Injeção sistêmica de células-tronco neurais / progenitoras em ratos com EAE crónica

Resumo

O transplante de células-tronco / progenitoras neurais (NPCs) detém grandes promessas em neurologia regenerativa. A administração sistêmica de NPCs se transformou em baixo invasivo e muito eficaz terapeuticamente protocolo eficaz, para entregar as células-tronco no cérebro e na medula espinhal de roedores e primatas não-humanos que sofreram prejuízos inflamatória crônica experimental do sistema nervoso central.

Resumo

Células tronco / progenitoras neurais (NPCs) são uma fonte de células-tronco promissor para abordagens de transplante, visando a reparação cerebral ou restauração em neurologia regenerativa. Esta directiva surgiu a partir da evidência extensa que a reparação do cérebro é alcançado após o transplante NPC focal ou sistêmica em vários modelos pré-clínicos de doenças neurológicas.

Estes dados experimentais identificaram a rota de entrega célula como um dos principais obstáculos de terapias com células estaminais restauradores para doenças cerebrais que requerem avaliação urgente. Enxerto de células-tronco intraparenquimatosa representa uma abordagem lógica para essas patologias caracterizadas por lesões isoladas e acessíveis do cérebro, como lesões da medula espinhal e doença de Parkinson. Infelizmente, este princípio é aplicável mal às condições caracterizadas por uma natureza multifocal, inflamatória e disseminada (no tempo e no espaço), incluindo a esclerose múltipla (MS). Como tal, o cérebro a segmentação por sistentrega NPC émica tornou-se um protocolo invasivo e terapeuticamente eficazes de baixo para entregar células para o cérebro e espinal-medula de roedores e primatas não humanos afectados por danos inflamatória crónica experimental do sistema nervoso central (SNC).

Este método alternativo de entrega célula baseia-se na pathotropism NPC, especificamente a sua capacidade inata para (i) detectar o ambiente através de moléculas de adesão de células funcionais e receptores de citocinas inflamatórias e quimiocinas; (Ii) cruzar as barreiras anatômicas vazamento após intravenosa (iv). Ou intracerebroventricular (ICV) de injecção; (Iii) se acumulam no nível do sítio perivascular múltiplo (s) do cérebro e da medula espinhal dano inflamatório; e (iv) exercer notável trófico tecidual e os efeitos de regulação do sistema imunológico em diferentes células alvo hospedeiro in vivo.

Aqui vamos descrever os métodos que desenvolvemos para a iv. e <em> entrega icv de NPCs singênicos em camundongos com encefalomielite autoimune experimental (EAE), como modelo de desmielinização inflamatória crônica do SNC, e prevê a entrega de células-tronco sistêmica como uma técnica valiosa para o direcionamento seletivo do cérebro inflamado em neurologia regenerativa.

Introdução

Fortes evidências surgiu a partir de estudos in vivo que comprovem a eficácia terapêutica do transplante de células-tronco somáticas neurais / precursoras (NPCs) em modelos animais de doenças do SNC, ^1-8. No entanto, uma série de questões relacionadas com a entrega de células-tronco para o acolhimento exigir uma análise cuidadosa antes de estes resultados experimentais podem ser traduzidos em aplicações clínicas. Um obstáculo particularmente importante para o desenvolvimento de terapias com células estaminais restauradores (nonhematopoietic) para, doenças cerebrais inflamatórias crônicas multifocais é a identificação da rota ideal de injeção NPC. Uma sólida compreensão da fisiopatologia da doença-alvo (focal ou multifocal; degenerativa inflamatória ou primária primária), e uma análise cautelosa de questões de viabilidade e de risco associados com as técnicas de entrega são em identificar o protocolo ideal para a entrega de células-tronco.

Embora o foco ( Por ex. no parênquima do sistema nervoso), transplante de células estaminais é uma abordagem lógica para o tratamento de doenças do sistema nervoso central caracterizadas por áreas espacialmente confinados de dano (por exemplo, doença de Parkinson e doença de Huntington, do cérebro e da medula espinhal lesões traumáticas, e acidente vascular cerebral), a mesma abordagem pode ser ser praticamente inviável em condições como esclerose múltipla, onde um dano multifocal, crônica, e espacialmente disseminada CNS acumula ao longo do tempo. Neste último caso, visando injeções de células focais de lesões individuais, também é prejudicada pela capacidade limitada de NPCs transplantadas para migrar por longas distâncias dentro do parênquima do SNC, levando, assim, a identificação de métodos alternativos, mais adequados de CNS alvejando com transplantes NPC menos invasivas .

