A separação automática de C. elegans Variably Colonizada por um patógeno bacteriano

Resumo

O wormsorter facilita telas genéticas em Caenorhabditis elegans, classificando vermes de acordo com a expressão de repórteres fluorescentes. Aqui, descrevemos um novo uso: triagem de acordo com a colonização por um patógeno expressando GFP, e empregá-lo para examinar o papel mal compreendida de reconhecimento do patógeno em iniciar respostas imunes.

Resumo

O wormsorter é um instrumento semelhante a uma máquina de FACS que é utilizado em estudos de Caenorhabditis elegans, tipicamente para classificar vermes baseados na expressão de um repórter fluorescente. Aqui, destacam-se um uso alternativo deste instrumento, para classificar os vermes de acordo com seu grau de colonização por um patógeno expressando GFP. Este novo uso nos permitiu resolver a relação entre a colonização do intestino sem-fim e a indução de respostas imunitárias. Enquanto C. elegans respostas imunes a diferentes patógenos têm sido documentados, ainda é desconhecido o que os inicia. As duas possibilidades principais (que não são mutuamente exclusivos) são o reconhecimento de padrões moleculares associados a patógenos, e detecção de danos causados ​​por infecção. Para diferenciar entre as duas possibilidades, a exposição ao patógeno deve ser dissociado do dano que ela causa. A separação wormsorter habilitado de vermes que foram amplamente colonizados pela Gram-npatógeno egative Pseudomonas aeruginosa, com a provável dano causado pela carga de patógenos, de vermes que foram igualmente expostos, mas não, ou marginalmente, colonizado. Estas populações distintas foram usadas para avaliar a relação entre a carga e o agente patogénico a indução de respostas imunitárias de transcrição. Os resultados sugerem que os dois são dissociados, apoiando a possibilidade de reconhecimento do patógeno.

Introdução

Classificação automática verme é muito parecido com FACS, operando através da medição um sinal fluorescente em um sem-fim (normalmente fornecida pela expressão transgênica de proteínas repórter) que passa ajeitou em um tubo, o que permite o redirecionamento ou a um tubo de coleta / bem ou para um recipiente de resíduos de acordo para modular parâmetros definidos pelo pesquisador ^1. O wormsorter pode facilitar a pesquisa de várias maneiras; um exemplo de empregá-la como instrumento de análise é um estudo que seguiu os padrões espaço-temporais de atividade do promotor para quase 1.000 genes ^2.
No entanto, o uso principal do wormsorter é nas telas genéticas, a seguir os níveis de expressão do gene alvo ou a localização da proteína fluorescente ao longo do eixo do sem-fim ^{de 3-5.}

Aqui, descrevemos uma nova aplicação para o wormsorter, seguindo a colonização do worm por um patógeno fluorescente etiquetado. Com isto como uma ferramenta que incidiu sobre a relação entre Pathogen colonização / carga e da resposta imune, para ganhar novos insights sobre os mecanismos responsáveis ​​pela iniciação das respostas imunes do worm.

Em praticamente todos os organismos estudados até o momento, o início da resposta imune inata a patógenos microbianos depende do reconhecimento de padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs), e / ou padrões moleculares perigo / associado a danos (amortece) ^6,7. As estruturas microbianas primeiro são conservadas que incluem componentes da parede celular microbiana, seu flagelo, ou sua bicamada lipídica ^6, o segundo, incluem ambas as moléculas libertadas (por exemplo ATP ^8), as proteínas modificadas ou outros marcadores de processos celulares alterados ^9,10. Ambos os tipos de sinais são reconhecidos pelas proteínas designadas como receptores de reconhecimento de padrões (PRRs), que, após a ligação específica de uma molécula padrão activam uma cadeia de eventos que conduzem a uma resposta protectora. C. elegans foi extremamente útil como um Tractamodelo ble dissecar vários aspectos da interação patógeno-hospedeiro, mas uma coisa que não é bem compreendido é a forma como as respostas imunes são iniciadas no worm. Nenhum dos receptores putativos que são ortólogos de receptores de reconhecimento de padrões (SRRS) em outros organismos demonstraram ligar PAMPs, e muitos dos ortólogos de PRRs que são cruciais para as respostas imunes em outros organismos mostram surpreendentemente uma contribuição limitada para respostas verme patógeno e resistência. Por exemplo, o receptor Toll de Drosophila, que é essencial para resistir Gram positivos patogénicos, é representada em C. elegans por um único homólogo, tol-1, o que contribui para a protecção contra o agente patogénico Gram negativa Salmonella typhimurium ^11, mas não a partir de outros agentes patogénicos, ou-positivas gram-negativas testadas ^11,12. Estas observações, em conjunto com os dados que indicam que as respostas imunitárias poderia ser induzida por perturbar a tradução da proteína celular hcomo levou alguns a sugerir que C. elegans detecta principalmente DAMPs ^9,13,14. No entanto, relatos que descrevem a capacidade de agentes patogénicos mortos para induzir respostas imunológicas sugerem que a ligação pode ser PAMP têm um papel importante no reconhecimento de patógenos em C. elegans ^15,16. Trabalhos anteriores com foco em respostas imunes em sincronizado idade geneticamente idênticos C. elegans populações, demonstraram grande variabilidade individual na colonização intestinal pela Gram-negativo patógeno bacteriano Pseudomonas aeruginosa.

