Artigo de método

Avaliar as alterações na volátil Geral Anestésica Sensibilidade de Ratos após intervenção farmacológica local ou sistêmica

DOI:

10.3791/51079

⸱

16 de outubro de 2013

 ,  , 
1Department of Anesthesiology and Critical Care, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 2Department of Pharmacology, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 3Department of Neuroscience, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 4Center for Sleep and Circadian Neurobiology, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania

Neste artigo

Resumo

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A perda do reflexo de endireitamento serviu durante muito tempo como um substituto do comportamento padrão para a inconsciência, também chamado de hipnose, em animais de laboratório. As alterações na sensibilidade do anestésico volátil decorrentes de intervenções farmacológicas pode ser detectado com um sistema de avaliação controlada cuidadosamente de alto rendimento, que pode ser adaptado para a entrega de qualquer terapêutico inalado.

Resumo

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Um ponto final desejável de anestesia geral é o estado de inconsciência, também conhecida como hipnose. Definindo o estado hipnótico em animais é menos simples do que em pacientes humanos. Um substituto de comportamento amplamente utilizado para a hipnose em roedores é a perda do reflexo de endireitamento (LORR), ou o ponto em que o animal já não responde ao seu instinto inato para evitar a vulnerabilidade de decúbito dorsal. Nós desenvolvemos um sistema para avaliar LORR em 24 camundongos simultaneamente, controlando cuidadosamente para potenciais fatores de confusão, incluindo flutuações de temperatura e diferentes fluxos de gás. Estas câmaras permitir uma avaliação fiável da sensibilidade anestésico, conforme medido pela latência para retornar do reflexo de endireitamento (RORR) após uma exposição anestésico fixo. Em alternativa, a utilização de incrementos graduais (ou diminui) a concentração de anestésico, as câmaras também permitem a determinação da sensibilidade de uma população de indução (ou emergência) como medido porEC 50 e Hill encosta. Finalmente, as câmaras climatizadas descritos aqui pode ser adaptado para uma variedade de usos alternativos, incluindo a entrega por inalação de outras drogas, os estudos de toxicologia, e simultânea de monitorização em tempo real dos sinais vitais.

Introdução

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Os anestésicos gerais são definidos por sua capacidade de causar um estado reversível da hipnose em uma grande variedade de espécies, mas uma explicação sobre a forma como uma classe tão diversificado de drogas podem provocar uma endpoint singular permanece indefinida. Uma série de teorias têm sido posta ao longo dos anos, a partir da correlação de Meyer-Overton entre potência anestésica e solubilidade lipídica, o que sugere rupturas de membranas gerais como base para a hipnose 1,2. Evidências mais recentes sugerem que os alvos da proteína que afetam a sinalização neuronal contribuir para efeitos anestésicos. Os ratos têm provado ser um modelo indispensável para explorar estas teorias, devido à homologia entre murino e responsividade anestésico humano. Apesar de ser um rato não pode ser questionado sobre sua percepção subjetiva sob anestesia geral, alguns reflexos primitivos servir medidas substitutas como úteis de roedor hipnose. Nos primeiros dias após o nascimento, os ratos desenvolvem uma resp endireitamento reflexivaonse que impede que eles sejam passivamente colocado em decúbito dorsal 3. A dose de anestesia em que um rato perde o seu reflexo de endireitamento correlaciona-se bem com doses hipnóticas humanos 4.

A avaliação da perda do reflexo de endireitamento (LORR) tornou-se um padrão de laboratório amplamente utilizado para testar a sensibilidade da anestesia em ratinhos, bem como uma variedade de outras espécies, incluindo ratos, cobaias, coelhos, furão, ovelhas, cães e 5-8. A dose de um dado anestésico LORR em que vai ocorrer a membros de uma espécie é extremamente consistente, mas pode ser deslocado significativamente por factores ambientais. Por exemplo, ratos privados de sono são mais sensíveis a ambos os agentes anestésicos voláteis e intravenosas e 9 ratos com alta capacidade aeróbia são menos sensíveis ao isoflurano 10. Hipotermia Também foi demonstrado para diminuir a dose de numerosos anestésicos necessários para a hipnose num largo espectro de espécies de 11-14. Em ordempara identificar com fiabilidade a dose do anestésico no qual LORR ocorre num grupo de animais experimentais, é fundamental que o ambiente de avaliação ser cuidadosamente controladas para minimizar a tensão, manter euthermia, e fornecer a mesma quantidade de droga para todos os indivíduos. Não surpreendentemente, os fatores genéticos também são conhecidos por alterar a sensibilidade do anestésico 15-18. Consequentemente, a consideração cuidadosa deve ser dada para o controle de fundo genético 19.

