Um Método para Sistemática de Eletroquímica e eletrofisiológica Avaliação do Neurais gravação Eletrodos

Resumo

Revestimentos de eletrodos diferentes afetar o desempenho de gravação neural através de alterações nas propriedades eletroquímicas, químicas e mecânicas. Comparação de eléctrodos in vitro é relativamente simples, no entanto Comparação in vivo da resposta é tipicamente complicada pelas variações de distância entre os eléctrodos / neurónio e entre animais. Este artigo fornece um método robusto para comparar eletrodos de registro neurais.

Resumo

Novos materiais e designs para implantes neurais são tipicamente testados separadamente, com uma demonstração de desempenho, mas sem referência a outras características de implantes. Isto impede uma selecção racional de um implante em particular como óptima para uma aplicação particular e ao desenvolvimento de novos materiais com base nos parâmetros mais críticos do desempenho. Este artigo desenvolve um protocolo in vitro e testes in vivo de eléctrodos de registo neural. Parâmetros recomendados para o teste eletroquímico e eletrofisiológica são documentados com os principais passos e possíveis problemas discutidos. Este método elimina ou reduz o impacto de muitos erros sistemáticos presentes nas mais simples in vivo paradigmas de teste, especialmente variações na distância eletrodo / neurônio e entre modelos animais. O resultado é uma forte correlação entre a crítica in vitro e in vivo as respostas, tais como a impedância e siproporção nal-ruído. Este protocolo pode ser facilmente adaptado para testar outros materiais de eléctrodos e desenhos. As técnicas in vitro pode ser expandido para qualquer outro método não destrutivo para determinar os indicadores de desempenho mais importantes. Os princípios utilizados para a abordagem cirúrgica da via auditiva pode também ser modificado para outras regiões neurais ou tecido.

Introdução

Implantes neuronais estão a ser utilizados cada vez mais para a investigação, controlando próteses e tratamento de desordens, tais como doença de Parkinson, epilepsia, e ^1,2 a perda sensorial. Medir e / ou controlar tanto a composição química e eléctrica do cérebro é a base para todos os implantes neurais. No entanto, é importante administrar um tratamento apenas quando o tecido neural é no estado aberrante para reduzir os efeitos secundários ^3. Por exemplo, estimuladores cerebrais profundos para o tratamento de epilepsia só deve aplicar-se um pulso elétrico para o cérebro durante uma convulsão. Alguns efeitos secundários podem ser distonia, perda de memória, desorientação, função cognitiva prejudicada, alucinações induzidas, depressão ou anti-depressão ^3,4. Em muitos dispositivos, um sistema de circuito fechado, por conseguinte, necessário para registar a actividade eléctrica e para provocar estimulação quando um estado anormal é detectada. Eletrodos de gravação também são usados ​​para controlar pródispositivos sthetic. É crítico para registar a actividade neural alvo com a maior relação sinal-para-ruído possível conseguir o desencadeamento mais precisa e controlo do dispositivo. Uma grande proporção de sinal-para-ruído é também altamente desejáveis ​​para aplicações de pesquisa, como dados mais fiáveis ​​podem ser obtidas, o que resulta em menor número de indivíduos de teste necessários. Isso também irá permitir uma maior compreensão dos mecanismos e vias envolvidas na estimulação neural e gravação.

Depois de um implante neural tem sido colocado para o cérebro, uma resposta imunitária desencadeada é ^5,6. O curso dos tempos de resposta está geralmente dividido em fases agudas e crónicas, cada uma consistindo de ⁷ diferentes processos biológicos. A resposta imune pode ter efeitos dramáticos sobre o desempenho do implante, tais como o isolamento dos eléctrodos dos neurónios-alvo por encapsulação em uma cicatriz glial ou degradação química dos materiais de implante ^8.Isto pode reduzir a relação sinal-para-ruído de um eléctrodo de registo e a potência de saída de um eléctrodo estimulante, e para o eléctrodo de chumbo falha ^9. Escolha cuidadosa do desenho do implante e os materiais são necessários para prevenir falhas durante a vida útil do implante.

