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Alojamento dos animais e eutanásia: Todos os animais utilizados neste demonstração foram alojados em condições livres de patógenos, de acordo com as diretrizes do Animal Care e Use Comitê Institucional (IACUC) e do Instituto Nacional de Saúde (NIH).
Fornecer animais com ração hard-pellet padrão e água ad lib. Eutanásia animais através de um método de duas etapas de asfixia dióxido de carbono, toracotomia bilateral, de acordo com o protocolo padrão da UCSF aprovado pelo IACUC. Realizar testes biomecânicos nas 24 horas após o sacrifício dos animais, para evitar a degradação do tecido.
1. Preparação e dissecção de um rato mandíbula ou maxila
- Retirar mandíbulas de ratos por meio do corte do tecido gentilmente anexos e tecido muscular membranosas preservando toda a mandíbula, incluindo o processo e o processo coronoide condilar (Figura 1) 15.
- Hemimandíbula separados de carroefully cortando o tecido fibroso da sínfise mandibular com uma lâmina de bisturi.
Nota: Os processos de coronárias e do côndilo e ramo da mandíbula (Figura 1) deve ser removido se obstruir fisicamente testes biomecânicos do 2 º molar. - Corte os incisivos, sem expor a câmara pulpar, para não dificultar o carregamento do molar.
2. Preparação de amostras para in situ à compressão de carga (Figura 2)
- Imobilizar a amostra sobre um topo de aço, utilizando um material que é significativamente mais duro do que o espécime experimentais antes de colocá-lo em um dispositivo de carregamento em situ (Figura 2A).
Nota: polimetilmetacrilato (PMMA) foi utilizado para imobilizar a amostra em estudo e este excesso, se algum, foi removido usando um explorador dental. - Alinhe a superfície oclusal do molar (s) de interesse paralelo com o disco de amostra AFM de metal usando uma borda reta em ambosaviões (ou seja, mesial-distal e vestíbulo-lingual).
- Criar uma calha com um instrumento contundente ao redor dos molares.
Nota: Este espaço deve servir como um "fosso" para conter o excesso de líquido e manter a hidratação do tecido durante o carregamento em situ. - Preparar a superfície do dente ao construir-se para concêntrica (Figura 2B) ou excêntrico (Figura 2C) usando uma carga composta dental. Gravar a superfície do dente de interesse com o gel de ácido fosfórico a 35% na superfície oclusal de 15 seg.
- Lavar o produto corrosivo abundantemente com água desionizada e secar a superfície usando uma seringa de ar / água ou um recipiente de ar comprimido. Com um explorador, espalhe uma gota de o agente de ligação em cúspides abertas em uma camada fina. Cure o composto com uma luz de cura dental.
Nota: Todas as etapas que envolvem compósitos deve ser realizada sem a luz direta de uma lâmpada. Tais condições seriam indesejavelmente acelerar o processo de polimerização, e could evitar a colocação adequada do composto. Iluminação do quarto é aceitável. - Retire o excesso de agente de ligação a partir de dentes adjacentes com um bom bisturi ou lâmina de barbear.
- Coloque compósito dentário fluida na superfície após a preparação da superfície e espalhá-lo dentro de ranhuras do molar (s) de interesse, utilizando um explorador dental.
- Exponha o composto à luz de cura dental para 30 seg.
- Moldar um acúmulo oclusal de cerca de 3-4 mm usando uma resina composta dental, a partir do plano oclusal do molar (s) de interesse e cura luz por 30 segundos.
- Reduzir o início da formação de compósito com uma superfície plana paralela ao permitir que um regime de carga consistente em todos os espécimes, usando uma régua e um dispositivo manual de alta velocidade.
Nota: Durante o teste biomecânico, outras amostras devem ser armazenadas em tris-fosfato de solução tamponada (TBS) com 50 mg / ml de penicilina, estreptomicina e 15.
3. Carregando Deriva de dispositivos eRigidez, capacidade material de propriedade de diferenciação, in situ Carregando da fibrosa Joint
- Fixar o espécime com o acúmulo de compósito sobre a bigorna da fase de carregamento, e de teste para uma carga uniforme, como mostrado na Figura 2B.
- Coloque um papel de articulação sobre a superfície do compósito, seguido por carregar as amostras para uma carga finita para verificar a existência de carregamento concêntrica ou excêntrica (Figuras 2B e 2C).
- Coloque Kimwipe TBS-embebido em torno da amostra para garantir a hidratação da amostra. Faça uma calha ao redor da amostra e preenchê-lo com TBS para manter o órgão hidratado durante o exame.
- Carga de pico de entrada e taxa de deslocamento para o software Deben para comprimir o molar para uma carga de pico desejado a uma taxa de deslocamento após a imobilização do hemimandíbula.
Nota: as leituras típicas deve incluir uma carga reacionário como o material é comprimido ao longo do tempo (sensibilidade do transdutor de carga = 0,1N). A partir do tempo de carga e tempo de deslocamento, a curva de carga-deslocamento para o material compactado deve ser obtida 16-18. Utilizando os dados recolhidos a partir dos ciclos de carga, várias propriedades do conjunto pode também ser determinada. A rigidez da junta deve ser calculada tomando o declive da porção linear (cerca de 30% do último dos dados) da fase de carregamento da carga versus deslocamento da curva 19.
4. Coloração de Tecidos Moles, o PDL, com ácido fosfotúngstico (PTA)
Nota: Para aumentar o contraste de raios-X de atenuação, o PDL devem ser coradas com solução de 5% PTA 20.
- Solução de coloração Backfill PTA em uma limpa 1,8 ml carpule de vidro e coloque carpule carregado na seringa.
- Injectar solução lentamente (5 min / carpule) para o espaço PDL de dentes adjacentes para evitar danos estruturais nos tecidos periodontais circundantes molar de interesse.
Nota: Os passos acima deve be repete-se até cerca de 5 tubetes anestésicos completos (9 ml) de solução são injectados e deixada fluir para os tecidos circundantes. Os espécimes prepped também pode ser embebido durante a noite em solução de PTA restante (8 horas).
5. Recomendados Configurações de digitalização μ-XCT
Realize m-XCT com as seguintes configurações de digitalização:
| Objetivo Ampliação | 4X, 10X |
| 1.800 imagens |
| Tensão do tubo de raios-X | 75 kVp (50 kVp para amostras de PTA manchado) |
| 8 W |
| Tempo de Exposição | ~ 8-25 seg * |
| ~ 4 mm (objetiva de 4X), ~ 2 m (objetiva de 10X) ** |
* O tempo de exposição pode variar com base na geometria e a densidade óptica da amostra e do tubo de raios-X voltage.
** Resolução real de pixels será ligeiramente diferente com base na configuração da fonte, espécime, e detector.