Identificação de modificações pós-translacionais de Complexos de proteína vegetal

Resumo

Descrevemos aqui um protocolo para a purificação e caracterização de complexos de proteínas de plantas. Nós demonstramos que por imunoprecipitando uma única proteína dentro de um complexo, para que possamos identificar as suas modificações pós-traducionais e seus parceiros que interagem.

Resumo

As plantas se adaptar rapidamente às mudanças no ambiente, devido à elaboração de percepção e sistemas de sinalização. Durante o ataque de patógenos, as plantas respondem rapidamente a infecção através do recrutamento e ativação de complexos imunes. A activação dos complexos imunes é associado com modificações pós-traducionais (PTMs) de proteínas, tais como fosforilação, glicosilação, ubiquitinação ou. Compreender como esses PTMs são coreografadas levará a uma melhor compreensão de como a resistência é alcançada.

Aqui nós descrevemos um método de purificação de proteínas para repetições ricas em leucina de ligação de nucleotídeos (NB-LRR)-interagindo proteínas ea posterior identificação de suas modificações pós-traducionais (PTMs). Com pequenas modificações, o protocolo pode ser aplicado para a purificação de outros complexos de proteínas de plantas. O método baseia-se na expressão de uma versão com etiquetas-epitopo da proteína de interesse, a qual é subsequentemente parcialmente purificado by imunoprecipitação e submetido a espectrometria de massa para a identificação de proteínas que interagem e PTMs.

Este protocolo demonstra que: i). Estas alterações dinâmicas em PTMs tais como a fosforilação pode ser detectado por espectrometria de massa; ii). É importante ter quantidades suficientes da proteína de interesse, e este pode compensar a falta de pureza do imunoprecipitado, iii). A fim de detectar PTMs de uma proteína de interesse, esta proteína tem de ser imunoprecipitada a obter uma quantidade suficiente de proteína.

Introdução

Vias imunitárias dependem de várias modificações pós-traducionais (PTMs) de proteínas de transdução de sinais rapidamente e activar as respostas imunes ^1. PTMs são alterações químicas rápidas, reversíveis e altamente específicos da estrutura de proteínas que podem afetar a conformação da proteína, atividade, estabilidade, localização e interações proteína-proteína ^2-4. Nas plantas, a mais de 300 tipos de PTMs foram identificadas incluindo ubiquitinação, sumoilação, sulfatação, glicosilação, fosforilação e ^2,5. Um crescente corpo de evidência ressalta a importância de PTMs em diferentes aspectos da planta imunidade ^1,5,6. A fosforilação de proteínas, a fixação reversível de um grupo fosfato para uma serina, treonina ou resíduo de tirosina é um regulador de muitas funções celulares e não é de surpreender o mais altamente estudada PTM em defesa da planta cascatas de sinalização ^5-11. Sinalização dependente de fosforilação é uma parte integrante da planta defeativação nse iniciada após a percepção extra-celular de micróbios por receptores transmembrana, ou reconhecimento intracelular por proteínas de resistência de vários domínios ^5,8.

Após a invasão de plantas, micróbios são detectados por receptores de membrana do plasma chamados receptores de reconhecimento de padrões (PRRs) ^12. PRRs conhecidos são proteínas ambos receptores-like (LPR) ou quinases de receptores-like (RLKs), ambos carregando um ectodomain-ligação do ligante e um domínio transmembrana de passagem única. Em contraste com a LPR, RLKs têm um domínio de quinase intracelular ^13-15. O ectodomínio de PRRs se liga às moléculas do micróbio elicitores conservadas chamados padrões moleculares associados a agentes patogénicos (PAMPs) principais, no caso de RLKs, a autofosforilação e a transfosforilação dentro do domínio intracelular de ^{6, 16.} A jusante da fosforilação induzida pela percepção de PRRs, fosforilação subseqüente de proteínas citoplasmáticas, incluindo quinases ^{17, 18,} E3 ligases ^19, proteínas quinases ativadas por mitógenos (MAPKs) ^{20, 21,} proteínas quinases dependentes de cálcio (CDPK) ^{22, 23,} e fatores de transcrição ^{24, 25} leva à imunidade PAMP-triggered (PTI).