Muitos diferentes materiais e modelos de implantes têm sido desenvolvidas recentemente para melhorar a relação sinal-ruído e a estabilidade do implante para o registo neural. Materiais de eletrodo incluíram platina, irídio, tungstênio, óxido de irídio, o óxido de tântalo, o grafeno, os nanotubos de carbono, polímeros condutores dopados, e, mais recentemente, os hidrogéis. Os materiais de substrato testados também inclui silício, óxido de silício, nitreto de silício, de seda, Teflon, poliimida, e silicone. Várias modificações dos eléctrodos também foram investigados, utilizando revestimentos, tais como laminina, neurotrofinas, ou monocamadas e tratamentos de auto-montagem utilizando electroquímica, plasma e técnicas ópticas. Projeto Implants poderiam ser 1 -, 2 - ou 3-dimensional com os eléctrodos geralmente na ponta de uma sonda ou de isolamento ao longo do bordo de uma haste para penetrar eléctrodos ou de uma matriz de duas dimensões de implantes de superfície do córtex. Independentemente da concepção ou material de eléctrodo, a literatura anterior tem tipicamente demonstrado o desempenho do novo implante, sem referência a outras construções de implante. Isso evita que uma avaliação sistemática das suas propriedades.

Este protocolo proporciona um método para comparação de diferentes materiais de eléctrodo por meio de uma variedade de técnicas analíticas e electrofisiológicos. Ele baseia-se num artigo recentemente publicado que comparou 4 dopado diferente realização de revestimentos de polímero (de polipirrol (Ppy) e poli-3 ,4-etilenodioxitiofeno (PEDOT) dopado com sulfato _(SO4) ou para-tolueno sulfonato (PTS)) e 4 revestimento de diferentes espessuras de ^10. Este artigo encontrei um material, PEDOT-pTS com um tempo de deposição de 45 segundos,tinha a maior proporção e contagem de pico de sinal-para-ruído com o menor ruído de fundo, e que estes parâmetros eram dependentes da impedância do eléctrodo. PEDOT-pTS também exibido bioestabilidade aguda superior em comparação com os outros polímeros dopados condução e eletrodos de irídio nuas. O protocolo permite que os parâmetros críticos da alteração da razão e estabilidade de sinal-para-ruído de ser determinada e utilizada para melhorar ainda mais o desempenho dos eléctrodos de registo neural.

Protocolo

O protocolo foi aprovado pela La Trobe University (09-28P) e comitês de ética animal RMIT University (1315).

1. Eletrodo Preparação e preliminar in vitro Testing

1. Preparar soluções de revestimento de deposição do eléctrodo, por exemplo, 10 mM de 3,4-etilenodioxitiofeno (EDOT) e 0,1 para-tolueno sulfonato de sódio M (Na ₂ pts), para formar poli-3 ,4-etilenodioxitiofeno-pTS (PEDOT-pTS).
2. Conecte o conjunto de eletrodos de um potenciostato.
3. Com cuidado, coloque o conjunto de eletrodos na solução de deposição e prender no lugar.
4. Coloque um contra-eletrodo de platina malha e eletrodo de referência Ag / AgCl na solução de deposição e se conectar a um potenciostato.
5. Usando os potenciostato, revestimentos de depósito sobre os eléctrodos desejados. Condições de deposição (potencial, corrente e tempo) irão variar dependendo dos revestimentos desejados. Para revestimentos PEDOT-PTS, um pote aplicadantial de 1 V por 15, 30, 45, ou 60 segundos foi usado. Quatro eléctrodos na matriz deve ser revestida com o revestimento com uma configuração escalonada (Figura 1).
6. Remova o conjunto de eletrodos a partir da solução de deposição e lavar cuidadosamente com água deionizada.
7. Repetir o processo de revestimento com outros materiais, como desejado.
8. Preparar solução de teste in vitro (fosfato de di-sódio 0,3 M (Na ₂ HPO ₄₎ em água desionizada).
9. Conecte o conjunto de eletrodos de um potenciostato.
10. Com cuidado, coloque o conjunto de eletrodos na solução de teste e prender no lugar.
11. Coloque um contra-eletrodo de platina malha e eletrodo de referência Ag / AgCl na solução de teste e se conectar a um potenciostato.
12. Usando o potenciostato, realizar espectroscopia de impedância eletroquímica seqüencial (EIS) (potencial compensar 0 V, amplitude 10 mV, faixa de freqüência 10-100,000 Hz) e voltametria cíclica (1 ciclo, faixa de potencial 00,8 para -0,8 V, velocidade de varredura de 100 mV / s) em todos os eletrodos. Eletrodos não testados são mantidos em potencial de circuito aberto e um tempo de silêncio de 1 segundo é usado entre cada teste. Todos os eléctrodos 32 estão em contacto com a solução para a sessão de teste completo de 1 hr.
13. Remova o conjunto de eletrodos da solução teste e lavar cuidadosamente com água deionizada.
14. Executar quaisquer outras análises desejadas, como microscopia óptica.
15. Armazenar as sondas em um recipiente protector seco, para evitar danos e degradação das superfícies dos eléctrodos.

