Artigo de método

Isolamento e caracterização funcional de Ventricular Humano cardiomiócitos a partir de amostras cirúrgicas frescos

17K vistas

⸱

DOI:

10.3791/51116

⸱

21 de abril de 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department NeuroFarBa, Division of Pharmacology, University of Florence, 2Department of Clinical and Experimental Medicine, Division of Physiology, University of Florence

Neste artigo

Resumo

O conhecimento atual sobre a base celular de doenças cardíacas se baseia principalmente em estudos em modelos animais. Aqui nós descrevemos e validar um novo método para obter simples cardiomiócitos viáveis ​​a partir de pequenas amostras cirúrgicas do miocárdio ventricular humano. Miócitos ventriculares humanos podem ser usados ​​para estudos eletrofisiológicos e testes de drogas.

Resumo

Cardiomiócitos de corações doentes são submetidos a processos de remodelação complexas que envolvem mudanças na estrutura celular, acoplamento excitação contração e correntes de íons de membrana. Essas mudanças tendem a ser responsáveis ​​pelo aumento do risco arritmogênica e as alterações contráteis levando à disfunção sistólica e diastólica em pacientes cardíacos. No entanto, a maior parte da informação sobre as alterações da função dos miócitos em doenças cardíacas veio a partir de modelos animais.

Aqui vamos descrever e validar um protocolo para isolar miócitos viáveis ​​a partir de pequenas amostras cirúrgicas do miocárdio ventricular de pacientes submetidos a operações de cirurgia cardíaca. O protocolo está descrito em detalhe. Medições de cálcio e eletrofisiológicos intracelulares são relatados para demonstrar a viabilidade de uma série de medições de células individuais em cardiomiócitos ventriculares humanos obtidos com este método.

O protocolo relatado elere pode ser útil para futuras investigações de base celular e molecular das alterações funcionais do coração humano, na presença de doenças cardíacas diferentes. Além disso, este método pode ser utilizado para identificar novos alvos terapêuticos a nível celular e para testar a eficácia de novos compostos em cardiomiócitos humanos, com valor de translação directa.

Introdução

Dissecção das propriedades eletrofisiológicas do miocárdio progrediu acentuadamente após o desenvolvimento de técnicas para o isolamento individual dos miócitos cardíacos. Os recentes avanços na compreensão da excitação cardíaca Contração Coupling (EC-acoplamento) também têm sido possível graças à capacidade de isolar cardiomiócitos únicos viáveis ​​que conservam todas as propriedades fisiológicas do tecido intacto. Métodos de patch clamp são rotineiramente utilizados para estudar a função e modulação farmacológica de correntes iônicas sarcolemais cardíaca. Gravações da dinâmica de cálcio intracelular com Ca 2 + corantes sensíveis também são realizados regularmente em miócitos cardíacos individuais a partir de uma variedade de modelos saudáveis ​​e doentes, fornecendo dados vitais sobre a fisiologia da EC-acoplamento, bem como sobre as alterações patológicas de Ca 2 + intracelular homeostase levando a prejuízo mecânica e aumento da carga arritmogênica em doenças cardíacas. Informação a partir desses estudos é fundamental para a compreensão dos efeitos eletrofisiológicos e mecânicas de drogas no ambiente clínico. No entanto, existem diferenças específicas de espécies nas correntes transmembrana e nas proteínas EC-de acoplamento que são responsáveis ​​por características específicas do potencial de ação cardíaco e mecânica cardíaca. Assim, enquanto os estudos de miócitos isolados de mamíferos não humanos elucidaram as propriedades biofísicas e as funções fisiológicas dos canais iônicos transmembrana específicos e proteínas EC-acoplamento, eles não fornecem necessariamente modelos relevantes de miócitos cardíacos humanos. Isolamento de miócitos viáveis ​​do miocárdio humano é, portanto, essencial para compreender plenamente a fisiopatologia das doenças cardíacas e validar novas abordagens terapêuticas.

