Minimamente Invasiva Estabelecimento de murino ortotópico bexiga Xenoenxertos

Pesquisa sobre o câncer é dependente de modelos animais de câncer humano, usando linhas de células derivadas de tumores de pacientes, a fim de aprofundar a nossa compreensão da biologia do tumor. Pois na análise de crescimento vivo sob diferentes estratégias de tratamento de câncer de bexiga modelos murino ortotópico permanecer o padrão de referência ^1,2. A inoculação de células de câncer de bexiga humanos em camundongos imunocomprometidos (modelo de xenotransplante) conta com a instilação intravesical ("modelo intravesical") ^3,4,5 ou injeção direta na parede da bexiga ("modelo intramural") ^6,7. Ambas as técnicas podem também ser realizadas em ratos ^8,9.

Instilação intravesical induz a formação de tumores na superfície uroteliais de bexiga, que, em seguida, são passíveis de subsequente instilação intravesical de novos agentes de tratamento. No entanto, o número de linhas de células que são fiavelmente tumorigénicas quando entregues através deste método é limitado ad uma dessas linhas celulares, KU7, foi recentemente demonstrado ser HeLa ^4,10. Instilação intravesical também é demorado devido ao tempo de espera necessários, e freqüentemente induz o crescimento do tumor em elementos adjacentes do trato urinário, incluindo uretra, ureter e pelve renal ^11. Além disso, a instilação intravesical frequentemente conduz ao crescimento do tumor no chão da bexiga, onde os ureteres entrar na bexiga, e este pode causar a obstrução do tracto superior e insuficiência renal concomitante.

Xenoenxertos de cancro da bexiga invasivo primários que sejam adequados para tratamentos sistémicos são criados através de injecção directa de células tumorais na parede da bexiga ^12. Apesar de numerosas linhas celulares de crescer adequadamente, neste modelo, a limitação é a capacidade de invasão do modelo relacionada com a necessidade de uma incisão abdominal ^13. O modelo também é um desafio para aprender devido à dificuldade técnica de injeção de células precisamente na parede do músculoda bexiga.

Uma nova abordagem para estabelecer ortotópico primários xenografts câncer de bexiga invasivo em ratos foi desenvolvido em nosso serviço, a fim de colmatar as lacunas existentes do "modelo intramural". Nós fomos capazes de otimizar a, injeção percutânea guiada por ultra-som de células de câncer de bexiga na parede da bexiga anterior, resultando nesta nova técnica para substituir com sucesso o modelo invasivo estabelecida. Além disso, temos, potencialmente, aumentar a precisão e reprodutibilidade do "modelo intramural".

Todos os procedimentos com animais foram realizados de acordo com as diretrizes do Canadian Council on Animal Care (CCAC). O protocolo foi aprovado pelo Comitê Animal Care, da Universidade de British Columbia (número do protocolo: A10-0192).

1. Preparação de Linhas Celulares

1. Confirmar a identidade das respectivas linhas celulares de cancro da bexiga humana por DNA fingerprinting ^7.
2. Para a análise de crescimento de tumores de xenoenxerto por bioluminescência, transfecção de linhas celulares com uma construção lentiviral portador do gene da luciferase de vaga-lume ^3.
3. Descongelar e expandir linhas de células existentes no meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) com 10% de soro fetal bovino (FBS) a 37 ° C em atmosfera húmida 5% de _CO2. Passagem das células, pelo menos 3x mas evitar tempos de cultura superior a 3 meses.

2. Preparação da suspensão celular

1. Descongele Matrigel. Manter a temperatura abaixo de4 ° C para evitar o aumento da viscosidade do gel.
2. Tripsinizar as células a uma confluência de 70% e suspensão em meios de crescimento normal.
3. Contar o número de células com um hemocitômetro ou contador automático de células.
4. Girar a suspensão de células durante 5 min a 200 x g. Remover o sobrenadante.
5. Adicionar o volume apropriado de meio DMEM (10% de FBS) e Matrigel (1:1) de modo a alcançar a concentração de células desejada, que é dependente da linha celular utilizada e da cinética de crescimento desejada (8-15 x 10 ⁶ / ml). O volume injectado de suspensão de células do tumor será de 40 ul.
6. Misture bem por pipetagem cima e para baixo (P1000), evitar a criação de bolhas de ar na suspensão.

3. Preparação de Animais

Nota: Devido à necessidade potencial de cateterização transuretral no passo 4.7, camundongos fêmeas são o sexo preferido neste modelo animal.

1. Camundongos casa de acordo com gu institucional e cuidados com os animais nacionalidelines. Obter aprovação comitê de ética para todos os experimentos envolvendo ratos.
2. Anestesiar os ratos com 3% de mistura de isoflurano / oxigénio. Confirme anesthetization adequado dos animais (por exemplo, falta de resposta aos pitadas dedo do pé).

4. Instalação Experimental

1. Cortar a estabilização da bexiga a partir de qualquer tipo de material de plástico rígido liso [Figura 2 I]. Inspecione cuidadosamente a alça e remover quaisquer arestas vivas antes da aplicação para os ratos.
2. Montar o animal sobre a mesa aquecida imagem [Figura 1 I] do animal plataforma pequena imagem com monitoramento contínuo dos sinais vitais. Corrigir os membros inferiores com um elástico [Figura 1 III].
3. Desinfetar o abdômen com 2% de gluconato de clorexidina e limpe a pele com um cotonete estéril.
4. Imobilizar a bexiga com a tira de estabilização da bexiga [Figura 2 II]. Assim, uma evasãoda bexiga durante a injecção intramural no passo 5.6 será evitado.
5. Aplique o gel de ultra-som estéril para a parte inferior do abdômen.
6. Aproximar lentamente a cabeça da sonda de ultra-som (freqüência de 40 MHz) [Figura 1 IV] para a pele (longitudinal com um ângulo de 45-70 ° craniana) e visualizar a bexiga na tela do ultra-som [Figura 3 I].
7. Se a bexiga está vazia, preenchê-lo com 50 ul tampão fosfato estéril, quente (PBS), através de um G angiocateter transuretral 24.

