Artigo de método

Baseada em células de Citometria de Fluxo Ensaio medir citotóxicos Atividade

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DOI:

10.3791/51105

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17 de dezembro de 2013

 ,  , 
1Vaccine and Gene Therapy Institute of Florida

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve um ensaio de citotoxicidade sensível baseado em células. Ao enumerar a diminuição na frequência de células T CD4+ alvo vivas na presença de um número crescente de células T CD8+ efetoras, este ensaio permite a avaliação direta da atividade citolítica de células T CD8+ específicas do antígeno.

Resumo

A atividade citolítica das células T CD8+ raramente é avaliada. Descrevemos aqui um novo ensaio baseado em células para medir a capacidade das células T CD8 + específicas do antígeno de matar células T CD4 + carregadas com seu peptídeo cognato. As células T CD4+ alvo são divididas em duas populações, marcadas com duas concentrações diferentes de CFSE. Uma população é pulsada com o peptídeo de interesse (CFSE-baixo), enquanto a outra permanece não pulsada (CFSE-alto). As células T CD4+ pulsadas e não pulsadas são misturadas em uma proporção igual e incubadas com um número crescente de células T CD8+ purificadas. A morte específica de células T CD4+ alvo autólogas é analisada por citometria de fluxo após cocultura com células T CD8+ contendo as células T CD8+ efetoras específicas do antígeno detectadas pela coloração de tetrâmero peptídeo/MHCI. A lise específica de células T CD4+ alvo medidas em diferentes razões efetor versus alvo permite o cálculo de unidades líticas, LU30/106 células. Este ensaio simples e direto permite a medição precisa da capacidade intrínseca das células T CD8+ de matar as células T CD4+ alvo.

Introdução

A atividade citolítica é a principal função das células T CD8+, mas ainda é raramente medida, pois os ensaios usados para esse fim são complicados e difíceis de padronizar. A medição precisa dessa função é de suma importância na caracterização das funções efetoras das células T CD8+, pois ainda não foram descritos preditores confiáveis de citotoxicidade efetiva mediada por células1,2. Aqui, propomos um novo ensaio funcional para medir a atividade citotóxica de células T CD8+ específicas do antígeno em células T CD4+ alvo. Várias abordagens foram desenvolvidas para fornecer alternativas ao ensaio de liberação de cromo padrão-ouro. Apresentamos aqui um ensaio baseado em células que revela todo o processo de matança ao medir a morte de células-alvo vivas. Este método foi derivado de protocolos de ensaios citotóxicos baseados em citometria de fluxo in vivo em camundongos4,5 e in vitro em humanos6. Neste protocolo, as células T CD8+ específicas do antígeno contidas na população total de células T CD8+ são usadas como células efetoras e as células T CD4+ autólogas são usadas como células-alvo. As células T CD8+ efetoras de interesse são enumeradas usando tetrâmeros MHCI/peptídeos7. A morte das células-alvo é calculada pela razão entre as células T CD4+ carregadas/não carregadas com peptídeos. Mostramos anteriormente que esse método era reprodutível, sensível, específico e não dependia do número de células efetoras dentro da população total de células T CD8+8. Ao enumerar o número de células efetoras e alvo no ensaio de cocultura, a capacidade intrínseca das células T CD8+ de matar células-alvo pode ser calculada e expressa em unidades líticas9.