Tecido atrial humano está prontamente disponível como apêndices atriais estão muitas vezes descartados durante os procedimentos cirúrgicos. Estudos quantitativos iniciais do potencial de ação cardíaco humanos adultos e cu iônicarrents empregada células atriais enzimaticamente isolados 1-4. Gravações de potenciais de ação ou correntes a partir de células humanas adultas ventriculares isoladas foram posteriormente relatado 3,5-10. A maioria destes estudos utilizaram células obtidas a partir de corações de explante e utilizados ou de perfusão com colagenase de um segmento da artéria coronária ou a exposição de quantidades relativamente grandes de tecido excisado de colagenase para obter células isoladas. Esses estudos permitiram uma caracterização detalhada de uma série de correntes de íons transmembrana de cardiomiócitos do ventrículo humanos de corações saudáveis ​​e de pacientes com insuficiência cardíaca terminal. As gravações de tipo-L de Ca 2 + de corrente (I Ca-L) 5-7, a corrente de potássio para fora transitórias (I) 8, para dentro de potássio rectificador de corrente (I κ1) 8, os diferentes componentes da corrente de potássio rectificador retardado (I κ ) 9 foram relatados. Avanços e refino deo procedimento de isolamento 10, permitiu uma caracterização clara da base iônica do aumento do potencial arritmogênico na insuficiência cardíaca terminal, compreendendo acção potencial prolongamento 11, adiada após despolarizações 12 e aumentou engraçado atual 13 levando a despolarização diastólica e batimentos prematuros.

Miócitos cardíacos adultos são normalmente isolados a partir de pequenos animais por perfusão retrógrada do coração com toda a várias misturas de enzimas, uma técnica que produz rendimentos elevados de Ca 2 + as células tolerantes a 14. Isolamento de miócitos cardíacos de fragmentos de tecido é inerentemente menos bem sucedida, provavelmente devido ao acesso limitado de enzimas de miócitos individuais em comparação com a obtida por perfusão das artérias coronárias. Por causa da disponibilidade muito limitada de corações doados não utilizados, a única maneira prática de obter células ventriculares humanos normais em uma base regular é de digestio enzimátican dos fragmentos de tecido, muitas vezes muito pequenas excisadas durante procedimentos cirúrgicos eletivos. O único modelo de doença humana, que foi completamente caracterizada a nível celular é a insuficiência cardíaca terminal, devido à acessibilidade aos corações transplantados. No entanto, insuficiência cardíaca terminal ocorre numa minoria de pacientes e muitas vezes envolve uma via comum de remodelação grave de células do miocárdio, que é relativamente independente da causa subjacente 15. A capacidade de avaliar a função dos cardiomiócitos individuais de pacientes em um estágio não falha precoce da doença é fundamental para entender a fisiopatologia específica de diferentes condições hereditárias ou adquiridas. A cardiomiopatia hipertrófica (CMH) é um bom exemplo. HCM é uma comum (1/500 indivíduos) condição cardíaca hereditária caracterizada por hipertrofia cardíaca, aumento do risco e alterações contráteis arritmogénicos devido à obstrução da via de saída e disfunção diastólica 16. Cardiomiócitos de HCM corações undergo um processo de remodelação complexa, envolvendo mudanças na estrutura celular (hipertrofia, desarranjo miofibrilar) e EC-Coupling 17. No entanto, a maioria das informações de disfunção dos miócitos na CMH vem de modelos animais transgênicos. Uma vez que apenas uma minoria dos pacientes com CMH evolui para insuficiência cardíaca terminal e requer transplante cardíaco, HCM corações estão muito raramente disponíveis para o isolamento de células com métodos padrão. No entanto, pelo menos 30% dos portadores de CMH desenvolver sintomas obstrutivos, devido ao enorme fluxo de sangue do trato hipertrofia septal alterando fluxo durante a sístole (HCM) 18. A opção terapêutica disponível mais eficaz para o alívio da obstrução na CMH é a miectomia septal cirúrgica: durante o procedimento cirúrgico, uma parcela variável tamanho do septo superior é removido por abordagem da aorta trans. Esta porção do septo hipertrofiado é, por conseguinte, disponível para o isolamento de células a partir de tecido fresco.