Grande promessa surgiu a partir das observações que NPCs como alvo um tumor intracraniano (por exemplo. Glioma) em camundongos quando injetada por via intravenosa fora do CNS9. Seguindo este seminalem evidência in vivo da pathotrophism células-tronco ^10, os dados extensos foram acumuladas pertencente à viabilidade e à eficácia terapêutica do transplante de NPCs sistémica em animais de laboratório com encefalomielite auto-imune experimental (EAE), como um modelo de lesão inflamatória do SNC, através quer intravenosa (iv) ou intracerebroventricular (ICV). NPC injeção ^{1,2,5,6,8 ..} Temos mostrado pela primeira vez que esta depende da capacidade de NPCs transplantadas para atacar e entrar no CNS inflamada, e se envolver posteriormente intercelular múltipla programas de comunicação dentro de microambientes específicos in vivo ^11. A fim de orientar especificamente o CNS, NPCs são entregues diretamente no líquido cefalorraquidiano (LCR) circulação por injeção icv, ou na corrente sanguínea através de injeção intravenosa. Uma vez que entra ou da corrente sanguínea ou CSF, NPCs transplantados interagir ativamente como hematoencefálica (BBB) ​​ou (BCSFB) barreiras sangue líquido céfalo-raquidiano e entrar no parênquima do SNC. Essa interação entre o enxerto NPC eo BBB (ou BCSFB) é regulada pelo conjunto específico de moléculas de adesão celular NPC superfície (CAMs) e facilitado pela expressão de altos níveis de CAM contra-ligantes em ativados endoteliais / células ependimárias ^12-14. Exemplos destas CAMs incluem o receptor de hialuronato, CD44, e a molécula de adesão intercelular (ICAM) -1 ligando antigénio muito tardio (AMT) -4 ^5,15,16 (que, em leucócitos, são responsáveis ​​da interacção com ependimária activada e células endoteliais), e para um antigénio de Linfócitos muito menor extensão associada à função (LFA) -1 e P-selectina glicoproteína ligando (PSGL) -1. NPCs também expressar uma grande variedade de receptores de quimiocinas, incluindo CCR1, CCR2, CCR5, CXCR3, CXCR4 e (mas não expressam CCR3 e CCR7), que são funcionalmente activos, tanto in vitro como in vivo, ^5,16. Assim, systemicaNPCs lly injectados usar estes CAMs, juntamente com a proteína G de receptores acoplados (GPCRs), para acumular a nível do CNS inflamado. Por outro lado, NPCs injetado sistemicamente em ratos saudáveis ​​não entram no CNS via vascular ou cefalorraquidiano rotas espaço fluido ^2. Inflamação do SNC, ou endotelial / ativação de células ependimária seguinte citocina sistêmica ou lypopolisaccharide (LPS) de injeção como um modelo de encefalite induzida quimicamente, é necessário que o acúmulo de NPCs sistemicamente injetadas no cérebro e medula espinhal ^2. Assim, segmentação bem sucedida do CNS com terapias NPC sistêmicas depende da identificação de uma janela específica doença de oportunidade (WoO), no qual o cérebro ea medula espinhal são ambiente propício para a acumulação e migração transendotelial de NPCs. Tais condições geralmente surgem no contexto de inflamação aguda e subaguda ^17. Depois de ter entrado no CNS, transplantado NPCs indiferenciadasforam mostradas para melhorar as características clínico-patológicos de ratinhos, assim como maiores, primatas não humanos com EAE. Este tem sido descrito para ser dependente de substituição de células mínimo ² e notável secreção de fatores parácrinos imunes reguladoras e neuroprotetores dentro perivascular CNS ^2,5,6,18 vs não-SNC áreas inflamadas ^19,20 (por exemplo, linfonodos), em resposta à sinalização celular inflamatória provocada pela infiltração de células imunes ^5.