2. Eletrodo Implantação

1. Pesa-se o rato.
2. Injectar uretano (20% w / v em água destilada, 1,3 g / kg ip) para anestesia nonrecovery.
3. Certifique-se de início a anestesia por meio de testes de um reflexo de retirada do dedo do pé pinch. Se a anestesia não é suficiente, doses suplementares de uretano deve ser administrado (0,3 g / kg ip).
4. Aplique lubrificante ocular, e depois raspar a cabeça da umaimal.
5. Colocar o animal em decúbito ventral em uma placa homeotérmicos e inserir uma sonda retal (37,5 ° C).
6. Coloque uma barra de orelha em posição final de aproximadamente esperado dentro do quadro estereotáxico, e depois ajustar o animal para posicionar a barra de orelha no meato acústico externo.
7. Alinhe a segunda barra de orelha em meato acústico externo contralateral. Deslocar o animal nos bares de ouvido para se alinhar com o suporte do dente.
8. Utilizando uma pinça dente de rato, abrir a mandíbula do animal, ligar os incisivos superiores sobre o suporte do dente e apertar o nariz no lugar.
9. Criar uma incisão na pele da cabeça, a cerca de 1 mm para a direita da linha média e de 10 mm de 10 mm rostral caudal do lambda.
10. Retrair a pele e músculo lateralmente a partir da incisão para expor a ossos parietal e interparietais Usando uma solução de peróxido de hidrogénio a 20% e uma almofada de gaze, esfregar a superfície do osso exposto.
11. Faça um furo de aproximadamente3 milímetros ² no osso interparietais tão perto de lambda e a linha média quanto possível e remover o tampão de ossos. Usando salina estéril, lave o buraco para remover qualquer pó de osso ou fragmentos que podem danificar o eletrodo.
12. Com uma tesoura sem corte-contuso, dissecar abaixo da nuca e criar uma cavidade. Enrole um fio de Ag / AgCl em algodão, saturá-lo com soro fisiológico e, em seguida, insira o eletrodo de referência para a cavidade.
13. Fazer uma incisão na dura-máter no plano sagital, utilizando a ponta de uma agulha.
14. Fixe o conjunto de eletrodos para o manipulador de eletrodos e ajustar a sua posição sobre a abertura com um ângulo de rostro-caudal de 19 °. Inserir manualmente o eletrodo de aproximadamente 2 mm no cérebro para o colículo inferior.
15. Conecte o alto-falante para a barra de ouvido oco esquerda.
16. Verifique se o amplificador está ligado. Em seguida, verificar a anestesia animal antes de selar a câmara de gravação.