Um método para o isolamento de ventricula humanor miócitos de, pequenas amostras de biópsia endomiocárdica transvenous único previamente desenvolvido e publicado em 19. Implementamos um método para isolar miócitos septo individuais a partir de amostras do miocárdio ventricular de pacientes submetidos à cirurgia cardíaca, incluindo pacientes com CMH submetidos a miectomia septal e pacientes submetidos a procedimentos de substituição de válvulas. Para além de uma descrição detalhada do protocolo de isolamento, electrofisiológico representativa e Ca 2 + de fluorescência as medições são apresentados, demonstrando a viabilidade dos isolados miócitos ventriculares humanos e a viabilidade de patch-clamp e intracelulares de Ca 2 + estudos.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

Os protocolos experimentais sobre o tecido humano foram aprovados pelo comitê de ética do Careggi Hospital Universitário (2006/0024713; renovada Maio de 2009). Cada paciente deu consentimento informado por escrito.

1. Soluções e Equipamentos Preparação

As soluções são descritas na Tabela 1. Um fluxograma simplificado do processo de isolamento de células encontra-se na Figura 1.

Solução CP DB KB Tuberculose PS EB1 EB2
Reagente (mM) KH 2 PO 4 50
MgSO4 8 1.2 5 1.2 1.2
HEPES 10 10 10
adenosina 5
glicose 140 10 20 10 10 10
manitol 100
taurina 10 20 5 20 20
NaCl 113 136 113 113
KCl 4.7 85 5.4 25 4.7 4.7
MgCl2 1.2 5
KH 2 PO 4 0,6 30 0,6 0,6
Na 2 HPO 4 0,6 0,6 0,6
NaHCO3 12 12 12
KHCO3 10 10 10
Na-piruvato 4 4 4
BDM 10 10 10
BHBA 5
ácido succínico 5
EGTA 0,5
K 2-ATP 2
ácido pirúvico 5
creatina 5
KMES 115
Enzimas (U / ml) Colagenase tipo V 250 250
Protease Tipo XXIV 4
pH 7.4 KOH NaOH 7,3 7.1 KOH NaOH 7,35 7.2 KOH NaOH 7,3 NaOH 7,3

. Tabela 1 Soluções utilizadas para a coleta de amostras, isolamento de células e caracterização funcional de miócitos CP = solução cardioplégica.; DB = tampão de dissociação; KB = solução Kraft-Brühe; TB = tampão Tyrode; PS = solução da pipeta; EB1 = tampão de enzima 1; EB2 = tampão de enzima 2.

  1. Solução cardioplégica (CP) Preparar. CP solução pode ser armazenada a 4 ° C durante até 1 semana.
  2. Prepare Ca 2 tampão de dissociação livre de + (DB). Esta solução deve ser usado durante o dia.
  3. Preparar a solução Kraft-Brühe (KB). KB solução pode ser armazenada a 4 ° C durante até uma pequeninak.
  4. Prepare Ca tampão Tyrode livre de + 2 (TB). Esta solução deve ser usado durante o dia.
  5. Filtrar todas as soluções usando filtros de seringa, antes da utilização.
  6. Preparar o aparelho de digestão (Figura 2), um recipiente de raspagem feita de duas escovas de frente de elastómero de silicone, um dos quais rodados por um motor eléctrico. O dispositivo digestão é feito sob encomenda. Detalhes sobre o dispositivo de digestão são na Figura 8; imagens do dispositivo estão nas Figuras 2 C e 2D. Lava-se a câmara de tecido com 70% de etanol e água.

2. Coleta e Processamento de Amostras do miocárdio

  1. Verter 40 ml da solução cardiplegic (CP) num tubo de 50 ml e armazena-o em gelo durante o transporte da amostra a partir do quarto dispositivo para o isolamento de células de laboratório.
  2. Colete a amostra do miocárdio ventricular da sala operatória imediatamente após a excisão, lave-o com gelo frioSolução CP e armazená-lo no tubo. Use espécimes endocárdio excisadas do septo ventricular, entre superior durante a cirurgia de coração aberto, ponderação> 100 mg.
  3. Rapidamente transferir a amostra para a área do laboratório; iniciar o processamento da amostra dentro de 10 minutos a partir de amostra de excisão.
  4. Enquanto mantém a amostra em tampão gelado CP, retire cuidadosamente a camada fibrosa endocárdica usando tesoura fina sob estereomicroscópio; depois, cortar o tecido do miocárdio para pequenas peças (2-3 mm de comprimento). Dependendo do tamanho da amostra de tecido, cortar uma quantidade total de miocárdio ventricular entre 100 mg e 1 g para cada isolamento.
  5. Após a conclusão da picagem tecido, transfira os pedaços do miocárdio no dispositivo digestão, com gelo limpo solução CP frio. Evitar preenchendo todo o volume entre as duas escovas de silício (3-4 ml) com os pedaços do miocárdio, utilizando-se não mais do que 1 g de tecido total.