Desenvolvemos um dispositivo que garante a entrega anestésico gasoso idêntico a cada um dos 24 ratinhos, mantendo um ambiente de 37 º C constantes. O design cilíndrico transparente dos nossos câmaras de exposição permite uma avaliação LORR rápido e fácil integração de medidas fisiológicas de telemetria. Este sistema tem sido mostrado para medir com precisão o isoflurano, halotano, e indução sevoflurano CE 50 e hora de aparecimento em ratinhos de tipo selvagem 20. Temos também utilizadoesse sistema para observar as mudanças na sensibilidade anestésico em camundongos com mutações genéticas e lesões hipotálamo-alvo 21-23. Aqui descrevemos duas maneiras em que a sensibilidade do anestésico podem ser avaliados após uma intervenção farmacológica usando nosso aparelho ambiente controlado. Fenotipagem em estado estacionário de indução de anestesia volátil e sensibilidade surgimento requer 8-10 horas e é, consequentemente, melhor adaptado para estudos em que condições experimentais não mudam, como em intervenções farmacológicas crônicas ou de longa duração. No entanto, para tratamentos de curta duração, cujos efeitos se dissipam de forma significativa ao longo do tempo apresentamos também um procedimento simples para avaliar mudanças no reflexo de endireitamento seguintes microinjeções estereotaxicamente-alvo ou tratamentos de drogas intravenosas que impactam significativamente surgimento da anestesia. Esses ensaios representam um pequeno subconjunto das potenciais aplicações para este sistema de ambiente controlado, o que pode ser adaptado para qualquer número de subjjectos de uma variedade de espécies para receber qualquer tipo de terapêutica por inalação.

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Protocolo

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Todos os procedimentos envolvendo animais aqui descritos foram aprovados pela Universidade do Comitê Institucional Animal Care e Use da Pensilvânia.

1. Visão geral do aparelho de teste

  1. O aparelho de teste consiste em 24 câmaras cilíndricas claras acrílico com 10 cm de comprimento e 5 cm de diâmetro (volume total de 200 ml). Este tamanho é adequado para uma típica de 25 g do rato adulto. Chambers tem portas em cada extremidade para entrada e saída de gás. A extremidade de saída é removível, de modo que os animais podem ser facilmente carregados para dentro da câmara. Aberturas de gás são cuidadosamente selados com fita de Teflon, enquanto juntas O-ring de borracha são usados ​​para selar o terminal amovível das câmaras cilíndricas.
  2. Cada câmara é montado sobre um suporte que se situa dentro de um banho de água. A prateleira é montada de modo que apenas a porção inferior das câmaras (abaixo das entradas de gás) é submerso. Para a estabilidade, a extremidade traseira da câmara repousa sobre um suporte, de modo que toda a chamber fica na horizontal. Isso garante até mesmo o contato de toda a câmara com o banho.
  3. Tubos de polietileno conecta um tanque de oxigénio a um vaporizador de anestésico, e, em seguida, passa através de um L / medidor de fluxo de 10 min. A tubagem 25 divide-se em resistências de pequeno diâmetro, de comprimento igual para assegurar a igualdade de fluxo é fornecido a cada uma das câmaras 24 e um analisador de agente.
  4. As linhas de vácuo de cada câmara de sair na extremidade oposta da entrada de gás. Isso promove o fluxo unidirecional que elimina reinalação de dióxido de carbono exalado. As linhas de vácuo combinar em um colector para se conectar a uma linha de sucção em casa. Uma válvula pop-off ao longo da principal linha de vácuo garante condições de pressão atmosférica dentro de cada câmara.
  5. O banho é preenchido com água o suficiente para contactar plenamente a parte inferior de cada câmara. A água é distribuída através do banho e mantida à temperatura constante de 37 ° C por uma bomba.