No entanto, estudos de perfis de transcrição tratada essas populações variavelmente-colonizados como uma entidade ^17,18. Aproveitando essa variabilidade, foi desenvolvido um protocolo visando ao wormsorter automatizado para separar populações colonizadas diferencialmente de Caenorhabditis elegans expostos a expressando GFP P. aeruginosa. Examinando a expressão genética em populações de forma diferente-colonizados FACIavaliação litated da relação entre a carga de patógenos (e os danos associados) e as respostas imunes e fornecidos novos insights sobre o reconhecimento do patógeno em C. elegans ^19. A seguir descreve-se o protocolo, o qual podia ser aplicado para classificar vermes infectadas com qualquer agente patogénico marcado por fluorescência.

Para potenciais utilizadores deve notar-se que o número de vermes necessários para ser resolvido depende da natureza das análises subsequentes e protocolos de uso. Por exemplo, no caso de análise de expressão do gene de microarray,> 1000 vermes será necessária para obter o ARN suficiente, se os protocolos padrão são usadas, mas aproximadamente 100 vermes seria suficiente, se é utilizada a amplificação, permitindo rápida recolha de material e, assim, minimizar o stress aos os vermes.

Protocolo

1. A obtenção de uma Cultura Synchronized de Jovens Adultos Animais

1. Crescer vermes em várias placas NGM semeados com OP50-1 E. bactérias coli (10x concentrada a partir de uma cultura saturada) até muitos vermes atingiram a fase gravídico.
2. Trate os animais grávidas com solução ovo-prep para obter uma cultura sincronizado (ovos).
3. Ovos placa em várias placas NGM 60 mm semeado com 10x concentrado OP50-1 a uma densidade de cerca de 150-200 ovos / placa.
4. Incubar as placas a 25 ° C durante 2 dias (até que os vermes têm alcançado o L4 - fase de adulto jovem).

2. Preparando Pseudomonas aeruginosa Placas e infectando Worms

1. No dia da preparação, ovo (passo 1.1) inocular uma cultura PA14 :: GFP em 2 ml de meios contendo rifampicina B de King, a uma concentração final de 100 ug / ml. Incubar a cultura a 37 ° C com agitação de O / N.
2. Placa da PA14 :: GFP cultura para o maior número de placas Killing Lenta (SKP), conforme necessário para o ensaio. Em cada 150 milímetros SKP Petri pipeta prato 75-100 mL de cultura saturada e espalhar uniformemente com uma espátula de vidro estéril. Incubar as placas a 37 ° C durante 20-24 horas.
3. Retirar as placas do incubador e permitir-se arrefecer até à temperatura ambiente (~ 20 min). Usando tampão M9, lavar vermes do passo 1.4 em PA14 :: placas GFP em um volume mínimo de líquido. Ao utilizar placas de 150 mm, centenas de vermes podem ser colocados em uma única placa.
4. Incubar as placas a 25 ° C durante 18-21 horas. Para P. vermes aeruginosa expostas jovens adultos, esta é a janela de tempo exibindo a distribuição ideal de colonizado vs animais não colonizados.

3. Configurando o Wormsorter

Antes de executar a amostra tipo, verifique se a máquina está funcionando corretamente. Detalhes podem ser obtidos no http://www.unionbio.com/support/documents.aspx?id=43, e the etapas essenciais são descritas abaixo.

