso e idade.
O peso corporal, o tempo total de ...
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Discussão
O melhor conhecimento da biologia complexa de aneurisma da artéria cerebral sacular depende da análise de dados epidemiológicos e clínicos, complementado por estudos de laboratório em amostras de pacientes e trabalhos experimentais em modelos animais 3,12,13.
Pequenos animais como o rato está intrinsecamente associado com menores custos de experiências e habitação, e menor necessidade de equipamentos especializados. Um tempo de operação total médio de menos de 60 minutos para a cr...
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Divulgações
Os autores não têm qualquer interesse financeiro ou comercial em qualquer um dos medicamentos, materiais ou equipamentos utilizados.
Agradecimentos
Os autores são os únicos responsáveis pelo desenho e condução do estudo apresentado. O Dr. Marbacher foi apoiado por uma bolsa da Swiss National Science Foundation (PBSKP3-123454). Os autores declaram não haver conflito de interesses.
As contribuições dos autores para o estudo e preparação do manuscrito incluem o seguinte. Concepção e desenho do estudo: SM, JM, JF. Obtenção de dados: SM, EA, JF. Análise e interpretação dos dados: SM, JF, JM. Redação do artigo: SM, JF, JM. Revisão crítica do artigo: JH, MN. Análise estatística: SM, JF. Orientação do estudo: JF, JH, MN.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Medetomidina | Qualquer genérico | ||
| Cetamina | Qualquer genérico | ||
| Buprenorfina | Qualquer genérico | ||
| Solução salina | |||
| Dodecil sulfato de sódio (0,1%) | |||
| 3-0 sutura reabsorvível | Ethicon Inc., USA | a name="RANGE! C7">VCP824G | |
| 5-0 sutura não absorvível | Ethicon Inc., EUA | 8618G | |
| 6-0 sutura de seda não absorvível | B. Braun, Alemanha | C0761060 | |
| microssutura de nylon 9-0 B | . Braun, Alemanha | G1118471 | |
| Spongostan | Ethicon Inc., EUA | MS0002 | |
| Microscópio de operação | Leica, Alemanha | M651 | |
| Câmera de microscópio digital | Sony, Japão | SSC-DC58AP | |
| Instrumentos cirúrgicos padrão | B. Braun, Alemanha | Ver protocolo | 1.4 |
| Instrumentos microcirúrgicos | B. Braun, Alemanha | Ver protocolo | 1.5 |
| Aplicador de clipe vascular | B. Braun, Alemanha | FT495T | |
| Grampos vasculares temporários | B. Braun, Alemanha | FT250T | |
| Graph Pad Prism software estatístico | GraphPad Software, San Diego, Califórnia, EUA | V 6.02 para Windows |
Referências
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Reimpressões e permissões