Para além da percepção extracelular por PRRs, reconhecimento intracelular de patógenos é conseguido através dos receptores citoplasmáticos. Estes resistência de vários domínios (R) as proteínas contêm um domínio variável N-terminal, uma ligação de nucleotídeos (NB) motivo central, e repetições ricas em leucina C-terminal (LRR) e, por conseguinte, o nome de proteínas NB-LRR ^{26, 27.} Proteínas R directa ou indirectamente reconhecer moléculas derivadas de virulência de organismos patogénicos chamados efectores, também conhecidos por alvejar PRRs e outros nodos do sistema imunológico. Reconhecimento induz defesas fortes que levam a disparada efetuador imunidade (ETI) ^28-31. Proteínas NB-LRR tem um requisite motivo de ligação a ATP no domínio NB ^{30, 32,} mas falta-lhes um domínio quinase. A fosforilação de domínios conservados de NB-LRRs tem sido relatado em uma pesquisa proteômica em larga escala ^33, mas a sua relevância para a ETI não é clara. À semelhança do PTI, ativação de proteínas NB-LRR leva a fosforilação de proteínas citoplasmáticas, incluindo MAPKs ^34-37 e ^38-40 CDPKs. Mais importante ainda, o reconhecimento efector pode conduzir à fosforilação de proteínas acessórias que interagem directamente com as proteínas de NB-LRR ^41. Alguns exemplos incluem RIN4 (Arabidopsis thaliana) e Pto (tomate, Solanum lycopersicum) proteínas que interagem com as proteínas NB-LRR, RPM1 ^{42, 43} e Prf ^44, respectivamente. Durante a infecção por bactérias de Pseudomonas syringae, a proteína efectora AvrB induz RIN4 fosforilação, muito provavelmente pela quinase do tipo receptor RIPK ^{45, 46. Da mesma forma, no tomate a P. syringae efetores AvrPto e AvrPtoB induzir fosforilação de Pto 47. Em contraste com RIN4 qual falta um domínio cinase e devem ser trans-fosforilado, Pto é uma cinase activa capaz de auto-fosforilação 48 e trans-fosforilação de substratos 49, 50. Enquanto Pto requer sua atividade quinase para a iniciação dependente efetuador de sinalização, os mutantes Pto quinase mortos ainda são capazes de sinalizar de forma independente efetuador 51. Recentemente, explicou estas observações, demonstrando que o complexo Prf / Pto é oligomérica, contendo vários Prf e Pto moléculas 52 e que as moléculas Pto dentro do mesmo complexo pode trans-fosforilar o outro 47. Propusemos um modelo em que uma molécula de Pto (sensor) interage com a proteína efectora, causando uma mudança de conformação para a proteína NB-LRR (FRP) que por sua vez, activa uma segunda molécula Pto (helper) within o complexo. Subsequentemente, a molécula auxiliar Pto trans-fosforilação do sensor Pto conduzindo a activação completa do complexo de resistência 47.}

Estes exemplos demonstram que a identificação de componentes de complexos imunes e seus PTMs potenciais no reconhecimento efector pode conduzir a uma melhor compreensão de como os sinais são transduzidos de percepção efector para alvos a jusante. Aqui nós descrevemos um método de purificação de proteínas para as proteínas NB-LRR-interagindo ea posterior identificação de suas PTMs. Usamos Nicotiana benthamiana e o complexo de tomate Prf / Pto como um modelo, mas o mesmo protocolo pode ser facilmente aplicado a partir de N. RLKs benthamiana e A. thaliana ⁵³ com pequenas modificações, como descrevemos no âmbito do protocolo.

Protocolo

Nota: todas as medidas são feitas em temperatura ambiente, salvo indicação contrária.

1. Preparação de plantas Materiais e amortecedores

1. Para N. benthamiana
   1. Crescer a Agrobacterium tumefaciens estirpes de interesse para expressão transiente (neste exemplo Prf-FLAG, Prf-3xHA, Pto-FLAG e o vector vazio como um controlo) por agitação (200 rpm) em cultura líquida (meio L, com os antibióticos apropriados) em 28 ° C até à fase estacionária.
   2. Recolha e sedimentar Agrobacteria por centrifugação (3000 xg durante 5 min). Descartar o sobrenadante e ressuspender em tampão de Agrobactérias peletizadas infiltração.
   3. Medir a quantidade de Agrobacteria por obtenção da densidade óptica (OD) de valor a uma absorvância de 600 nm (Abs 600 nm). Ajuste o OD de bactérias para 0,1-0,8.
   4. Infiltrar N. 4 semanas de idade plantas benthamiana (22 ° C, 16 horas de luz) com Agrobacteria por hand (com uma seringa sem agulha 1 ml) ou por meio de vácuo (adicionar 0,02% v / v de surfactante).
      Nota: Use a primeira folha quase totalmente expandido, e as duas folhas imediatamente mais antigos para a expressão da proteína mais eficaz. Para detecção de proteínas ubiquitinados ou acetilados infiltrar folhas com 100 nM de MG-132 ou 100 ng / ml tricostatina A, respectivamente, em 1 e 2 dias após a infiltração.
   5. Colher as folhas infiltradas 2-5 dias pós-infiltração e congelamento em nitrogênio líquido. Armazenar as amostras em um congelador a -80 ° C.
      Nota: determinar o melhor nível de expressão da proteína de interesse de antemão por recolha de amostras ao longo de um curso de tempo de 5 dias, e detectar os níveis de proteína por imunotransferência.
2. Para A. thaliana linhagens transgênicas estáveis
   1. Crescer A. thaliana sementes em placas de 6 poços, suplementado com 5 ml de meio MS líquido (1% w / v de sacarose) por poço. Coloque 3-5 sementes (esterilizados e estratificados) da linhagem transgênicade interesse ou a linha de controle não transformada por poço. Agitar a 200 rpm, durante dois dias antes de os transferir a placa para uma sala de crescimento e deixar durante 2 semanas (22 ° C, 10 horas de luz).
   2. Colheita de amostras e congelamento em nitrogênio líquido.
      Nota: Você pode usar como um controle de uma linhagem transgênica expressando uma proteína relacionada com a mesma marca como a proteína de interesse.
3. Amortecedores
   1. Preparar tampão A. De-gás do tampão durante 1-2 h (por RLKs, outras proteínas ligadas à membrana e proteínas nucleares, adicionar 1% v / v de IGEPAL CA-630 ^53).
      Nota: Você pode manter tampão A, a 4 ° C por tempo indeterminado. É possível utilizar 1% v / v de Triton em vez de IGEPAL CA-360.
   2. Prepare 80 ml de frio tampão B, pelo menos 1-2 horas antes da extração.
      Nota: A proporção ideal de tecido contra tampão de extracção é 1:4 (w / v).

