Baseada em células de Citometria de Fluxo Ensaio medir citotóxicos Atividade

Resumo

Este protocolo descreve um ensaio de citotoxicidade sensível baseado em células. Ao enumerar a diminuição na frequência de células T CD4+ alvo vivas na presença de um número crescente de células T CD8+ efetoras, este ensaio permite a avaliação direta da atividade citolítica de células T CD8+ específicas do antígeno.

Resumo

A atividade citolítica das células T CD8+ raramente é avaliada. Descrevemos aqui um novo ensaio baseado em células para medir a capacidade das células T CD8 + específicas do antígeno de matar células T CD4 + carregadas com seu peptídeo cognato. As células T CD4+ alvo são divididas em duas populações, marcadas com duas concentrações diferentes de CFSE. Uma população é pulsada com o peptídeo de interesse (CFSE-baixo), enquanto a outra permanece não pulsada (CFSE-alto). As células T CD4+ pulsadas e não pulsadas são misturadas em uma proporção igual e incubadas com um número crescente de células T CD8+ purificadas. A morte específica de células T CD4+ alvo autólogas é analisada por citometria de fluxo após cocultura com células T CD8+ contendo as células T CD8+ efetoras específicas do antígeno detectadas pela coloração de tetrâmero peptídeo/MHCI. A lise específica de células T CD4+ alvo medidas em diferentes razões efetor versus alvo permite o cálculo de unidades líticas, LU₃₀/10⁶ células. Este ensaio simples e direto permite a medição precisa da capacidade intrínseca das células T CD8+ de matar as células T CD4+ alvo.

Introdução

A atividade citolítica é a principal função das células T CD8+, mas ainda é raramente medida, pois os ensaios usados para esse fim são complicados e difíceis de padronizar. A medição precisa dessa função é de suma importância na caracterização das funções efetoras das células T CD8+, pois ainda não foram descritos preditores confiáveis de citotoxicidade efetiva mediada por células^1,2. Aqui, propomos um novo ensaio funcional para medir a atividade citotóxica de células T CD8+ específicas do antígeno em células T CD4+ alvo. Várias abordagens foram desenvolvidas para fornecer alternativas ao ensaio de liberação de cromo padrão-ouro. Apresentamos aqui um ensaio....

Protocolo

1. Preparação de células T CD8+ efetoras

1. Descongele PBMCs criopreservadas autólogas (2-3 frascos de 50 x 10⁶ células) transferindo o criovial de nitrogênio líquido para um banho-maria a 37 ° C.
2. Lave as células enchendo o tubo a 50 ml com RPMI completo (4 mM de L-glutamina e 100 U / ml de penicilina e estreptomicina, suplementado com 10% de FBS). Contar PBMCs e ressuspender células a uma concentração de 5 x 10⁶/ml em RPMI completo.
3. Adicione peptídeo específico (5 μg / ml) e IL-2 (10 ng / ml) aos PBMCs.
4. Estabelecer a cultura em placa de 96 poços profundos; semear 1 ml de suspensão celular em cada poço.
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Resultados

O esquema na Figura 1 resume o ensaio. Células T CD8+ purificadas (células efetoras) foram ressuspendidas em 450 µl de RPMI completo e diluições seriadas foram realizadas adicionando-se 225 µl de células T CD8+ ao próximo tubo contendo 225 µl de meio (painel superior). Células T CD4+ purificadas (células-alvo) foram contadas, divididas em dois tubos e marcadas com duas concentrações diferentes de CFSE (alta e baixa), conforme descrito no protocolo. As células T CD4+ com baixa marcação por CFSE foram sens.......

Discussão

O ensaio aqui descrito permite quantificar a principal função das células T CD8+: a atividade citolítica. A mensuração precisa dessa função é de suma importância na caracterização das funções efetoras das células T CD8+, pois estudos anteriores relataram discordância entre essa função e a secreção de citocinas das células T CD8+ antígeno-específicas^10,11. Devido ao curto tempo de incubação da cocultura (6 horas) e ao uso de células-alvo autólogas, há baixa taxa de morte inespecífica das células-alvo. Este ensa.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Kit de Enriquecimento de Células T CD4+ Humanas EasySep	Células-Tronco	19052
Kit de Enriquecimento de Células T CD8+ Humanas EasySep	Células-Tronco	19053
Kit de Proliferação de Células CellTrace CFSE - Para Citometria de Fluxo	Invitrogen	C34554
Far Red LIVE/DEAD fixável dead cell	Invitrogen	L10120
Alexa Fluor 700 Mouse Anti-Human CD3	BD
Anticorpo Anti-CD4 Humano Violeta Brilhante 650	Biolegend	317435
PerCP Anticorpo CD8 Anti-humano	Biolegend	344707
RPMI 1640 Médio 1x	VWR	10-040-CV
Penicilina-Estreptomicina 100x Solução	Invitrogen	15070063
Soro Fetal Bovino - Ouro, PAA Inativado por Calor		A15-252
Placas de 96 poços; Tratado; Fundo em U; com tampa	BD Falcon	353077
25 ml de poliestireno estéril, reservatórios embalados individualmente	USA Scientific	2321-2230
96 poços estéreis com fundo em U, placas estéreis de 2 ml de poços profundos	Thermo Scientific	275743
Human IL-2 (v126), grau de pesquisa	Miltenyi Biotec	130-093-096
RoboSep Buffer, tampão de separação	Células-tronco	20104
Tubo cônico de polipropileno de 15 ml	BD Falcon	352097
tubo inferior redondo de 14 ml, polipropileno	BD Falcon	352059
The Big Easy EasySep Magnet	Stem	cell 18001
PBS 1x	VWR	21-040-CV
96 poços; Placa de fundo em V com tampa	Fisher	12-565-481
Solução de formaldeído, reagente ACS, 37% em peso em H2O	Sigma-Aldrich	252549-500ML
Microtubo de tampa de rosca de 1,5 ml, cônico	Sarstedt	72.692.005

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