2. Verifique se os sistemas antes da exposição

  1. Cos pedaços que a temperatura do banho de água é de 37 ° C durante todo o banho.
  2. O fluxo de oxigênio a uma taxa de 5 L / min (200 ml / min por câmara + analisador de agente). Mergulhe cada câmara debaixo de água e procure por bolhas ou entrada de água na câmara, os quais são indicativos de vazamentos. Vede todas as fugas antes de iniciar o experimento.
  3. Para cada câmara, ligue um ml / min metro 500 fluxo na linha após a câmara ter certeza de que os fluxos são equilibrados em cada uma das linhas de gás 25. Isso garante que as entrada de 5 L / min fluxos serão distribuídas uniformemente, para que cada uma das câmaras recebe 200 mL / min de fluxo. Qualquer câmara não receber o fluxo esperado deve ter a sua entrada e saída de tubulação verificado se há obstruções.
  4. Calibrar o analisador agente para assegurar uma leitura de 0,00% isoflurano quando 100% de oxigênio está fluindo.

3. Implant Transponder Temperatura

  1. Uma semana antes da habituação, anestesiar cada rato com 2% de isoflurano.
  2. Esterilizar área do pescoço dorsal com betadine.
  3. Injetar um transponder via subcutânea temperatura entre as omoplatas, usando o estéril, agulha injetora pré-embalados.
  4. Monitorar o local da injeção diária de infecção e migração do transponder.

4. Habituar Animais de Câmaras de testes

  1. Quatro dias antes da primeira avaliação, coloque todos os ratos em câmaras individuais para 2 h com 100% de oxigênio fluindo.
  2. Repita o passo 4,1 diária para os quatro dias antes da avaliação, para evitar os efeitos de confusão de estresse devido a um novo ambiente.

5. Realizar a intervenção farmacológica que você deseja testar para efeitos sobre Anestésica Sensibilidade

  1. Esta intervenção poderá ser uma injecção estereotáxica numa parte específica do cérebro de 24, uma injecção intravenosa ou intraperitoneal 25, ou distribuição de um fármaco a uma área específica do cérebro através de uma cânula 26.
  2. Porque esses mesmos procedimentos podem alterar a sensibilidade anestésico em relação a um animal ingênuo, um grupo controle adequado devem ser submetidos ao mesmo procedimento com injeções de veículos.
  3. Certifique-se de que a intervenção farmacológica tem uma forma adequada longa duração de ação, se você está planejando fazer um gradual aumento e / ou diminuição da determinação da sensibilidade do anestésico, como mostrado na etapa 6 abaixo, caso contrário, pule para o passo 7.

