Medições de microscopia de vídeo intravital do fluxo sanguíneo retiniano em camundongos

Resumo

A microscopia intravital pode ser usada em animais para visualizar e medir diâmetros vasculares da retina, velocidades da corrente sanguínea e fluxo sanguíneo total da retina.

Resumo

Alterações no fluxo sanguíneo da retina podem contribuir ou ser consequência de doenças oculares e disfunções visuais. Portanto, a quantificação da perfusão alterada pode auxiliar na pesquisa dos mecanismos das patologias da retina. A microscopia de vídeo intravital de traçadores fluorescentes pode ser usada para medir os diâmetros vasculares e as velocidades da corrente sanguínea da vasculatura retiniana, especificamente as arteríolas que se ramificam da artéria central da retina e das vênulas que levam à veia central da retina. As taxas de fluxo sanguíneo podem ser calculadas a partir dos diâmetros e velocidades, com a soma do fluxo arteriolar, e separadamente do fluxo venular, fornecendo valores do fluxo sanguíneo retiniano total. Este artigo e o vídeo associado descrevem os métodos para aplicar esta técnica a camundongos, que incluem 1) a preparação do olho para microscopia intravital do animal anestesiado, 2) a infusão intravenosa de microesferas fluorescentes para medir a velocidade da corrente sanguínea, 3) a infusão intravenosa de um dextrano fluorescente de alto peso molecular, para auxiliar a visualização microscópica da microvasculatura da retina, 4) o uso de uma câmera de microscópio digital para obter vídeos da retina perfundida e 5) o uso de software de processamento de imagem para analisar o vídeo. As mesmas técnicas podem ser usadas para medir as taxas de fluxo sanguíneo da retina em ratos.

Introdução

A retina é um dos tecidos mais metabolicamente ativos do corpo e, consequentemente, requer um suprimento sanguíneo generoso. Duas circulações separadas atendem a essa demanda: a circulação coroidal para a porção externa da retina e a circulação retiniana para a porção interna da retina. As investigações da perfusão retiniana são imperativas para a compreensão dos mecanismos patológicos e consequências da retinopatia diabética, retinopatia induzida por oxigênio, oclusão da artéria ou veia retiniana e acidente vascular cerebral. Vários métodos têm sido empregados para quantificar o fluxo sanguíneo retiniano, com cada técnica tendo suas vantagens, desvantagens, limitações e suposições. Entre essas técnicas estão a infusão de microesferas de 7-8 μm de diâmetro que se alojam em arteríolas pré-capilares^1,2, a autorradiografia quantitativa^3,4, a microangiopatia óptica-tomografia de coerência óptica^5,6, a ressonância magnética^7,8 e a videomicroscopia intravital^9-16. As vantagens deste último incluem visualização direta ao vivo dos vasos e fluxo da retina, dependência de apenas algumas suposições menores e acessibilidade para laboratórios com microscópio de fluorescência com câmera de vídeo acoplada. Em estudos anteriores de microscopia de vídeo intravital^9-16, o dextrano fluorescente foi usado como marcador plasmático, e os glóbulos vermelhos marcados com fluorescência (de um animal doador) foram usados como marcadores de velocidade. No protocolo atual, microesferas marcadas com fluorescência de 1,9 μm de diâmetro, em vez de glóbulos vermelhos, são usadas para medir a velocidade, com essa alteração negando a necessidade de um doador de células sanguíneas.

Protocolo

Os procedimentos que envolvem o uso de animais foram revisados e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do LSUHSC-S e realizados de acordo com os critérios traçados pelos Institutos Nacionais de Saúde.

1. Preparação de soluções de perfusão

1. Sonicar uma solução de estoque a 1% (em peso) de microesferas de 1,9 μm de diâmetro.
2. Retire ~ 25-30 x 10⁶ microesferas fluorescentes verdes (ou seja, ~ 10 μl da solução estoque) em uma seringa de 300 μl. Dilua as microesferas retirando mais 240 μl de solução salina para a seringa.
3. Preparar uma solução de 50 μl de dextrano fluorescente de 2 x 10⁶ peso molecular dissolvido em solução salina estéril, com a dose injectada no intervalo de 3-10 mg/kg. Mantenha o dextrano coberto com papel alumínio até a hora de sua infusão.