2. Extração de Proteína

1. Pouco antes da extração de preparar 80 ml de frio Tampão C.
   Nota: Adiciona-se 10 ^ M MG-132 para a detecção de proteínas ubiquitinated.
2. Moer 20 g de N. tecido benthamiana (cerca de 15 folhas) ou A. thaliana mudas (2-4 g por 6 bem-placa) em nitrogênio líquido, utilizando um almofariz e pilão.
3. Adicionar 80 ml de frio Tampão C a 20 g de tecido solo, misture bem, e descongelar no gelo.
   Nota: Moer todas as amostras, ao mesmo tempo (proteína de interesse e de controlo).
4. Misturar com três explosões de 10 segundos cada à velocidade máxima, com um homogeneizador de tecidos (pré-arrefecido a 4 ° C). Filtrar através de um tecido de 22-25 ^ m e centrifugar a 30000 xg durante 30 min a 4 ° C.
   Nota: Como alternativa, homogeneizar com um almofariz e pilão prechilled fresco.
5. Para os passos de bloqueio e lavagem da matriz de afinidade, preparar 20 ml de Tampão D.
6. Bloco 100 ml de matriz de afinidade adequada, utilizando 500 ml de tampão D frio contendo BSA a 1% durante 5 min a 4 ° C.
   Nota: af preferidomatrizes Finity incluem anti-FLAG M2 de agarose, agarose estreptavidina, GFP-Trap_A e anti-HA de agarose.
7. Lavar 3x com 1 ml frio Tampão D.
8. Remover o sobrenadante do extracto de folha de filtro e através de um filtro de seringa de 0,45 um para um novo tubo em gelo.
   Nota: A cor do extrato deve ser verde ou amarelo, se a amostra se tornou marrom, descartar e começar de novo.
9. Tome uma alíquota do extrato bruto por immunoblot, adicionar tampão SDS-PAGE carregamento 5x, vórtice e desnaturar por amostras fervente por 10 min a 80-100 ° C em um bloco de calor.

3. Imunoprecipitação Protein

1. Dividir o extracto de proteína em dois tubos de 50 ml e adicionar 50 ml da matriz de afinidade em suspensão em tampão D para cada tubo. Incubar, com rotação suave, durante 2 horas a 4 ° C.
   Nota: As incubações mais longas não foram encontradas para aumentar o rendimento.
2. Preparar 600 ul (6x volume de cordão de matriz de afinidade) de tampão de eluição por adição deTampão D (concentrações finais): 0,5% de BSA, péptido de 0,25 mg / ml de FLAG (para anti-FLAG M2 de agarose) ou 10 mM de D-biotina (para Estreptavidina de agarose).
   Nota: eluição não é recomendado no caso de GFP-Trap_A e anti-HA matrizes, assim proceder diretamente à ebulição em tampão SDS-PAGE carregamento 1x, passo 3.11.
3. Precipitar a matriz de afinidade através de centrifugação a 4 ° C (5 min a 1000 xg).
4. Tomar uma aliquota do extracto não ligada por imunoblot, descartar o resto do sobrenadante, deixando aproximadamente 500 ul no fundo do tubo.
5. Ressuspender a solução lama com uma ponta de todo o furo.
6. Transferir a solução suspensão mista de ambos os tubos a um único tubo de 1,5 ml.
   Nota: A partir de agora, use 1,5 ml de baixa proteína tubos de microcentrífuga vinculativo.
7. 3x pulso durante 5 segundos usando uma centrífuga de bancada para precipitar a matriz de afinidade e remover o sobrenadante.
8. Lave 3-5x com 1 ml de tampão frio D. Entre as lavagens precipitar a matri afinidadex como anteriormente descrito e desprezar o sobrenadante. Na última lavagem remover o excesso de tampão D, com a agulha de uma seringa.
   Nota: Uma lavagem final utilizando tampão D com 0,1% de IGEPAL pode ser usado para reduzir ainda mais a ligação não específica.
9. Eluição com 200 mL do tampão de eluição adequado (para anti-FLAG M2 ou Streptavidin agarose veja o passo 3.2) 3x, 5 min cada vez com agitação constante.
10. Reúnem-se os três produtos de eluição em um único tubo. Concentra-se as proteínas por meio de 30 mL de resina de absorção. Vortex, deixar repousar durante 5 min e precipitar a resina (2 min a 10.000 x g). Desprezar o sobrenadante.
    Nota: Para GFP-Trap_A e anti-HA agarose, ignore as etapas 3.9 e 3.10.
11. Adicionar 50 ul de tampão de SDS-PAGE de carga 1x à matriz de afinidade ou uma resina de absorção precipitado. Vortex e deixe ferver por 10 minutos a 80-100 ° C em um bloco de calor.
12. Centrifugar a matriz de afinidade ou uma resina fervida durante 2 min a 10.000 x g. Aliquota 5 ul da supernatant por imunotransferência, e executado com outras fracções para um ~ 10 cm de comprimento de gel de SDS-PAGE (Figura 2).
13. Para a separação e identificação de proteínas fosforiladas por espectrometria de massa, carregar os restantes 45 mL para uma ~ 19 cm de comprimento de gel de SDS-PAGE se separação adicional é requerido (Figura 2).
    Nota: Uma pista em branco pode ser incluído entre todas as amostras para reduzir a contaminação de amostras.