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Protocolo

1. Preparação de células T CD8+ efetoras

  1. Descongele PBMCs criopreservadas autólogas (2-3 frascos de 50 x 106 células) transferindo o criovial de nitrogênio líquido para um banho-maria a 37 ° C.
  2. Lave as células enchendo o tubo a 50 ml com RPMI completo (4 mM de L-glutamina e 100 U / ml de penicilina e estreptomicina, suplementado com 10% de FBS). Contar PBMCs e ressuspender células a uma concentração de 5 x 106/ml em RPMI completo.
  3. Adicione peptídeo específico (5 μg / ml) e IL-2 (10 ng / ml) aos PBMCs.
  4. Estabelecer a cultura em placa de 96 poços profundos; semear 1 ml de suspensão celular em cada poço.
  5. Após 3 dias de cultura, substitua metade do meio de cultura celular por RPMI completo fresco.
  6. Após 6 dias de cultura, coletar todos os PBMCs com pipeta multicanal e transferir células em reservatório estéril.
  7. Contar, lavar e ressuspender PBMCs a 5 x 107/ml no tampão de separação recomendado em tubos de fundo redondo de 14 ml. Adicionar o cocktail de enriquecimento de células T CD8+ humanas a 50 μl/ml de células. Misture e incube em temperatura ambiente por 10 min. Adicionar partículas magnéticas a 150 μl/ml e incubar durante 5 min.
  8. Aumente a suspensão celular até 7 ml adicionando o tampão de separação. Proceda ao isolamento imunomagnético da célula T CD8+ intocada, colocando o tubo no ímã. Após 5 min, com o tubo ainda no ímã, despeje as células de interesse em um novo tubo cônico de 15 ml. Pegue uma pequena alíquota e core as células com anticorpos contra CD3 e CD8 em 1X PBS-2% FBS por 30 min a 4 ° C. A pureza das células T CD8+ pode então ser medida por citometria de fluxo com uma pureza esperada de 95% ou superior.
  9. Ressuspenda as células T CD8+ em 450 μl com RPMI completo.
  10. Adicione 225 μl de RPMI completo em 5 tubos com tampa de rosca.
  11. Preparar diluições seriadas (de 1:2 a 1:32) transferindo 225 μl de CD8+ para o tubo seguinte (ver figura 1 painel superior).

2. Preparação de células T CD4+ alvo

  1. Descongelar PBMCs criopreservadas autólogas (1 frasco para injetáveis de 50 x 106 células) transferindo o criogenio do nitrogênio líquido para um banho-maria a 37 °C.
  2. Transferir a suspensão celular para um tubo cónico de 50 ml contendo 10 ml de RPMI.
  3. Lave as células e ressuspenda PBMCs a 5 x 107 / ml com tampão de separação em tubos de fundo redondo de 14 ml. Adicionar o cocktail de enriquecimento de células T CD4+ humanas a 50 μl/ml de células. Misture e incube em temperatura ambiente por 10 min. Adicione partículas magnéticas a 100 μl/ml e incube por 5 min à temperatura ambiente.
  4. Aumente a suspensão celular até 7 ml adicionando tampão de separação. Proceda ao isolamento das células T CD4+ colocando o tubo no ímã. Após 5 min, com o tubo ainda dentro do ímã, despeje as células desejadas em um novo tubo cônico de 15 ml. Pegue uma pequena alíquota e core as células com anticorpos contra CD3 e CD4 em 1x PBS-2% FBS por 30 min a 4 ° C. A pureza das células T CD4+ pode então ser medida por citometria de fluxo com uma pureza esperada de 95% ou superior.
  5. Conte as células T CD4 +, divida-as em dois tubos cônicos de 15 ml e lave em 1x PBS morno.
  6. Prepare uma solução de trabalho de 0,4 μM de alta CFSE em PBS quente.
  7. Prepare uma solução de trabalho de baixo CFSE de 0,04 μM diluindo uma porção da solução de trabalho de alto CFSE 10x em PBS quente.
  8. Ressuspenda as células a 20 x 106 / ml de PBS (se o número de células T CD4 + for menor que 10 x 106 / ml, ressuspenda as células em 0,5 ml de PBS) e core metade das células T CD4 + adicionando um volume igual de 0,4 μM de solução de trabalho alta CFSE (concentração final de 0,2 μM). Por exemplo, para 1 ml de células, adicione 1 ml da solução de trabalho CFSE. Manchar a metade restante do CD4 + adicionando um volume igual de 0,04 μM de solução de trabalho CFSE baixa (concentração final de 0,02 μM). Corar as células por 15 min a 37 ° C em atmosfera de 5% de CO2.
  9. Após a incubação, pellet cells a 1.500 rpm por 5 min e ressuspende em 1 ml de RPMI completo quente para extinguir a reação de marcação.
  10. Pulsar células T CD4+ com baixo teor de CFSE adicionando o peptídeo de interesse a uma concentração final de 5 μg/ml no RPMI completo e incubar por 45 min em atmosfera de CO5% 2 a 37 °C.
  11. Lave as células T CD4 + com CFSE alto e baixo CFSE em RPMI completo. Repita para um total de duas lavagens. Ressuspender a uma concentração de 2 x 105 células/ml cada em RPMI completo.
  12. Misture as duas populações-alvo em uma proporção de 1:1 (CFSE-High:CFSE-Low) (consulte a Figura 1 no painel inferior).