6. Avaliar Anestésica Sensibilidade usando o Stepwise EC 50 Determinação para indução e Emergência

  1. Coloque cada animal em câmaras individuais com 100% de oxigênio fluindo.
  2. Definir a concentração de isoflurano a 0,4% * por 15 min. Durante os últimos 2 minutos deste período, avaliar o reflexo de endireitamento de cada animal por suavemente ondulado a câmara até que o mouse é colocado sobre suas costas. O reflexo de endireitamento é considerada intacta, se e somente se o mouse é capaz de restaurar todosde suas patas para o chão da câmara dentro de 2 min.
    1. * Note-se que 0,4% de isoflurano é uma dose subhypnotic em ratos C57BL/6J. Se quaisquer ratinhos perdem o reflexo de endireitar-se a primeira etapa, a dose inicial era demasiado grande e deve ser reduzida em dias subsequentes.
  3. Grave o estado do reflexo de endireitamento para cada rato e digitalizar cada rato para os dados de temperatura. Um registo do modelo é mostrado na Tabela 1.
  4. Aumentar a concentração de isoflurano por ~ 0,05% por 15 min e repita o passo 7.2. Continue a fazer isso até que todos os animais perderam o reflexo de endireitamento.
  5. Opcional: repita o mesmo procedimento para diminuir doses isoflurano passo a passo até que todos os animais recuperaram a sua reflexo de endireitamento (veja o passo 6.3).
  6. Para finalizar a experiência, desligue o isoflurano e lave todo o sistema com oxigênio a 100% por 15 min. Isso vai ajudar a evitar a hipóxia como os ratos recuperar antes de serem devolvidos aos seus gaiolas e protegerá o experimenter de qualquer exposição do anestésico.
  7. Opcional: se o número de animais ou o número de concentrações anestésicas são limitados devido a limitações de tempo ou de recursos, as estimativas-particularmente dos parâmetros da curva de ajuste da inclinação pode-Hill têm subvalorizado, falsamente baixa estimativa de erro. Em tais casos, pode ser necessário repetir a medição da sensibilidade anestésico descrito nos passos 6,1-6,6 em até dois dias experimentais adicionais para obter totalmente parâmetro do verdadeiro declive Hill e as suas estimativas de erro correspondente.

7. Avaliar as mudanças de curto prazo na Anestésica Sensibilidade com tempo de Emergência

  1. Coloque cada animal em câmaras individuais com 100% de oxigênio fluindo.
  2. Definir a concentração de isoflurano a 1,2%, o que corresponde à indução de ED 99 para ratinhos do tipo selvagem da estirpe C57BL/6J 20. Manter por 30-60 min, dependendo da duração esperada da ação da intervenção aguda.
  3. Confirme LORR emtodos os animais por suavemente ondulado cada câmara até que os ratos são colocados em suas costas.
  4. Desligue o isoflurano eo fluxo de 100% de oxigênio. Medir o tempo até que cada animal recupere a sua reflexo de endireitamento. Isto é definido pela colocação de todas as quatro patas no chão da câmara, e confirmou a presença de três ensaios consecutivos com um reflexo de endireitamento intacta.

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Resultados

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A Figura 1 demonstra a utilidade do ensaio de LORR passo a passo para a determinação de efeitos a longo prazo de uma intervenção farmacológica. Ácido iboténico (IBA) é um agonista do N-metil-D-aspartato (NMDA) do receptor glutamatérgico que é frequentemente utilizado como uma excitotoxina para causar lesões neuronais permanentes. Aqui nós injectados 10 nl de 1% de IBA bilateralmente na área pré-óptica ventrolateral (VLPO) de ratos C57BL/6J uma semana antes do ensaio. A maioria dos neurônios neste núcleo...

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Discussão

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Embora a avaliação de LORR em um único rato é uma tarefa aparentemente simples, é, no entanto, essencial para manter as condições fisiológicas idênticas entre os indivíduos, a fim de coletar dados confiáveis ​​de um grupo de animais. A, aparelho LORR de alta capacidade bem regulamentada aqui apresentado oferece uma maneira de padronizar experiências e maximizar a eficiência. Ao seguir os princípios básicos da termorregulação e distribuição do fluxo igual, este sistema pode ser facilmente recriada e personalizado para at...

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Divulgações

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Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

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Este trabalho foi apoiado por R01 GM088156 e T32 HL007713-18. Gostaríamos de agradecer a Bill Pennie e Michael Carman, da Universidade da Pensilvânia Research Instrumentation Loja de sua ajuda na montagem de nosso aparato reflexo de endireitamento.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Nome do reagente Número decatálogoda empresaComentários
OxigênioAirgasOX300
IsofluranoButler ScheinQualquer anestésico volátil de interesse pode ser substituído
Nome do material Número decatálogoda empresaComentários
Medidor de fluxo de massa - 10 SLPMOmega EngineeringFMA-A2309
Medidor de fluxo de massa - 500 SCCMOmega EngineeringFMA-A2305
Analisador de agente anestésico/indicador de gásAM BickfordFI-21 Riken
Bomba de água de aquecimentoFisher Scientific13-874-175
Transponders de temperaturaBMDSIPTT-300
Leitor de temperatura RFBMDSDAS-6007

Referências

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