4. Digestão de proteínas

1. Corar o gel de SDS-PAGE com Azul Brilhante de Coomassie coloidal (CCBB) mancha.
   Nota: minimizar a manipulação do gel para reduzir a contaminação por queratinas. Certifique-se de que nenhum equipamento ou ferramentas foram usadas para immunoblotting ou outras atividades que poderiam ter deixado contaminação proteína residual.
2. Destain o gel com lavagem copiosa de água, de preferência S / N. Corte a banda de interesse do gel com uma lâmina de barbear limpa.
   Nota: Alinhar o gel com o imunoblot se necessary para localizar a área correta. Como fosforilação pode retardar a migração da proteína em SDS-PAGE a cortar a área imediatamente acima e abaixo da banda de interesse.
3. Cortar a tira de gel em cubos de 2-4 mm (isto garante que o gel vai ser coberta por soluções no tubo, sem bloquear as pontas de pipeta). Coloque em um tubo.
4. Estimar o volume necessário para manter o gel bem submersa. Use esse valor para derivação, a incubação com protease e extração de peptídeo, e então usar o dobro de volumes triplos para lavagem.
   Nota: Em um típico digerir com aproximadamente 100 mL de os pedaços de gel corte, utilize 500 mL solução para lavar, 2 x 180 mL de desidratação, 150 mL de redução, de 120 mL de alquilação, e 120 mL para a digestão.
5. Lave os pedaços de gel de 2 x 20 min (ou até descorados) pela adição de 50% de acetonitrilo (em bicarbonato de amónio 50 mM, ABC). Pipeta off a solução tomando cuidado para não retirar pedaços de gel.
6. Desidratar com 100% de acetonitrilo durante 5 min e remover o líquido livre.
   Nota: O gel deve aparecer encolhido e branco. Se a cor azul persistir, incubar mais em acetonitrilo / ABC e / ou a temperatura elevada (45-55 ° C).
7. Reduzir pontes dissulfeto de proteína pela adição de 10 mM DTT em água e incubar por 30-45 min a 56 º C com agitação. Remover líquido livre.
8. Resíduos de cisteína alquilados de por adição de 55 mM de cloroacetamida (ABC em 50 mM) durante 20-30 minutos (a temperatura ambiente, luz). Remover líquido livre.
9. Lavar as peças de gel de 2 x 10 min, com 50% de acetonitrilo (em ABC 50 mM). Remover líquido livre.
10. Desidratar pedaços de gel com 100% de acetonitrila por 5 minutos e retire líquido livre.
11. Para a digestão tríptica, adicionar 40 ul de solução de trabalho de tripsina (100 ng de tripsina em tampão de digestão: ABC 50 mM, 5% de acetonitrilo para uma banda corada com Coomassie média). Permitir pedaços de gel para hidratar por 10 min. Adicionar suficiente de tampão de digestão para cobrir pedaços de gel se necessário. Incubar a 37 º CS / N.
12. Para parar a digestão e extrair os péptidos a partir dos pedaços de gel, adicionam-se 5% de ácido fórmico (a 50% de acetonitrilo) (adicionar o mesmo volume que o volume de digestão). Sonicar por 5-10 min. Transferir o sobrenadante para um novo tubo. Repetir a extracção de 3x.
13. Secam-se os péptidos por liofilização (preferido) ou um concentrador de vácuo (como Speed-Vac ou Savant). Armazenar a -20 º C.
14. Envie o seu exemplo para espectrometria de massa.
    Nota: Submetemos nossa amostra à facilidade de espectrometria de massa em O Laboratório Sainsbury (Norwich, Reino Unido). Protocolos para instalações de espectrometria de massa variar consideravelmente, mas tipicamente péptidos serão dissolvidos em 0,2% de ácido trifluoroacético com acetonitrilo a 2% antes do carregamento para um sistema de cromatografia líquida acoplada ao electro-spray de espectrometria de massa em tandem.