3.Ensaios in vivo

1. Entregar rajadas de ruído branco, (ruído Gaussian distribuído, 1-44 kHz; tempo de subida-queda de 10 ms) e monitorar a atividade em cada eletrodo. A taxa máxima em que explode deverá ser entregue é uma explosão a cada 200 ms.
2. Usando o microdrive motorizado, insira lentamente o conjunto de eletrodos até que a atividade acústica impulsionado é registrado nos três eletrodos mais distais em cada haste (o número ea posição dos eletrodos actividade de gravação pode variar com a colocação do eletrodo ou projeto eletrodo).
3. Realizar o protocolo de estimulação acústica usando 300 repetições de 50 ms rajadas de ruído branco (ruído Gaussian distribuído, 1-44 kHz, 10 tempo de subida de queda ms) com uma taxa de repetição de 1 seg a 70 dB, e registrar a atividade de várias unidades em cada eletrodo ( taxa de amostragem de 24,4 kHz).
4. Insira lentamente o conjunto de eletrodos mais 200 μ m para o IC para posicionar cada eletrodo aproximadamente na mesma posição que o eletrodo mais distal a partir de diae posição de gravação inicial.
5. Repita a estimulação acústica e protocolo de gravação neural.
6. Continue inserindo o conjunto de eletrodos em 200 μ m passos e realizar a estimulação acústica e protocolo de gravação neural até que todos os eletrodos registraram atividade acusticamente expulsos de pelo menos 3 posições (normalmente 8-12 posições dos eletrodos em geral).
7. Recolha o conjunto de eletrodos em 200 μ m passos e continuar a realizar a estimulação acústica e protocolo de gravação neural até a posição inicial dos eletrodos seja alcançado.
8. Retrair com cuidado o conjunto de eletrodos manualmente.
9. Injectar uma dose excessiva de pentobarbitona de sódio (Lethobarb, 200 mg / kg ip) para eutanásia do animal.
10. Delicadamente, lave o conjunto de eletrodos com água destilada. Em seguida, armazená sondas em um recipiente protector seco para evitar danos e degradação das superfícies dos elétrodos.

4. Pós-implantação em vitTeste ro

1. Delicadamente, lave o conjunto de eletrodos com água destilada para remover qualquer contaminação.
2. Conecte o conjunto de eletrodos de um potenciostato.
3. Com cuidado, coloque o conjunto de eletrodos na solução de teste e prender no lugar.
4. Coloque um contra-eletrodo de platina malha e eletrodo de referência Ag / AgCl na solução de teste e conectar-se ao potenciostato.
5. Usando o potenciostato, realizar espectroscopia de impedância eletroquímica seqüencial (EIS) (potencial compensar 0 V, amplitude 10 mV, faixa de freqüência 10-100,000 Hz) e voltametria cíclica (1 ciclo, faixa de potencial de 0,8 a -0,8 V, velocidade de varredura de 100 mV / s ) em todos os eléctrodos. Eletrodos não testados são mantidos em potencial de circuito aberto e um tempo de silêncio de 1 segundo é usado entre cada teste. Todos os eléctrodos 32 estão em contacto com a solução para a sessão de teste completo de 1 hr.
6. Remova o conjunto de eletrodos da solução teste e lavar cuidadosamente com água deionizada.
7. Pate o conjunto de eléctrodos em uma solução de limpeza enzimática durante 24 horas.
8. Remover o conjunto de eléctrodos a partir da solução e enxagua-se com água destilada.
9. Conecte o conjunto de eletrodos de um potenciostato.
10. Com cuidado, coloque o conjunto de eletrodos na solução de teste e prender no lugar.
11. Coloque um contra-eletrodo de platina malha e eletrodo de referência Ag / AgCl na solução de teste e conectar-se ao potenciostato.
12. Usando o potenciostato, realizar espectroscopia de impedância eletroquímica seqüencial (EIS) (potencial compensar 0 V, amplitude 10 mV, faixa de freqüência 10-100,000 Hz) e voltametria cíclica (1 ciclo, faixa de potencial de 0,8 a -0,8 V, velocidade de varredura de 100 mV / s ) em todos os eléctrodos. Eletrodos não testados são mantidos em potencial de circuito aberto e um tempo de silêncio de 1 segundo é usado entre cada teste. Todos os eléctrodos 32 estão em contacto com a solução para a sessão de teste completo de 1 hr.
13. Remover o conjunto de eléctrodos a partir da solução de teste elavar cuidadosamente com água deionizada.
14. Armazenar as sondas em um recipiente protector seco, para evitar danos e degradação das superfícies dos eléctrodos.