1. Ajuste a pressão da válvula bainha para cerca de 5 psi (4,5-5,5 intervalo).
2. Para verificar que a taxa de fluxo de fluido bainha é apropriado, colocar um tubo de 15 ml por baixo do distribuidor, ligue a válvula de bainha e desligue a válvula de classificador. Segurar o tubo abaixo do distribuidor durante 60 seg. O volume no tubo deve ser de 9-10 ml. Se estiver fora dessa faixa, ajuste a pressão da válvula de bainha em conformidade.
3. Para garantir que a taxa de fluxo do fluido do invólucro (definido como no passo 3.2), vai permitir a classificação exata, testar a taxa de ordenação utilizando 40 partículas mM de controle:
4. Desligue a válvula de bainha. Adicionar cerca de 25 ml de solução de partículas de controlo para o reservatório.
5. Ligar a válvula de bainha e a válvula de amostra.
6. No software de computador, navegar para o "modo de controle de partículas" e clique em adquirir.
7. Certifique-se que a taxa de fluxo de partículas é de aproximadamente 5-8 partículas / s, com um TOF (tempo de vôo) aproximar a largurada partícula, de 40 ^ m. Tal TOF indica que apenas um único 40 um objecto está a passar através de cada vez. Se os valores estão fora dessa faixa, ajuste as configurações (seguindo as instruções acima) em conformidade.

4. Ordenando Colonizada vs não colonizados Worms

1. Usando M9, lavar vermes em tubos cónicos de 15 ml. Permitir que os vermes adultos de afundar para o fundo do tubo por gravidade e remove-se o sobrenadante. Encha o tubo com fresco M9. Repita este processo 3-4x. Isto remove uma grande proporção de larvas, bem como as bactérias em excesso e demora cerca de 10 minutos.
2. Adicionar vermes para o reservatório wormsorter com uma barra de agitação pequena delicadamente-mistura.
3. Ajuste o ganho do sinal inicial, definindo o PMT Verde para 600 eo vermelho e amarelo PMT a 200.
4. Comece a aquisição de dados para ajustar as configurações.
5. Apontar para uma taxa tipo de 25-30 eventos (vermes) por segundo. Se a taxa for demasiado elevado número, diluir os vermes no reservatório com M9 conformidade. Se a taxa éo baixo, adicione mais vermes em um pequeno volume de M9.
6. Se o experimento requer uma separação muito rigoroso de colonizado vs vermes não colonizados, defina a "verificação de coincidência" a "pura". Isto assegura que, no caso de dois objectos ocorrer demasiado perto um do outro ou na mesma queda, a máquina rejeita a gota em vez de a sua recolha.
7. Para classificar a população de interesse, desenhar portas em torno dos eixos indicando o tamanho (para obter vermes adultos) e intensidade de fluorescência (ou seja, alta de colonizado, de baixo para não colonizados). Os valores de fluorescência gating deve ser determinada empiricamente.
8. Colocar uma placa multi-bem ou uma placa de Petri sob o dispensador de recolher vermes em seguida, abra a válvula de tipo para começar a triagem worms.
9. Recolha de uma pequena população de animais para verificar ao microscópio que a população é classificada a população de interesse. Se não, ajustar os parâmetros de propagação de acordo e continuar com a coleta de amostras.

Resultados

Quando a idade-pareado, geneticamente idênticos C. elegans estão expostos a P. aeruginosa, uma ampla distribuição é observado em níveis de colonização (Figura 1A). Com a ajuda do protocolo descrito aqui a separação eficiente de não colonizados de vermes colonizados pode ser conseguida (Figura 1B). Ao contrário dos worms não colonizados, vermes colonizados mostrar sinais de danos, tais como lentidão e reduziu a defecação ^19. Este último pode ser uma razão pel...

Discussão

O método que descrevemos aproveita de marcação fluorescente de entidades fora do worm, para acompanhar as interações entre o vírus e seu ambiente. No caso que apresentamos, a separação foi baseada em rotulagem de um patógeno e foi empregado para vermes separados com carga de patógenos pesado daqueles sem (ou luz) de carga. Análise de expressão gênica Subsequente não encontraram nenhuma diferença nas respostas imunes entre os dois grupos, sugerindo que eles foram independentes da carga de patógenos. O sinal que inicia a ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
M9 Tampão	preparado em casa		Receita em wormbook.org
Rifampicina	Sigma	R3501
Solução de preparação de ovos	preparada em casa		50 ml de água; 40 ml de água sanitária; 10 ml de placas NGM de hidróxido de sódio 10 N
	preparadas em casa		Receita em wormbook.org
placas SKP	preparadas em casa		Receita igual à NGM apenas 0,35% de peptona em vez de 0,25%
partículas de teste de controle	Union Biometrica	310-5071-001