5. Separação das camadas da parede da bexiga

1. Anexar uma seringa de 1,0 ml com PBS e ligado a um 30 L, ¾ de agulha (chanfro dirigida anteriormente) para o grampo de seringa.
2. Posicionar a agulha no sentido da pele logo acima do osso púbico, em um ângulo de 30-45 ° (80-90 ° em relação ao eixo longitudinal da cabeça da sonda de ultra-sons [Figura 1]).
3. Detectar a agulhana tela de ultra-som.
4. Lentamente perfurar a pele e os músculos da parede abdominal [Figura 3 II].
5. Gire o bisel da agulha 180 ° (agora dirigida posteriormente).
6. Inserir a ponta da agulha para dentro da parede da bexiga, sem penetrar na mucosa [Figura 3 III]
7. Lentamente injectar 50 ul de PBS entre a camada muscular e mucosa, a fim de criar um espaço artificial [Figura 3 IV].
   Nota: Se a mucosa é acidentalmente perfurada durante o passo 5.6, lentamente puxe a agulha e injetar 50 mL de PBS após a camada mucosa tem virado para trás sobre a ponta da agulha.
8. Retire a agulha.

6. Intramuros inoculação de células de câncer da bexiga

1. Anexar uma segunda seringa de 1,0 ml (cheio de células cancerosas suspensas em Matrigel) com a 30 G, ¾ de agulha para a braçadeira de seringa.
2. Guiar a ponta da agulha para a mesmaEspaço PBS-cheia, que foi criado no passo 5.7.
3. Injecte 40 ul da suspensão de células para dentro deste espaço [Figuras 3 V e VI].
4. Retire a agulha.

7. Cuidados de suporte pós-intervencionista

1. Desmonte o mouse a partir da plataforma de imagem.
2. Manter o animal em um ambiente acolhedor e confortável sob vigilância contínua durante a recuperação da anestesia.
3. Depois de recobrar a consciência e retomar a deambulação normal, coloque o animal de volta em sua gaiola.

Injeção intramural de três linhagens de células tumorais diferentes (UM-UC1 luc, UM-UC3 Luc e UM-UC13 luc) foi realizada em 50 animais sob ultra-som-orientação em três dias consecutivos. A inoculação foi realizada de forma eficiente (tempo médio de 5,7 min / animal) e não foi associada a complicações intra ou pós-intervenção.

Monitoramento do crescimento do tumor foi realizada por ultra-sonografia e bioluminescência. No dia # 3 um tumor poderia ser detectado por ultra-som na bexiga anterior de todos os 50 animais [Figura 4 I]. 98% dos camundongos mostraram o crescimento do tumor constante durante o período de seguimento [Os quadros 4 e 5]. Após a inoculação do UM-UC3 luc, um rato desenvolvido disseminação do tumor intraperitoneal eo tumor involuído após dia como 7 em um segundo animal [Tabela 1]. Este foi o primeiro grupo de ratinhos inoculados com esta nova técnica.

Figura 1. Imagem e ilustração esquemática da configuração experimental. O rato é montado em cima da mesa aquecida operação (I) e realizada sob anestesia (<strong> II) com 3% de mistura de isoflurano / oxigénio. Os membros inferiores são fixados com um elástico (III). Depois de se aproximar da cabeça da sonda de ultra-sons (IV) para a pele (alinhamento longitudinal com um ângulo de 45-70 ° craniana) da bexiga (V) é visualizada no ecrã de ultra-som. Uma seringa com uma agulha 30 G (VI) é guiada para a pele, num ângulo de 30-45 ° (80-90 ° em relação ao eixo longitudinal da cabeça da sonda de ultra-sons).

Figura 2. Imobilização da bexiga. Dimensões e ilustra a construção da correia de estabilização da bexiga (I), A correia está ligada a parte inferior do abdómen e imobiliza a bexiga (II). Assim, uma evasão do bexiga durante a injeção intramural é evitado.

Figura 3. Intramural inoculação de células tumorais. Visualização da bexiga na tela de ultra-sons (I). Perfuração da pele e músculos da parede abdominal (II). A inserção da agulha para dentro da parede da bexiga, sem penetração da mucosa (III). PBS (50 mL) entre a camada muscular e da mucosa após uma injecção lenta (IV). As células tumorais suspensas em Matrigel no espaço criado artificialmente intramural (V, ​​VI).

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Figura 4. . Acompanhamento por ultra-som contínuo acompanhamento por ultra-som mostrou aumento significativo do volume do tumor (I: dia # 3, II: dia # 7, III: dia # 13).

Figura 5. Follow-up por bioluminescência. Contínuo acompanhamento por bioluminescência mostraram aumento constante da luminescência durante o período de estudo.

Figura 6. Histologia do tumor xenoenxerto e metástase linfonodal. In toto secção H & E de um xenotransplante representante tu mor demonstrando crescimento invasivo no músculo sem invasão em órgãos adjacentes (I). 60% dos camundongos com tumores luc UM-UC13 e 20% de camundongos portadores de tumores luc UM-UC3 apresentaram metástases em linfonodos retroperitoneais (II).

Tabela 1. Injeção de células tumorais de ultra-som-guiada - procedimento e resultados.

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