3. Lavar e digestão de miocárdio Pedaços

  1. À réer os pedaços são transferidos para a câmara de raspagem do dispositivo digestão, mudar o tampão CP na câmara de frio Ca 2 + tampão de dissociação-free (DB).
  2. Colocar o dispositivo de digestão num banho termostático, de modo para a câmara de estar em contacto com a água aquecida no banho (Figura 1). Definir o banho a 37,5 ° C e ligá-lo, a fim de aumentar lentamente a temperatura da câmara de tecido. Ligar o motor do dispositivo de digestão, a definição da velocidade de rotação de 1 volta / segundo.
  3. Realizar 3 ciclos de lavagem com DB, mudando a solução na câmara de limpeza com DB a cada 8 minutos. A DB é aquecido (37 ° C) e oxigênio saturado antes de entrar em contato com os pedaços do miocárdio.
  4. Preparar tampão de enzima 1 (EB1) por adição de 250 U / ml de colagenase de tipo V e 4 U / mL de protease do tipo XXIV solução DB. Prepare tampão da enzima 2 (EB2), adicionando 250 U / ml de colagenase tipo V a solução DB. Aquecimento (37 ° C) e oxygenate EB1 e EB2.
  5. Realizar dois ciclos de 12 min de digestão no dispositivo de digestão rotativo com 100% EB1 oxigenado (a 37 ° C). Em cada ciclo, utilizar ~ 3 ml de EB1. Remover a solução com uma pipeta de aspiração e descartá-lo após cada ciclo.
  6. Prepare a 6 tubos de 15 ml para recolha de células, e ~ 80 mL de água fria (4 ° C) solução KB para a eluição dos tampões.
  7. Realizar um primeiro ciclo de digestão de 15 minutos com 3 ml de 100% EB2 oxigenada a 37 ° C. Após o ciclo de digestão, recolher a solução contendo os primeiros miócitos dissociadas num tubo de 15 ml e dilui-se a suspensão de células com 12 ml de solução fria KB. Guarde o apartamento tubo à temperatura ambiente.
  8. Diluir a solução EB2 restante com uma quantidade igual de DB, a fim de reduzir pela metade a concentração de colagenase V para os seguintes ciclos de digestão.
  9. Realizar outras cinco ciclos de 12 min de digestão com 3 ml EB2 a 37 ° C; depois de cada um deles recolher de miócitos contendo tampão, num tubo cónico de 15 ml ediluir com 12 ml de solução KB. Armazenar as 6 células contendo os tubos à temperatura ambiente durante 30 min.

4. Resuspensão Celular e Ca 2 + Readaptação

  1. Adicionar 1 mg / ml de albumina de soro bovino (BSA) a 20 ml de tampão de Ca 2 +-Tyrode livre (TB). Filtrar a solução.
  2. Centrifugar os seis miócitos contendo tubos cônicos a 100 xg por 5 min para forçar miócitos para resolver. Remover o sobrenadante e ressuspender as células em cada um dos tubos com uma quantidade variável (1-3 ml, dependendo do rendimento) de BSA contendo TB, à TA.
  3. Aumentar gradualmente a concentração de Ca2 + na célula contendo tampão através da adição de pequenas alíquotas de 100 mmol / L de solução de CaCl 2. Na primeira e na segunda etapas concentração de Ca2 + é elevado até 50 pmol / L e 100 pmol / L, respectivamente. Os seguintes passos de Ca 2 + de adição são realizadas a cada 5 min e a concentração é aumentada em 100 mmol / L em cada passo toa concentração final de 0,9 mmol / L.
  4. Avaliar o rendimento do processo de isolamento. Transferir 0,5 ml de solução contendo miócitos para a câmara de fundo de vidro de microscópio. Avaliar 15 campos do microscópio em 10x objetivo e calcular a percentagem de miócitos saudáveis ​​(por exemplo, em forma de bastonetes com estrias claras e sem inclusões significativas, Figura 2). O rendimento previsto é de cerca de 20%.