Resultados

Descrevemos aqui um protocolo para a purificação de proteínas marcadas de estável transgênico A. thaliana linhas ou após a expressão transitória de proteínas em N. benthamiana. Tal como ilustrado na Figura 1 a purificação da proteína alvo é acoplado com espectrometria de massa para permitir a identificação de proteínas que interagem e os PTMs da proteína alvo. O protocolo foi concebido para purificação de proteínas envolvidas na imunidade da planta e a identificação dos seus PTMs, mas pode ser aplicado para a purificação de qualquer proteína de plantas com etiquetas.

Como um exemplo, usamos a purificação do complexo Prf / Pto de N. benthamiana. N. O transgênico linha benthamiana 38-12 ^54, expressando 35S: Pto, foi temporariamente transformado com 35S: Prf-FLAG eo complexo foi imunoprecipitado com anti-FLAG M2 agarose (Figura 2A). As imunomarcações (IB) na Figura 2Ailustram que a maior parte da proteína alvo (Prf) foi imunoprecipitada. Pto e da proteína efectora interage AvrPtoB foram copurified com Prf e detectada utilizando anticorpos e análise de espectrometria de massa (Figuras 2A e 2B). Descobrimos que o Pto que copurified com Prf migraram mais lento em gel SDS-PAGE, quando co-expressos com o efetor constrói 35S: AvrPto e 35S: AvrPtoB (Figura 2A). Ambas as proteínas efectoras induzida migração mais lenta do Pto Prf-interagindo (Figura 2A). Este efectoras dependente de reconhecimento lenta migração de Pto foi anteriormente atribuído à fosforilação uma vez que podia ser removido por tratamento com fosfatase ^44. Para detectar os locais de fosforilação que contribuem para a migração lenta do Pto, que submetido a copurifying Prf Pto para análise por espectrometria de massa. Apesar da alta expressão do Pto e sua detecção fácil com immunoblots poderíamos recuperar peptídeos cOvering apenas 57% da seqüência Pto e não conseguimos identificar quaisquer sítios de fosforilação (Figura 2B).

Posteriormente, mudou as estratégias para atingir a proteína Pto com anti-FLAG. N. plantas benthamiana WT foram transitoriamente transformado com 35S: Prf-3HA e 35S: Pto-bandeira, com ou sem 35S: AvrPto e 35S:. AvrPtoB A quantidade total de proteína Pto, compreendendo tanto o Prf-complexado e as formas livres, foi imunoprecipitado com anti-FLAG M2 de agarose e submetido a fraccionamento por SDS-PAGE, em gel de digestão tríptica e análise de espectrometria de massa (Figura 2C). Com esta abordagem foram identificados peptídeos Pto abrangendo cerca de 80% de sua seqüência e um desconhecido 100 proteína interagindo kDa. Identificamos um conjunto de sítios de fosforilação individuais e duplos para tomada de força peptídeos 187-202 e 188-202 (Tabela 1). Ser-198 e Thr-199 foram os locais de fosforilação predominantes, mas outros phosítios sphorylation também foram detectadas (Tabela 1). O mais importante é a fosforilação dupla na Ser-198 e Thr-199 foi identificado apenas na presença de qualquer uma das proteínas efectoras (Tabela 1). Recentemente, identificou um conjunto semelhante de sítios de fosforilação Pto e ilustrou a importância do evento para a sinalização dupla fosforilação ^47. Seguindo o protocolo descrito aqui, fomos capazes de identificar as mudanças dinâmicas no estado de fosforilação da proteína alvo.

Figura 1. Delineamento experimental Geral. A proteína alvo para imunoprecipitação (IP) é marcado e expressa em planta, Nicotiana benthamiana transitoriamente em forma estável ou em Arabidopsis thaliana. Após a extracção de proteínas doproteína alvo é imunoprecipitada com uma matriz de afinidade. As proteínas são separadas num gel de acrilamida por electroforese. Bandas de gel são excisadas. As proteínas são extraídas das bandas do gel e submetido a espectrometria de massa. Sítios de fosforilação e proteínas que interagem são identificados. Clique aqui para ver imagem ampliada.

