Isolamento e caracterização funcional de Ventricular Humano cardiomiócitos a partir de amostras cirúrgicas frescos

Summary

O conhecimento atual sobre a base celular de doenças cardíacas se baseia principalmente em estudos em modelos animais. Aqui nós descrevemos e validar um novo método para obter simples cardiomiócitos viáveis ​​a partir de pequenas amostras cirúrgicas do miocárdio ventricular humano. Miócitos ventriculares humanos podem ser usados ​​para estudos eletrofisiológicos e testes de drogas.

Abstract

Cardiomiócitos de corações doentes são submetidos a processos de remodelação complexas que envolvem mudanças na estrutura celular, acoplamento excitação contração e correntes de íons de membrana. Essas mudanças tendem a ser responsáveis ​​pelo aumento do risco arritmogênica e as alterações contráteis levando à disfunção sistólica e diastólica em pacientes cardíacos. No entanto, a maior parte da informação sobre as alterações da função dos miócitos em doenças cardíacas veio a partir de modelos animais.

Aqui vamos descrever e validar um protocolo para isolar miócitos viáveis ​​a partir de pequenas amostras cirúrgicas do miocárdio ventricular de pacientes submetidos a operações de cirurgia cardíaca. O protocolo está descrito em detalhe. Medições de cálcio e eletrofisiológicos intracelulares são relatados para demonstrar a viabilidade de uma série de medições de células individuais em cardiomiócitos ventriculares humanos obtidos com este método.

O protocolo relatado elere pode ser útil para futuras investigações de base celular e molecular das alterações funcionais do coração humano, na presença de doenças cardíacas diferentes. Além disso, este método pode ser utilizado para identificar novos alvos terapêuticos a nível celular e para testar a eficácia de novos compostos em cardiomiócitos humanos, com valor de translação directa.

Introduction

Dissecção das propriedades eletrofisiológicas do miocárdio progrediu acentuadamente após o desenvolvimento de técnicas para o isolamento individual dos miócitos cardíacos. Os recentes avanços na compreensão da excitação cardíaca Contração Coupling (EC-acoplamento) também têm sido possível graças à capacidade de isolar cardiomiócitos únicos viáveis ​​que conservam todas as propriedades fisiológicas do tecido intacto. Métodos de patch clamp são rotineiramente utilizados para estudar a função e modulação farmacológica de correntes iônicas sarcolemais cardíaca. Gravações da dinâmica de cálcio intracelular com Ca ^{2 +} corantes sensíveis também são realizados reg....

Protocol

Os protocolos experimentais sobre o tecido humano foram aprovados pelo comitê de ética do Careggi Hospital Universitário (2006/0024713; renovada Maio de 2009). Cada paciente deu consentimento informado por escrito.

1. Soluções e Equipamentos Preparação

As soluções são descritas na Tabela 1. Um fluxograma simplificado do processo de isolamento de células encontra-se na Figura 1.

Solução

CP

DB

KB

Tuberculose

PS

EB1

EB2

Results

O método descrito acima foi utilizado para caracterizar as anormalidades funcionais de cardiomiócitos isolados do septo interventricular de pacientes com cardiomiopatia hipertrófica (CMH) que se submeteram à operação miectomia, em comparação com pacientes não falhando não hipertróficas cirúrgicos ^21. Os resultados contidos nesta secção são derivados de trabalho ²¹ e que são mostrados aqui como um exemplo de como esta técnica pode ser utilizada para caracterizar as alterações da função das células d.......

Discussion

Nós descrevemos e validado um método para isolar os miócitos viáveis ​​a partir de amostras cirúrgicas do miocárdio ventricular humano. A partir de protocolos descritos anteriormente que tinham sido usados ​​com sucesso para células isoladas a partir de amostras cirúrgicas atriais, a técnica para permitir a separação de miócitos viáveis ​​individuais de miocárdio ventricular doente foi desenvolvido e afinado. Os primeiros relatos mostraram que o isolamento dos cardiomiócitos individuais de pedaços de tecido atrial e ven.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fosfato de potássio monobásico (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P9791
Sulfato de magnésio heptahidratado(MgSO4*7H2O)	Sigma-Aldrich	M1880
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Adenosina	Sigma-Aldrich	A9251
D-(+)-Glicose	Sigma-Aldrich	G8270 Manitol
	Sigma-Aldrich	M4125
Taurina	Sigma-Aldrich	T0625
Hidróxido de potássio (KOH)	Sigma-Aldrich	P5958
Cloreto de sódio (NaCl)	Sigma-Aldrich	S7653
Cloreto de potássio (KCl)	Sigma-Aldrich	P9333
Fosfato de sódio dibásico (Na2HPO4)	Sigma-Aldrich	S7907
Bicarbonato de sódio (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S6297
Bicarbonato de potássio (KHCO3)	Sigma-Aldrich	237205
Piruvato de sódio	Sigma-Aldrich	P2256
2,3-Butanodiona monóxima	Sigma-Aldrich	B0753
hidróxido de sódio(NaOH)	Sigma-Aldrich	S8045 < / a>
L-Ácido glutâmico sal monopotássico monohidratado	Sigma-Aldrich	49601
Ácido pirúvico	Sigma-Aldrich	107360
ácido 3-hidroxibutírico	Sigma-Aldrich	166898
Adenosina 5′-trifosfato sal dipotássico di-hidratado (K2-ATP)	Sigma-Aldrich	A8937
Creatina	Sigma-Aldrich	C0780
Ácido succínico	Sigma-Aldrich	S3674
Etilenoglicol-bis(2-aminoetiléter)-N,N,N′,N′-ácido tetraacético (EGTA)	Sigma-Aldrich	E0396
Albumina do soro bovino	Sigma-Aldrich	A0281
Cloreto de magnésio (MgCl2)	Sigma-Aldrich	M8266
Colagenase de Clostridium histolyticum, Tipo V	Sigma-Aldrich	C9263
Proteinase, Bacteriana, Tipo XXIV	Sigma-Aldrich	P8038
Solução de cloreto de cálcio, ~1 M em H2O	Sigma-Aldrich	21115
Solução de cloreto de cálcio 0,1 M	Sigma-Aldrich	53704
Metanossulfonato de potássio	Sigma-Aldrich	83000
FluoForte Reagente	Enzo Life Sciences	ENZ-52015
Concentrado de carga de potência, 100X	Sistema de	Life Technologies P10020
	Warner Instruments	VC-77SP
Anfotericina B solubilizada	Sigma-Aldrich	A9528
Multiclamp 700B amplificador patch-clamp	Molecular Devices
Digidata 1440A	Molecular Devices
pClamp10.0	Dispositivos Moleculares
	PERSONALIZADO	O	dispositivo é feito sob medida em nosso laboratório usando tubos de plástico, Sylgard fundido e um motor; é descrito em detalhes na Figura 1C-1D e na Figura 7. Podemos fornecer mais detalhes, se solicitado.
Elastômero de silicone para escovas do dispositivo de digestão	Dow Corning	SYLGARD® 184
Motor rotativo de velocidade variável para o dispositivo de digestão	Crouzet	Crouzet 178-4765
Molde para escovas fundidas	N.A.	N.A.	O molde é feito sob medida a partir de hastes padrão de PTFE de 2,5 cm de diâmetro.