O wormsorter facilita telas genéticas em Caenorhabditis elegans, classificando vermes de acordo com a expressão de repórteres fluorescentes. Aqui, descrevemos um novo uso: triagem de acordo com a colonização por um patógeno expressando GFP, e empregá-lo para examinar o papel mal compreendida de reconhecimento do patógeno em iniciar respostas imunes.
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Resumo
Resumo
O wormsorter é um instrumento semelhante a uma máquina de FACS que é utilizado em estudos de Caenorhabditis elegans, tipicamente para classificar vermes baseados na expressão de um repórter fluorescente. Aqui, destacam-se um uso alternativo deste instrumento, para classificar os vermes de acordo com seu grau de colonização por um patógeno expressando GFP. Este novo uso nos permitiu resolver a relação entre a colonização do intestino sem-fim e a indução de respostas imunitárias. Enquanto C. elegans respostas imunes a diferentes patógenos têm sido documentados, ainda é desconhecido o que os inicia. As duas possibilidades principais (que não são mutuamente exclusivos) são o reconhecimento de padrões moleculares associados a patógenos, e detecção de danos causados por infecção. Para diferenciar entre as duas possibilidades, a exposição ao patógeno deve ser dissociado do dano que ela causa. A separação wormsorter habilitado de vermes que foram amplamente colonizados pela Gram-npatógeno egative Pseudomonas aeruginosa, com a provável dano causado pela carga de patógenos, de vermes que foram igualmente expostos, mas não, ou marginalmente, colonizado. Estas populações distintas foram usadas para avaliar a relação entre a carga e o agente patogénico a indução de respostas imunitárias de transcrição. Os resultados sugerem que os dois são dissociados, apoiando a possibilidade de reconhecimento do patógeno.
Introdução
Classificação automática verme é muito parecido com FACS, operando através da medição um sinal fluorescente em um sem-fim (normalmente fornecida pela expressão transgênica de proteínas repórter) que passa ajeitou em um tubo, o que permite o redirecionamento ou a um tubo de coleta / bem ou para um recipiente de resíduos de acordo para modular parâmetros definidos pelo pesquisador 1. O wormsorter pode facilitar a pesquisa de várias maneiras; um exemplo de empregá-la como instrumento de análise é um estudo que seguiu os padrões espaço-temporais de atividade do promotor para quase 1.000 genes 2.
No entanto, o uso principal do wormsorter é nas....
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Protocolo
1. A obtenção de uma Cultura Synchronized de Jovens Adultos Animais
- Crescer vermes em várias placas NGM semeados com OP50-1 E. bactérias coli (10x concentrada a partir de uma cultura saturada) até muitos vermes atingiram a fase gravídico.
- Trate os animais grávidas com solução ovo-prep para obter uma cultura sincronizado (ovos).
- Ovos placa em várias placas NGM 60 mm semeado com 10x concentrado OP50-1 a uma densidade de cerca de 150-200 ovos / placa.
- Incubar as placas a 25 ° C durante 2 dias (até que os vermes têm alcançado o L4 - fase de adulto jovem).
2. Preparando Pseudom....
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Resultados
Quando a idade-pareado, geneticamente idênticos C. elegans estão expostos a P. aeruginosa, uma ampla distribuição é observado em níveis de colonização (Figura 1A). Com a ajuda do protocolo descrito aqui a separação eficiente de não colonizados de vermes colonizados pode ser conseguida (Figura 1B). Ao contrário dos worms não colonizados, vermes colonizados mostrar sinais de danos, tais como lentidão e reduziu a defecação 19. Este último pode ser uma razão pel.......
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Discussão
O método que descrevemos aproveita de marcação fluorescente de entidades fora do worm, para acompanhar as interações entre o vírus e seu ambiente. No caso que apresentamos, a separação foi baseada em rotulagem de um patógeno e foi empregado para vermes separados com carga de patógenos pesado daqueles sem (ou luz) de carga. Análise de expressão gênica Subsequente não encontraram nenhuma diferença nas respostas imunes entre os dois grupos, sugerindo que eles foram independentes da carga de patógenos. O sinal que inicia a .......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Os autores agradecem a Fundação Médica Ellison pelo seu apoio. Gostaríamos também de agradecer aos membros do laboratório de Abby Dernburg para a assistência com o uso do wormsorter.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| M9 Tampão | preparado em casa | Receita em wormbook.org | |
| Rifampicina | Sigma | R3501 | |
| Solução de preparação de ovos | preparada em casa | 50 ml de água; 40 ml de água sanitária; 10 ml de placas NGM de hidróxido de sódio 10 N | |
| preparadas em casa | Receita em wormbook.org | ||
| placas SKP | preparadas em casa | Receita igual à NGM apenas 0,35% de peptona em vez de 0,25% | |
| partículas de teste de controle | Union Biometrica | 310-5071-001 |
Referências
- Pulak, R. Techniques for analysis, sorting, and dispensing of C. elegans on the COPAS flow-sorting system. Methods Mol. Biol. , 275-286 (2006).
- Dupuy, D., et al. Genome-scale analysis of in vivo spatiotemporal promoteractivity i....
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Reimpressões e permissões