Figura 2. Prf e Pto imunoprecipitação. UM). A construção 35S: Prf-FLAG foi transitoriamente expressa em 38-12 linha (35S: PTO), juntamente com vetor vazio (EV), 35S: AvrPto ou 35S: AvrPtoB. Três dias após a infiltração Prf foi imunoprecipitou usando matriz de afinidade anti-FLAG. Immunoblots (IB) para Prf, AvrPtoB e Pto foram realizados. Como apontado por setas na parte inferior do painel de immunoblot Pto, AvrPto e AvrPtoB induzir uma migração mais lenta de Pto. B). A construção 35S: Prf-FLAG foi transitoriamente expressa em 38-12 linha (35S: PTO), juntamente com vetor vazio (EV), 35S: AvrPto ou 35S: AvrPtoB. Três dias após a infiltração Prf foi imunoprecipitado usando agarose de anti-FLAG e separadas em SDS-PAGE. O gel foi corado com Azul Brilhante de Coomassie coloidal (CCBB) e o Prf visível, Pto e AvrPtoB proteínas bandas foram excisadas do gel e analisados ​​por espectrometria de massa. A cobertura percentual de sequências de péptido Pto e Prf identificadas por espectrometria de massa é indicado. C). As construções 35S: Prf-3xHA e 35S: Pto-FLAG foram transitoriamente expressa juntamente com 35S: AvrPtoB, 35S: AvrPto ou vetor vazio (EV) em N. benthamiana. Três dias após a infiltração da quantidade total dePto-FLAG foi imunoprecipitado usando anti-FLAG de agarose e resolvidas em SDS-PAGE. O Pto Pto-visível e interagindo bandas de proteína foram excisadas do gel e analisados ​​por espectrometria de massa. Pto e a banda de proteína de 100 kDa Pto-interagindo são claramente visíveis na coloidal de Coomassie Brilliant Blue (CCBB)-gel corado, enquanto Prf é ligeiramente menos visível (como indicado pelas setas). IP: Immunoprecipitation; IB: Imunoblot; CBB: Coomassie coloração azul brilhante; CCBB: coloração Coomassie Brilliant Blue coloidal. Clique aqui para ver imagem ampliada.

	Prf
	EV	AvrPto	AvrPtoB
Peptídeo Pto 188-202
GTELDQ [p T 195] HLSTVVK	1	1	0
GTELDQTHL [p S 198] TVVK	10	7	5
GTELDQTHLS [p T 199] VVK	8	3	4
G [p T 190] ELDQTHLS [p T 199] VVK	0	1	2
GTELDQTHL [p S 198] [p T 199] VVK	0	8	4
GTELDQTHLSTVVK	46	26	48
Peptídeo Pto 187-202
KGTELDQ [p T 195] HLS TVVK	0	1	0
KGTELDQTHL [p S 198] TVVK	17	17	12
KGTELDQTHLS [p T 199] VVK	4	2	2
KGTELDQ [p T 195] HLS [p T 199] VVK	0	1	1
KGTELDQTHL [p S 198] [p T 199] VVK	0	7	5
KGTELDQTHLSTVVK	21	37	18
Peptídeos 187-202 e 188-202	83	88	50
Percentagem de péptidos com dois eventos de fosforilação	0%	26,9%	11,2%
Pto Sequence Cobertura	78%	79%	82%

Tabela 1 fosforilação dobro de um peptídeo Pto após a ativação da sinalização: 35S. Prf. 3xHA e-35S: Pto-FLAG foram transitoriamente expressa juntamente com emvetor pta (EV), 35S: AvrPto ou 35S: AvrPtoB em N. benthamiana. Três dias após a infiltração da quantidade total de proteína Pto-FLAG foi imunoprecipitou usando matriz de afinidade anti-FLAG e resolvidas em SDS-PAGE. As bandas visíveis de Pto na Coomassie brilhante gel manchado azul coloidal foram excisadas e analisadas com espectrometria de massa. É indicado o número de peptídeos Pto identificados com 0, 1 e 2 eventos de fosforilação.

Tabela de buffers
Médio L	Tryptone	10 g / L
	O extrato de levedura	5 g / L
	NaCl	5 g / L
	D-glicose	1 g / L
Agro-tampão infiltração	MgCl2	10 mM
	MES	10 mM
	Ajustar a pH 5,5
	Acetoseringona (opcional)	150 uM
Tampão A	Tris-HCl pH 7,5	150 mM
	NaCl	150 mM
	EDTA	5 mM
	EGTA	2 mM
	Glicerina	5% (v / v)
Tampão B	Tampão A
	PVPP	2% (w / v)
Tampão C	Tampão B
	Dithiothreitol (DTT)	10 mM
	Planta de Inibidor de Protease Cocktail	1% (v / v)
	Fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF)	0,5 mM
	A caliculina	50 nM
	Fluoreto de sódio (NaF)	50 mM
	Molibdato de sódio (Na 2 MoO 4)	10 mM
	Ortovanadato de sódio	1 mM
	Ácido Okadaic	100 nM
Tampão D	Tampão C sem PVPP
5x tampão de carga de SDS-PAGE	Tris-HCl pH 6,8	60 mM
	SDS	2%
	Glicerina	0,15%
	Azul de bromofenol	0,10%
	DTT (adicionar imediatamente antes da utilização)	50 mM

Tabela 2. Buffer e receitas de mídia.

Discussão

Elucidar o mecanismo de ativação do receptor por PAMPs e processadores de efeitos pode contribuir muito para a nossa compreensão da imunidade da planta. Nos últimos 20 anos, as telas de dois híbridos genéticos e leveduras têm sido fundamentais para a descoberta de PRRs e proteínas NB-LRR. Mais recentemente, foram estabelecidos protocolos baseados em espectrometria de massa para a identificação de proteínas diferencialmente regulados durante imunológico sinalização ^55-58, suas PTMs ^11,33,59,60, a composição dos complexos imunes efetoras ⁶¹ e tem como alvo ^62. Aqui, descrevemos um protocolo simples para a identificação de PTMs que regulam a activação dos complexos imunes.