5. Avaliação Funcional de isolado cardiomiócitos.

O protocolo a seguir é um exemplo de avaliação funcional cardiomiócitos humano, incluindo gravações simultâneas de potenciais de ação e Ca 2 + intracelular fluxos.

  1. Preparar a solução de pipeta (PS) para experimentos de patch clamp na configuração de patch perfurado. A solução pode ser armazenada a -20 ° C durante até 3 meses.
  2. Adicionar 1,8 mmol / L de CaCl 2 a 2 Ca tampão Tyrode + livre (TB). Use esta solução para superfusão de cardiomiócitos durante as experiências braçadeira patch / fluorescência.
  3. Transferir 1 ml de suspensão de células para um tubo de 1,5 ml e adicionam-se 10 mmol / L e 10 ul Fluoforte Concentrado carga de potência. Incubar durante 30 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, defina o tubo na posição vertical e deixar a célula de se contentar com 5 min; ressuspender as células em Ca 2 + contendo TB.
  4. Transferir 0,25 ml de suspensão de células para um pequeno (0,5 ml), temperatura controlada microscópio montado câmara de registo, superfundidas por gravidade com um sistema microperfusor aquecido a uma taxa de fluxo de 0,3 ml / min (temperatura: 37 ± 0,5 ° C).
  5. Usando um puxador de micropipeta, preparar pipetas de fixação de membranas com um diâmetro de ponta de 3-5 um e uma resistência de 3 a 4,5 M, quando cheio com o PS.
  6. Adicionar anfotericina B para um lote de PS (250 ug / ml) e usá-lo para preencher os eléctrodos.
  7. Selecione uma célula em forma de haste com estrias claras, desprovido de inclusões, form o selo giga e esperar de 5 a 10 min, até que a resistência de acesso for inferior a 20 mohms.
  8. Provocar potenciais de ação no modo de fixação de corrente usando pulsos de curta duração (<3 ms) em diferentes frequências de estimulação (0,2 Hz, 0,5 Hz e 1 Hz, 1 min em cada freqüência). Durante a fase de gravação, ligar a iluminação de campo claro a 492 ± 3 nm e detectar Fluoforte fluorescência em 505-520 nm. Adquirir fluorescência e potencial de membrana usando sinais Digidata 1440A e 10,0 software pClamp. Repita a seqüência de gravação várias vezes, se necessário; no entanto, manter o tempo total de gravação inferior a 15 min, para cada célula.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

O método descrito acima foi utilizado para caracterizar as anormalidades funcionais de cardiomiócitos isolados do septo interventricular de pacientes com cardiomiopatia hipertrófica (CMH) que se submeteram à operação miectomia, em comparação com pacientes não falhando não hipertróficas cirúrgicos 21. Os resultados contidos nesta secção são derivados de trabalho 21 e que são mostrados aqui como um exemplo de como esta técnica pode ser utilizada para caracterizar as alterações da função das células d...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