3. Cocultura

  1. De cada diluição de células T CD8+, semeie 100 μl em duplicata para uma placa de 96 poços de fundo redondo.
  2. Adicionar as células T CD4+ alvo mistas (100 μl) a cada diluição de células efetoras, perfazendo um volume final de 200 μl.
  3. Para medir a apoptose basal, semeie 3 poços apenas com células-alvo.
  4. Incubar a cocultura por 6 horas em atmosfera de 5% de CO2 a 37 ° C.

4. Coloração e Aquisição por Citometria de Fluxo

  1. Transfira as células para uma placa de 96 poços com fundo em V e cove com tetrâmeros pMHC conjugados com PE por 15 min em atmosfera de CO5% 2 a 37 ° C.
  2. Lave em 1x PBS-2% FBS e core as células com célula morta corrigível Far Red LIVE/DEAD, αCD3-Alexa700, αCD8-Percp, αCD4-Brilliant Violet 650 por 30 min a 4 °C, protegida da luz.
  3. Lave as células uma vez com 1x PBS-2% FBS e ressuspenda em 100 μl com formaldeído a 2% em 1x PBS.
  4. Adquira células no citômetro de fluxo.

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Resultados

O esquema na Figura 1 resume o ensaio. Células T CD8+ purificadas (células efetoras) foram ressuspendidas em 450 µl de RPMI completo e diluições seriadas foram realizadas adicionando-se 225 µl de células T CD8+ ao próximo tubo contendo 225 µl de meio (painel superior). Células T CD4+ purificadas (células-alvo) foram contadas, divididas em dois tubos e marcadas com duas concentrações diferentes de CFSE (alta e baixa), conforme descrito no protocolo. As células T CD4+ com baixa marcação por CFSE foram sens...

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Discussão

O ensaio aqui descrito permite quantificar a principal função das células T CD8+: a atividade citolítica. A mensuração precisa dessa função é de suma importância na caracterização das funções efetoras das células T CD8+, pois estudos anteriores relataram discordância entre essa função e a secreção de citocinas das células T CD8+ antígeno-específicas10,11. Devido ao curto tempo de incubação da cocultura (6 horas) e ao uso de células-alvo autólogas, há baixa taxa de morte inespecífica das células-alvo. Este ensa...

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Divulgações

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelo Escritório de Turismo, Comércio e Desenvolvimento Econômico da Flórida.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Kit de Enriquecimento de Células T CD4+ Humanas EasySepCélulas-Tronco19052
Kit de Enriquecimento de Células T CD8+ Humanas EasySepCélulas-Tronco19053
Kit de Proliferação de Células CellTrace CFSE - Para Citometria de FluxoInvitrogenC34554
Far Red LIVE/DEAD fixável dead cellInvitrogenL10120
Alexa Fluor 700 Mouse Anti-Human CD3BD
Anticorpo Anti-CD4 Humano Violeta Brilhante 650Biolegend317435
PerCP Anticorpo CD8 Anti-humanoBiolegend344707
RPMI 1640 Médio 1xVWR10-040-CV
Penicilina-Estreptomicina 100x SoluçãoInvitrogen15070063
Soro Fetal Bovino - Ouro, PAA Inativado por CalorA15-252
Placas de 96 poços; Tratado; Fundo em U; com tampaBD Falcon353077
25 ml de poliestireno estéril, reservatórios embalados individualmenteUSA Scientific2321-2230
96 poços estéreis com fundo em U, placas estéreis de 2 ml de poços profundosThermo Scientific275743
Human IL-2 (v126), grau de pesquisaMiltenyi Biotec130-093-096
RoboSep Buffer, tampão de separaçãoCélulas-tronco20104
Tubo cônico de polipropileno de 15 mlBD Falcon352097
tubo inferior redondo de 14 ml, polipropilenoBD Falcon352059
The Big Easy EasySep MagnetStemcell 18001
PBS 1xVWR21-040-CV
96 poços; Placa de fundo em V com tampaFisher12-565-481
Solução de formaldeído, reagente ACS, 37% em peso em H2OSigma-Aldrich252549-500ML
Microtubo de tampa de rosca de 1,5 ml, cônicoSarstedt72.692.005
557943

Referências

  1. Appay, V., Van Lier, R. A. W., Sallusto, F., Roederer, M. Cytometry. 73, 975-983 (2008).
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