Minimamente Invasiva Estabelecimento de murino ortotópico bexiga Xenoenxertos

O objetivo geral deste procedimento é criar xenoenxertos ortotópicos de câncer de bexiga de maneira rápida, precisa e minimamente invasiva. Isso é feito primeiro expandindo a linha de células tumorais específica e a suspensão das células tumorais em Matrigel. Em seguida, o animal é montado na plataforma de imagem e a bexiga é visualizada com ultrassom.

Em seguida, as camadas mucosa e muscular da bexiga são separadas com uma injeção salina. Finalmente, a suspensão de matrigel de células tumorais é injetada neste espaço criado artificialmente. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram o crescimento do tumor por meio de imagens de ultrassom e bioluminescência.

A principal vantagem dessa técnica em relação a outros métodos existentes, como o uso de laparotomia para inoculação de xenoenxertos primários, é que essa abordagem é rápida, precisa e minimamente invasiva. As implicações dessas técnicas se estendem ao diagnóstico e terapia do câncer de bexiga porque os autoxenoenxertos são o padrão-ouro para o estudo pré-clínico de novos tratamentos. A demonstração visual deste método é crítica porque as etapas de injeção são bastante difíceis de aprender e a água é muito fina, demonstrando este procedimento será.

Igor Mosca tem um assistente de pesquisa e Wolfgang Yeager, um pós-doutorando. Ambos são urologistas Depois de confirmar a identidade das respectivas linhagens celulares de câncer de bexiga humana. Para este estudo por meio de impressão digital de DNA, use uma construção lentiviral carregando o gene da luciferase do vaga-lume para análise do crescimento de bioluminescência de tumores de xenoenxerto para transfectar as linhagens celulares.

Quando estiver pronto para iniciar o procedimento, descongele e use DMEM com 10% de FBS para expandir as linhagens celulares existentes, incube a 37 graus Celsius em uma atmosfera umidificada de 5% de CO2. Para preparar uma suspensão celular para injeção após o descongelamento, matrigel e manter os olhos de tripsina de gelo, células de confluência a 70% e usar meio de crescimento normal para suspender, contar as células e girar a suspensão a 200 vezes G por cinco minutos. Após remover o sobrenadante, adicione a quantidade apropriada de volumes iguais de D-M-E-M-F-B-S e MATRIGEL para atingir a concentração celular desejada para injetar um volume de 40 microlitros por animal.

Misture bem e evite criar bolhas de ar a partir de qualquer tipo de material plástico plano e rígido. Corte um estabilizador de bexiga, inspecione cuidadosamente a alça e remova quaisquer bordas afiadas antes de aplicar nos ratos. Depois de anestesiar camundongos fêmeas com isoflurano a 3% em oxigênio e beliscar o dedo do pé.

Para garantir uma sedação adequada, monte o animal na mesa de imagem de aquecimento da plataforma de imagem de pequenos animais, monitorando continuamente seus sinais vitais com um elástico. Fixe os membros inferiores e use gluconato de clorexidina a 0,5% para desinfetar o abdômen antes de usar uma ponta de algodão estéril para limpar a pele. Em seguida, usando a cinta de estabilização da bexiga, imobilize a bexiga para evitar uma evasão dela durante a injeção intramural.

Em seguida, aplique gel de ultrassom estéril na parte inferior do abdômen. Avance lentamente a ultrassonografia, vá até a pele e visualize a bexiga na tela do ultrassom. Se a bexiga estiver vazia, use 50 microlitros de PBS quente em um cateter angio transuretral de calibre 24 para preenchê-lo e separar as camadas da parede da bexiga.

Comece conectando uma seringa de 1,0 mililitro cheia de PBS e conectada a uma agulha de calibre 30 de três quartos de polegada ao grampo da seringa. Posicione a agulha em direção à pele logo acima do osso púbico. Em um ângulo de 30 a 45 graus, detecte a agulha na tela de ultrassom antes de perfurar lentamente a pele e os músculos da parede abdominal.

Em seguida, gire o chanfro da agulha 180 graus para que fique voltado para trás e insira a ponta da agulha na parede da bexiga sem penetrar na mucosa. Em seguida, para criar um espaço artificial, injete lentamente 50 microlitros de PBS entre a camada muscular e a mucosa antes de retirar a agulha. Para injetar células cancerígenas da bexiga, conecte uma segunda seringa de 1,0 mililitro cheia de suspensão de matrigel de células cancerígenas e uma agulha de calibre 30 de três quartos de polegada na pinça da seringa.

Guie a ponta da agulha para o espaço preenchido com PBS. Acabei de criar e injetar 40 microlitros da suspensão no espaço. Em seguida, retire a agulha após desmontar o mouse da plataforma de imagem.

Mantenha-o em um ambiente quente e confortável sob monitoramento contínuo. Depois de recuperar a consciência e a deambulação normal, coloque o animal de volta em sua gaiola de origem. A injeção intramural de três diferentes linhagens de células tumorais foi realizada em 50 animais sob orientação ultrassonográfica em três dias consecutivos.

A inoculação foi realizada de forma eficiente e não foi associada a complicações intra ou pós-intervenção. O monitoramento do crescimento tumoral foi realizado por ultrassonografia e bioluminescência. No terceiro dia, um tumor pôde ser detectado por ultrassom na bexiga anterior de todos os 50 animais, e 98% dos camundongos exibiram crescimento tumoral constante durante o período de acompanhamento após a inoculação de uc. Três.

Luke, um camundongo, desenvolveu disseminação tumoral intraperitoneal e o tumor involuído após o sétimo dia em um segundo animal. Este foi o primeiro grupo de camundongos inoculados com esta nova técnica após a inoculação de uc. Três. Lucas uc, um Lucas e uc.

13 Lucas. Os camundongos foram sacrificados nos dias 24, 28 e 37, respectivamente. Os tumores de xenoenxerto foram colhidos e examinados por meio de cortes h e d.

Todos os tumores eram músculo-invasivos e alguns infiltravam-se na gordura pervisceral, mas não foi observada invasão em órgãos adjacentes. 60% do UC, 13 Luke e 20% do UC. Três camundongos portadores do tumor Luke desenvolveram metástases linfonodais retroperitoneais, que foram confirmadas pela coloração h e e.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em três minutos. A familiaridade com a imagem de ultrassom é um pré-requisito para realizar este procedimento Depois que os tumores foram inoculados dessa maneira, o ultrassom nos permite não apenas monitorar o crescimento do tumor ao longo do tempo, mas também observar a perfusão do tumor com microbolhas. Também nos permite realizar injeção intratumoral com novos agentes experimentais.