Nós descrevemos e validado um método para isolar os miócitos viáveis ​​a partir de amostras cirúrgicas do miocárdio ventricular humano. A partir de protocolos descritos anteriormente que tinham sido usados ​​com sucesso para células isoladas a partir de amostras cirúrgicas atriais, a técnica para permitir a separação de miócitos viáveis ​​individuais de miocárdio ventricular doente foi desenvolvido e afinado. Os primeiros relatos mostraram que o isolamento dos cardiomiócitos individuais de pedaços de tecido atrial e ven...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pela UE (STREP Projeto 241577 "grande coração," 7 º Programa-Quadro Europeu, CP), Menarini International Operations Luxembourg (AM), Telethon GGP07133 (PB) e Gilead Sciences (AM).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Fosfato de potássio monobásico (KH2PO4)Sigma-AldrichP9791
Sulfato de magnésio heptahidratado(MgSO4*7H2O)Sigma-AldrichM1880
HEPESSigma-AldrichH3375
AdenosinaSigma-AldrichA9251
D-(+)-GlicoseSigma-AldrichG8270 Manitol
Sigma-AldrichM4125
TaurinaSigma-AldrichT0625
Hidróxido de potássio (KOH)Sigma-AldrichP5958
Cloreto de sódio (NaCl)Sigma-AldrichS7653
Cloreto de potássio (KCl)Sigma-AldrichP9333
Fosfato de sódio dibásico (Na2HPO4)Sigma-AldrichS7907
Bicarbonato de sódio (NaHCO3)Sigma-AldrichS6297
Bicarbonato de potássio (KHCO3)Sigma-Aldrich237205
Piruvato de sódioSigma-AldrichP2256
2,3-Butanodiona monóximaSigma-AldrichB0753
hidróxido de sódio(NaOH)Sigma-AldrichS8045 < / a>
L-Ácido glutâmico sal monopotássico monohidratadoSigma-Aldrich49601
Ácido pirúvicoSigma-Aldrich107360
ácido 3-hidroxibutíricoSigma-Aldrich166898
Adenosina 5′-trifosfato sal dipotássico di-hidratado (K2-ATP)Sigma-AldrichA8937
CreatinaSigma-AldrichC0780
Ácido succínicoSigma-AldrichS3674
Etilenoglicol-bis(2-aminoetiléter)-N,N,N′,N′-ácido tetraacético (EGTA)Sigma-AldrichE0396
Albumina do soro bovinoSigma-AldrichA0281
Cloreto de magnésio (MgCl2)Sigma-AldrichM8266
Colagenase de Clostridium histolyticum, Tipo VSigma-AldrichC9263
Proteinase, Bacteriana, Tipo XXIVSigma-AldrichP8038
Solução de cloreto de cálcio, ~1 M em H2OSigma-Aldrich21115
Solução de cloreto de cálcio 0,1 MSigma-Aldrich53704
Metanossulfonato de potássioSigma-Aldrich83000
FluoForte ReagenteEnzo Life SciencesENZ-52015
Concentrado de carga de potência, 100XSistema deLife Technologies P10020
Warner InstrumentsVC-77SP
Anfotericina B solubilizadaSigma-AldrichA9528
Multiclamp 700B amplificador patch-clampMolecular Devices
Digidata 1440AMolecular Devices
pClamp10.0 Dispositivos Moleculares
PERSONALIZADOOdispositivo é feito sob medida em nosso laboratório usando tubos de plástico, Sylgard fundido e um motor; é descrito em detalhes na Figura 1C-1D e na Figura 7. Podemos fornecer mais detalhes, se solicitado.
Elastômero de silicone para escovas do dispositivo de digestãoDow CorningSYLGARD® 184
Motor rotativo de velocidade variável para o dispositivo de digestãoCrouzetCrouzet 178-4765
Molde para escovas fundidasN.A.N.A.O molde é feito sob medida a partir de hastes padrão de PTFE de 2,5 cm de diâmetro.
passo rápido de perfusão Dispositivo de Digestão de