Resultados

Um conjunto de eléctrodos típico usado para este protocolo experimental é mostrado na Figura 1. Há 32 eletrodos de irídio em 4 hastes com 413 μ m ² nominal área geométrica e μ m campo 200. Cada segundo eléctrodo sobre a matriz tenha sido revestido com um dos quatro revestimentos de eléctrodos diferentes, marcadas 1-4. Os materiais de revestimento foram cuidadosamente escolhidos por suas propriedades químicas, mecânicas e eletroquímicas. Como mencionado anteriormente ^10,...

Discussão

Este protocolo fornece um método para comparar revestimentos de eléctrodos de gravação neurais dentro de um animal. O projeto eletrodo utilizado é ideal para implantação em um rato colículo inferior (CI), com dimensões de uma escala similar. Variações deste eléctrodo, como mais espaço entre as hastes impediria todas hastes sendo no rato IC, ao mesmo tempo, ao passo que hastes mais compridas e um passo maior entre os eléctrodos aumenta o risco de que as pontas de hastes vai entrar em contacto com a base do crânio durante...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Atenuador programável	TDT	PA5	Controla a amplitude do sinal acústico através das frequências Driver de
alto-falante eletrostático	TDT	ED1	Aciona os alto-falantes eletrostáticos (EC1)
Alto-falante eletrostático acoplado	TDT	EC1	Fornece som para o animal
Estação base de processamento	TDT	RZ2	Registra a atividade neural do arranjo de eletrodos (usando o pré-amplificador PZ2)
Pré-amplificador	TDT	PZ2-256	Pré-amplificador de alta impedância de 256 canais
Processador multifuncional	TDT	RX6	Usado para gerar estímulos acústicos
Eletrodo multicanal	NeuroNexus Technologies	A4 × 8-ndash; 5mm-200-200-413	Matriz de eléctrodos de 4 hastes e 32 canais
Potenciostato	CH Instruments	CHI660B	Deposita revestimentos de eléctrodos e efectua voltametria cíclica e EIS (utilizado com CHI684)
Multiplexador	CH Instruments	CHI684	Alterna entre eléctrodos no potenciostato
Fosfato dissódico	Fluka	71644	Utilizado na solução de teste
3,4- Etilenodioxitiofeno (EDOT)	Sigma Aldrich	483028	Um material de revestimento de eletrodo
para-tolueno sulfonato (Na2pTS)	Sigma Aldrich	152536	Um material de revestimento de eletrodo
Uretano	Sigma Aldrich	U2500	Usado para anestesiar o animal
Eletrodo de prata/cloreto de prata	CH Instruments	CHI111	Usado para testar o eletrodo in vitro
Eletrodo de platina	CH Instruments	MW4130	Usado para testar o eletrodo in vitro
Motorizado microdrive	Sutter Instruments	DR1000	Para controlar a posição do conjunto de eletrodos durante a cirurgia
Limpador enzimático	Advanced Medical Optics	Ultrazyme	Limpa a proteína do feixe de eléctrodos após a implantação
Invólucro acústico	TMC Ametek	83-501	Isola o animal do ruído acústico e eléctrico
Quadro estereotáxico	David Kopf Instruments	1430	Fixa e posiciona o animal
Controlador de temperatura	World Precision Instruments	ATC1000	Controla a temperatura do animal
Broca óssea	KaVo Dental	K5Plus	Usado para realizar a craniectomia
Aspirador	Flaem	Suction pro	Usado para realizar a craniectomia