2. Anestesia Animal e Canulação Vascular

1. Anestesiar o animal para inserção cirúrgica de cânulas vasculares e para posicionamento estacionário sob uma objetiva microscópica. Muitas opções de protocolos anestésicos estão disponíveis, com várias vantagens e desvantagens e efeitos potenciais nos parâmetros sistêmicos. Entre as muitas opções diferentes estão uma combinação de cetamina (100-150 mg/kg), xilazina (10 mg/kg) e acepromazina (2 mg/kg), ou uma combinação de cetamina (50 mg/kg) e pentobarbital (50 mg/kg). Os procedimentos descritos são agudos e concluem com a eutanásia induzida por uma overdose de pentobarbital (150 mg/kg) seguida de uma toracotomia; A inclusão de um analgésico não é necessária para o procedimento terminal.
2. Mantenha uma almofada de aquecimento embaixo do animal pelo restante do experimento.
3. Mantenha os olhos úmidos com solução salina tamponada com fosfato durante as inserções cirúrgicas subsequentes de cânulas vasculares.
4. Prepare uma cânula vascular para infusões subsequentes de marcadores fluorescentes. Um tubo de polietileno de 20 cm de comprimento (por exemplo, 0,28 mm de diâmetro interno; 0,61 mm de diâmetro externo) é colocado na ponta de uma agulha de seringa, com a ponta afiada da agulha quebrada de antemão dobrando-se para frente e para trás com um hemostático.
5. Encha uma seringa e um tubo com solução salina heparinizada (25 U / ml).
6. Raspe um lado da parte inferior do abdômen e faça uma incisão para expor a veia femoral.
7. Para canular a veia femoral, amarre o vaso com uma sutura 5.0, faça uma incisão parcial do vaso (aproximadamente metade do diâmetro do vaso) e insira o tubo no vaso, prendendo o tubo com a sutura amarrada ao redor da seção canulada.

3. Preparação para Microscopia Intravital

1. Dilate a pupila do olho com uma gota de solução oftálmica de tropicamida a 1%, seguida de uma gota de solução oftálmica de hipromelose a 2,5%.
2. Cubra o olho com uma lamínula de vidro de 5 mm.
3. Coloque o animal em uma placa de acrílico, que será posicionada embaixo da objetiva do microscópio de um microscópio vertical. Coloque estrategicamente uma gaze cirúrgica embaixo da cabeça para permitir um eixo direto através da objetiva até a retina central e o disco óptico.
4. Focalize através do microscópio no disco óptico, encontrando o disco com uma objetiva de baixa potência 4X e usando um filtro de fluoresceína.

4. Infusão de microesferas fluorescentes para medir velocidades

1. Usando uma objetiva 4X, concentre-se na retina com o disco óptico no centro do campo de visão.
2. Infundir a solução de microesferas fluorescentes a um débito de 250 μl/min/kg.
3. Grave em vídeo a retina visível ao redor do disco óptico, usando um tempo de exposição da câmera de ~ 8 ms.
4. Pare a infusão de microesferas quando uma duração suficiente de vídeo tiver sido gravada (1-2 min); alguma solução de microesfera provavelmente permanecerá sem uso.