Em comparação com os protocolos descritos anteriormente, este protocolo permite a identificação detalhada das mudanças dinâmicas de PTMs. Protocolos de abordagens proteômicas em larga escala pode identificar PTMs de proteínas, mas não são capazes de revelar a plasticidade local de PTMs devido ao limiteed quantidades de proteína. No caso de fosforilação da proteína em larga escala proteómica abordagens tipicamente apenas identificar os locais de fosforilação predominantes ^11,33,59. A caracterização detalhada de um estado de fosforilação de proteínas requer uma quantidade substancial de proteína que pode ser obtida por meio de purificação parcial da proteína alvo ^47. O protocolo aqui descrito casais uma abordagem de purificação de proteína que gera uma quantidade substancial da proteína alvo, com a análise de espectrometria de massa de proteína purificada. Seguindo esse protocolo, o evento fosforilação único de Pto foi atribuído principalmente a Ser-198, como descrito anteriormente ⁵² mas alguns espectros de espectrometria de massa também apoiou um único evento de fosforilação em Tre-195 ou Tre-199. Quando foram observados eventos de fosforilação duplas de Pto, a combinação predominante de aminoácidos fosforilados foi Ser-198 e Thr-199 embora também se observou combinações de outros sites (Tabela 1). Estes resultados demonstram claramente a plasticidade local de fosforilação de proteína-quinases e a capacidade de o protocolo descrito em detalhes para caracterizar todos os possíveis locais de fosforilação.

Os passos mais críticos deste protocolo são: 1) a extração suficiente de proteínas, 2) protecção de PTMs, e 3) uma quantidade suficiente de proteína alvo. Em primeiro lugar, para a extracção suficiente de proteínas, é importante para moer o tecido em azoto líquido e subsequentemente para usar um homogeneizador de tecido, tal como descrito no protocolo. Se um homogeneizador de tecido não está disponível, um almofariz e pilão pode ser usado. É também importante a utilização de uma proporção de 02:59 (ou quatro) de gramas de tecido de volume de tampão de extracção. Este tecido para tampão rácio e o tampão de elevada força que sugerimos que irá assegurar que o pH vai ficar neutro, durante o processo de extracção. Descobrimos que isso é de particular importância para A. thaliana e tomate adicionalCÇÕES ^52. Protecção de PTMs pode ser conseguido através da inclusão de todos os tampões adequados os inibidores de enzimas que podem remover PTMs. Também é crítico para executar todas as etapas, a 4 ° C e a prechill tampões e instrumentos. Rendimentos mais altos de proteína alvo pode ser conseguida através da utilização de plantas que expressam a proteína em quantidades suficientes e de utilizar grandes quantidades de tecido (aproximadamente 20 g). O passo mais importante para a obtenção de uma quantidade suficiente de proteína alvo é concentrar a proteína alvo por imunoprecipitação direta. A importância deste passo é destacado por nossa incapacidade de identificar PTMs de Pto após uma imunoprecipitação Prf devido à quantidade limitada de coimmunoprecipitated Pto (Figura 2B). Em contraste, a imunoprecipitação directa de Pto produziram péptidos substancialmente mais mensuráveis ​​(Figura 2C), que conduzem a uma cobertura de aproximadamente 80% da sequência da proteína e a identificação de PTMs (Tabela 1). Também ruarongly recomendam o uso de epítopos-tags para imunoprecipitação de proteínas. Em comparação com os anticorpos produzidos contra as proteínas da matriz de epitopo-tags de afinidade nativa podem produzir quantidades mais elevadas de proteína parcialmente purificada. Ao utilizar um anticorpo criado contra a proteína nativa Pto ⁵¹ (Figura 2A) para imunoprecipitação, fomos capazes de identificar apenas fosforilação único dos dois locais de fosforilação predominantes de Pto.

Este protocolo foi principalmente desenvolvido para a purificação parcial de N. benthamiana proteína citoplasmática e subsequente identificação dos seus sítios de fosforilação. No entanto, usando as modificações aqui descritas, este protocolo pode ser facilmente adaptado para a A. thaliana proteínas e proteínas de membrana ligada. O principal objectivo do presente protocolo é a produzir quantidades suficientes da proteína alvo para a identificação de PTMs e não para atingir a maior pureza do complexo. Se maior purezado complexo é necessário um segundo passo de purificação pode ser adicionado a este protocolo ^52. Neste caso, um primeiro passo irá permitir a eluição da proteína alvo a partir da matriz de afinidade, sem o uso de sais de ácido e elevadas ou o passo subsequente pode implicar uma matriz, o que requer condições de eluição duras. É importante destacar que só testei este protocolo para a identificação de sítios de fosforilação e que estamos atualmente testando a sua capacidade para a identificação detalhada de PTMs adicionais.