Referências

  1. Dow, J. W., Harding, N. G., Powell, T. Isolated cardiac myocytes. I. Preparation of adult myocytes and their homology with the intact tissue. Cardiovascular Research. 15, 483-514 (1981).
  2. Dow, J. W., Harding, N. G., Powell, T. Isolated cardiac myocytes. II. Functional aspects of mature cells. Cardiovascular Research. 15, 549-579 (1981).
  3. Harding, S. E., et al. Species dependence of contraction velocity in single isolated cardiac myocytes. Cardioscience. 1, 49-53 (1990).
  4. Bustamante, J. O., Watanabe, T., Murphy, D. A., McDonald, T. F. Isolation of single atrial and ventricular cells from the human heart. Canadian Medical Association Journal. 126, 791-793 (1982).
  5. Beuckelmann, D. J., Nabauer, M., Erdmann, E. Characteristics of calcium-current in isolated human ventricular myocytes from patients with terminal heart failure. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 23, 929-937 (1991).
  6. Beuckelmann, D. J., Nabauer, M., Erdmann, E. Intracellular calcium handling in isolated ventricular myocytes from patients with terminal heart failure. Circulation. 85, 1046-1055 (1992).
  7. Cohen, N. M., Lederer, W. J. Calcium current in single human cardiac myocytes. Journal of Cardiovascular Electrophysiology. 4, 422-437 (1993).
  8. Beuckelmann, D. J., Nabauer, M., Erdmann, E. Alterations of K+ currents in isolated human ventricular myocytes from patients with terminal heart failure. Circulation Research. 73, 379-385 (1993).
  9. Virag, L., et al. The slow component of the delayed rectifier potassium current in undiseased human ventricular myocytes. Cardiovascular Research. 49, 790-797 (2001).
  10. Nanasi, P. P., Varro, A., Lathrop, D. A. Isolation of human ventricular and atrial cardiomyocytes: technical note. Cardioscience. 4, 111-116 (1993).
  11. Benitah, J. P., et al. Slow inward current in single cells isolated from adult human ventricles. Pflugers Archiv. European Journal of Physiology. 421, 176-187 (1992).
  12. Verkerk, A. O., et al. Ionic mechanism of delayed afterdepolarizations in ventricular cells isolated from human end-stage failing hearts. Circulation. 104, 2728-2733 (2001).
  13. Cerbai, E., et al. Characterization of the hyperpolarization-activated current, I(f), in ventricular myocytes from human failing heart. Circulation. 95, 568-571 (1997).
  14. Kohncke, C., et al. Isolation and kv channel recordings in murine atrial and ventricular cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2013).
  15. Tomaselli, G. F., Marban, E. Electrophysiological remodeling in hypertrophy and heart failure. Cardiovascular Research. 42, 270-283 (1999).
  16. Maron, B. J. Hypertrophic cardiomyopathy: a systematic review. JAMA: The Journal of the American Medical Association. 287, 1308-1320 (2002).
  17. Olivotto, I., et al. The many faces of hypertrophic cardiomyopathy: from developmental biology to clinical practice. Journal of Cardiovascular Translational Research. 2, 349-367 (2009).
  18. Maron, M. S., et al. Hypertrophic cardiomyopathy is predominantly a disease of left ventricular outflow tract obstruction. Circulation. 114, 2232-2239 (2006).
  19. Peeters, G. A., et al. Method for isolation of human ventricular myocytes from single endocardial and epicardial biopsies. The American Journal of Physiology. 268, 1757-1764 (1995).
  20. Lippiat, J. D. Whole-cell recording using the perforated patch clamp technique. Methods Mol Biol. 491, 141-149 (2008).
  21. Coppini, R., et al. Late sodium current inhibition reverses electromechanical dysfunction in human hypertrophic cardiomyopathy. Circulation. 127, 575-584 (2013).
  22. Kuusisto, J., et al. Low-grade inflammation and the phenotypic expression of myocardial fibrosis in hypertrophic cardiomyopathy. Heart. 98, 1007-1013 (2012).
  23. Yan, G. X., et al. Phase 2 early afterdepolarization as a trigger of polymorphic ventricular tachycardia in acquired long-QT syndrome : direct evidence from intracellular recordings in the intact left ventricular wall. Circulation. 103, 2851-2856 (2001).
  24. Yue, L., Feng, J., Li, G. R., Nattel, S. Transient outward and delayed rectifier currents in canine atrium: properties and role of isolation methods. The American Journal of Physiology. 270, 2157-2168 (1996).
  25. Li, G. R., Feng, J., Yue, L., Carrier, M., Nattel, S. Evidence for two components of delayed rectifier K+ current in human ventricular myocytes. Circulation research. 78, 689-696 (1996).
  26. Viswanathan, P. C., Shaw, R. M., Rudy, Y. Effects of IKr and IKs heterogeneity on action potential duration and its rate dependence: a simulation study. Circulation. 99, 2466-2474 (1999).
  27. Volders, P. G., et al. Probing the contribution of IKs to canine ventricular repolarization: key role for beta-adrenergic receptor stimulation. Circulation. 107, 2753-2760 (2003).
  28. Sanguinetti, M. C., Jurkiewicz, N. K., Scott, A., Siegl, P. K. Isoproterenol antagonizes prolongation of refractory period by the class III antiarrhythmic agent E-4031 in guinea pig myocytes. Mechanism of action. Circulation Research. 68, 77-84 (1991).
  29. Coppini, R., et al. A translational approach to treatment of hypertrophic cardiomyopathy: pre-clinical rationale and design of a prospective randomized pilot trial with ranolazine. Circulation. 125, 1(2012).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

Isolamento de Cardiomi citosMioc rdio VentricularDigest o Enzim ticaRegistro de Patch ClampMedi o do Potencial de A oAn lise de Transientes de C lcioSolu o Cardiopl gicaFra o Vascular EstromalSuspens o Celular

Artigos relacionados