5. Infusão de um marcador de plasma fluorescente para medir diâmetros

1. Usando uma objetiva 4X, concentre-se na retina com o disco óptico no centro do campo de visão.
2. Infundir a solução preparada de dextrano fluorescente na veia femoral como um bolus durante ~ 5 segundos, durante a gravação de vídeo. Este vídeo ajudará a determinar a identidade das arteríolas versus vênulas, com as arteríolas sendo perfundidas primeiro. Execute esta etapa com o tempo de exposição da câmera definido para ~8 ms, embora o tempo de exposição preciso não seja crítico.
3. Mude para uma objetiva de 10X e tempo de exposição de 20 a 40 ms para melhorar a resolução para filmar cada uma das 4 a 7 arteríolas e 4 a 7 vênulas na retina superficial. Concentre-se (e grave em vídeo) aproximadamente um quadrante da retina visível de cada vez, com o centro do disco óptico em um canto do campo de visão. Deve-se tentar minimizar o tempo que a luz do microscópio ilumina o tecido para reduzir a possibilidade de fototoxicidade induzida por luz/corante¹⁷.

6. Análise de vídeo

1. Usando uma escala micrométrica, calibre o sistema de vídeo para uma conversão de μm/pixel.
2. Com o software de processamento de imagem, reproduza o vídeo gravado.
3. A partir do vídeo da infusão em bolus de dextrana fluorescente, identifique arteríolas vs vênulas.
4. Para cada uma das 4-7 arteríolas e 4-7 vênulas registradas com a objetiva 10X, meça os diâmetros preenchidos com dextrana fluorescente, calculando a média de 5 medidas de diâmetro por vaso ao longo do comprimento visível.
5. Para cada uma das mesmas arteríolas e vênulas, meça o comprimento da faixa das microesferas fluorescentes, usando 10 faixas de microesferas sucessivas em cada vaso para evitar viés de seleção. Divida os comprimentos das faixas pelo tempo de exposição para calcular a velocidade da microesfera, por exemplo, 160 μm/8 ms = 20 μm/ms = 2 cm/s. Calcule a média de 10 velocidades por embarcação.
6. Calcule a vazão volumétrica para cada vaso com a seguinte equação: vazão = velocidade média × π × diâmetro²/4.
7. Some as taxas de fluxo arteriolar e, separadamente, as taxas de fluxo venular, para obter o fluxo sanguíneo total da retina.

Resultados

Figura 1 mostra quadros individuais de um vídeo de um experimento, com os painéis A-D e F-I exibindo rastros de microesferas fluorescentes capturados com uma objetiva de 4X e tempo de exposição de 8 ms (e binning de 2 x 2 pixels para reduzir o tamanho do arquivo de vídeo). Figura 1E mostra a orientação dos vasos retinianos nos demais painéis da figura.Nem todo quadro do vídeo terá um rastro fluorescente em foco; no entanto, alguns quadros podem apresentar múltiplos rastros para...

Discussão

Esta técnica de microscopia de vídeo intravital pode ser aplicada não apenas em camundongos, mas também em ratos. Este protocolo baseia-se em apenas várias suposições, mas é limitado ao uso sob anestesia e com dilatação da pupila, como descrevemos. As outras suposições e limitações são as seguintes:

1. Suposição de erro mínimo de ampliação óptica resultante da natureza refrativa do olho. Como descrito por outros^18-20, o método de preenchimento do espaço entre a córne...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Microesferas fluorescentes	Bangs Laboratories	FS04F / 10584 (verde)
Sondas moleculares	fluorescentes de dextrano de alto peso molecular	D-7137 (verde); D-7139 (vermelho)
Sistema de microscópio	Nikon	Eclipse E600FN + acessórios
4X objetiva	Nikon	Plan Fluor 4X	abertura numérica 0.13; distância de trabalho 17.2 mm
10X objetiva	Nikon	Plan 10X	abertura numérica 0.25; distância de trabalho 10.5 mm
Tropicamida solução oftálmica	Bausch Lomb	1% Tropicamida
Solução oftálmica de hipromelose	HUB Pharmaceuticals	2,5% Goniovisc
Software de processamento de imagem	Universidade da Califórnia San Francisco Vale Lab	Micro-Manager
Câmera de vídeo digital para microscopia	Fotometria	CoolSnap ES	Resolução de 1392 x 1040 pixels; tamanho do pixel 6,45 x 6,45 μ m