Os nossos resultados demonstram claramente representativos da plasticidade local de fosforilação de proteína-quinases e a capacidade de o protocolo descrito para caracterizar locais de fosforilação. Mais importante, eles destacam que a identificação de sítios de fosforilação que confiam em baixa quantidade de proteínas por espectrometria de massa e por mutações de um único ponto de sites auto-fosforilação pode dar resultados confusos. Mostramos aqui e anteriormente ⁴⁷ Que a dupla fosforilação de Pto em Ser-198 e Thr-199 está associada com a ativação do complexo Prf / Pto. Em contraste, os resultados anteriormente publicados ^47,63 mostraram que as mutações pontuais individuais de Ser-198 e Thr-199 para alanina, o que impede a fosforilação destes locais, são capazes de sinalização, sugerindo que a fosforilação destes locais é não um pré-requisito para a activação complexo . Estes resultados podem ser explicados por fosforilação do local secundário Thr-195. Visão semelhante à plasticidade local de fosforilação da outra proteína quinase pode ser obtido seguindo este protocolo. Além disso, uma abordagem combinada utilizando sítios de fosforilação mutações pontuais, as proteínas que podem inibir quinases específicas (efetoras) juntamente com a imunoprecipitação da proteína e análise por espectrometria de massa irá conduzir a uma melhor compreensão do significado evolutivo da plasticidade local de fosforilação de proteína-quinases.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
MgCl2	Sigma	M8266
MES	Sigma	M8250
Acetosiringona	Sigma	D134406	tóxico - estoque de 1 M em
seringa DMSO 1 ml de agulha de	seringa Terumo
		NN-2525R
Silwet L-77 (surfactante)	Lehle Seeds	VIS-01	tóxico
MG-132 (Z-Leu-Leu-Leu-al)	Sigma	C2211	1 M estoque em DMSO, armazene a -80 ° C
MS sais	Sigma	M5524	oxidantes, tóxicos
Sacarose	Sigma	16104
Base Trizma	Sigma	T1503	ajustar o pH com 1 N HCl para fazer 1 M Tris-HCl tampão
NaCl	Sigma	S3014	5 M estoque
EDTA	Sigma	E6758	tóxico - 0,5 M estoque
EGTA	Sigma	E4378
Glicerol	National Diagnostics	EC-606
IGEPAL CA-630	Sigma	I8896	PVPP corrosivo
(polivinilpolipirrolidona)	Sigma	P5288	não confunda com PVP
DTT (DL-ditiotreitol)	Sigma	43815	tóxico - estoque de 1 M, armazene a -20 ° C
Coquetel de inibidor de protease vegetal	Sigma	P9599	não congele / descongele muitas vezes
PMSF (fluoreto de fenilmetilsulfonil)	Sigma	P7626	corrosivo, tóxico
Caliculina A	Tecnologia de Sinalização Celular	9902
Fluoreto de Sódio (NaF)	Sigma	S7920	tóxico - estoque de 1 M
Molibdato de sódio (Na2MoO4)	Sigma	S6646	0,5 M estoque
Ortovanadato de sódio (Na3VO4)	Sigma	450243	tóxico - Prepare uma solução 200 mM de ortovanadato de sódio. Ajuste o pH para 10,0 usando 1 N NaOH ou 1 N HCl. O pH inicial da solução de ortovanadato de sódio pode variar com lotes do produto químico. Em pH 10,0, a solução será amarela. Ferva a solução até ficar incolor (aproximadamente 10 min). Resfrie à temperatura ambiente. Reajuste o pH para 10,0 e repita as etapas 3 e 4 até que a solução permaneça incolor e o pH se estabilize em 10,0.
Ácido ocadaico	Santa Cruz Biotechnology	sc-3513
Kinematica Polytron homogeneizador de tecidos	Fisher Scientific	08-451-320
Miracloth	Merck Millipore	475855-1R
anti-FLAG M2 agarose	Sigma	A2220	esta matriz é recomendada
Streptavidin-agarose	Thermo-Scientific	20347	esta matriz é recomendada
GFP-Trap_A	Chromotek	gta-20	esta matriz é recomendada
Anti-HA-Agarose	Sigma	A2095	esta matriz é recomendada
0,45 μ Filtro m	VWR	513-1902
BSA	Sigma	A7906
FLAG peptídeo	Sigma	F3290
D-biotina	Sigma	47868
Resina StrataClean		Agilent 400714	esta resina de absorção é recomendada para precipitação de proteínas
Mini-PROTEAN Tetra Cell	Biorad
PROTEAN II XL Cell	Biorad
SimplyBlue SafeStain	Invitrogen	LC6060	esta coloração é recomendada
Tubos de proteína de baixa ligação (LoBind)	Eppendorf	0030 108.116	estes tubos são recomendados
Bicarbonato de amônio (ABC)	Sigma	9830	tóxico
Acetonitrila	VWR	83639	tóxico, inflamável
2-cloroacetamida	Sigma	22790	tóxico
Tripsina	Promega	V5280	irritante, sensibilizante
Ácido fórmico	Sigma	14265	tóxico, corrosivo
Sonicador em banho-maria	Ultravawe	Ultra BT Banho
LTQ-Orbitrap XL	Tricostatina termocientífica
A	Sigma	T8552	tóxico