Aqui nós descrevemos os aspectos metodológicos fundamentais da injeção sistêmica de NPCs somáticas em um modelo do rato de EAE crónica. Mais especificamente, vamos definir os protocolos que estabelecemos para (i) derivam, expanda e se preparar para o transplante NPCs somáticas da zona subventricular (SVZ) de adultos C57BL / 6; (Ii) induzir a EAE crónica em tais ratinhos e (iii) realizar terapeuticamente eficaz sistémica (iv ou icv) NPC transplante icamundongos nto EAE.

Protocolo

Todos os procedimentos que envolvem animais são realizadas de acordo com os princípios de cuidados com animais de laboratório aprovadas pelo UK Home Office sob os animais (procedimentos científicos) Act 1986 (PPL n º 80/2457 de SP).

1. Derivação de células-tronco somáticas neurais / progenitoras (NPCs) da zona subventricular (SVZ) do cérebro de ratos adultos

1. Elaboração de instrumentos de dissecção e mídia
   NB: Estas duas soluções devem ser preparadas 1-2 horas antes de instrumentos dissecções estão prontos e pré-aquecido a 37 º C, pelo menos 20-30 min antes do uso (que ajuda a diluir a papaína e otimiza a atividade enzimática).
   
   1. Autoclave uma tesoura reta, uma pequena tesoura cirúrgica e duas pequenas pinças serrilhadas curvas.
   2. Solução 'digestão': Prepare dois separados tubos de 50 ml com:
      Solução 1: 25 ml de Solução Salina Equilibrada de ácido etilenodiaminotetracético (EBSS) + 10 mg (EDTA) + 10 mg L-cisteína de Earle;e
      Solução # 2: 25 mL de EBSS + 50 mg de papaína.
   3. Prepare 'Meio Completo Crescimento' (CGM): rato meio basal de rato completo com suplementos de proliferação, 0,002% de heparina, factor de crescimento de fibroblastos básico (bFGF, 10 ng / ml), factor de crescimento epidérmico (EGF, 20 ng / ml), e antibióticos (Pen / Strep).
2. Dissecção do cérebro
   NB: A remoção dos ossos temporais podem facilmente danificar o tecido devido à sua nitidez. Para evitar isso, fixar firmemente os ossos com os fórceps e puxar para fora até que o osso inteiro foi removido.
   
   1. Para cada preparação de NPCs, abate por deslocamento cervical n = 5-7, 4-8 semanas de idade camundongos C57BL / 6.
   2. Limpe com etanol 70% (em água) o cabelo dos ratos abatidos e cortar atrás das orelhas com a tesoura reta para remover a cabeça;
   3. Fazer uma incisão na linha média, usando uma pequena tesoura cirúrgica para cortar a pele sobre o crânio. Usando a pinça, dobre as duas manchas de pele para exposiçõesenviar um e do crânio.
   4. Com a pequena tesoura cirúrgica realizar dois cortes pequenos na base do crânio e remover os ossos sob a ponte / medula (crânio ventral). Vá retirando os ossos temporais. Com a mesma tesoura de realizar um corte ao longo de todo o crânio, iniciando a partir da base para as lâmpadas, sem danificar a superfície do cérebro. Além disso, executa um corte entre os ossos frontal e os olhos, para facilitar a remoção dos ossos parietais. Com duas pinças de iniciar a remoção do crânio, puxando cada um dos ossos parietais para o exterior. Enquanto puxa, preste atenção às meninges, que pode danificar o cérebro quando os ossos estão sendo removidos.
   5. Uma vez que o crânio foi removido, a pinça deslize entre o cérebro e do crânio para separar completamente as meninges esquerda. Levante cuidadosamente o cérebro do crânio. Cortar os nervos ópticos para libertar o cérebro e, finalmente, recolher o cérebro em um tubo com fosfato fria salina tamponada (PBS).
   6. Mantenha o tubo em gelo umad Repita o mesmo procedimento para todos os ratos.
3. Dissecção da SVZ, neurosphere formação e manutenção ensaios
   Número de células x fator de diluição x 10 ⁴
   
   Onde 10 ⁴ representa a conversão do volume total da câmara de hematocytometer (volume total = 0,1 mm ³ -> 10-4 cm ³ -> 10-4 ml). Ao considerar o factor de diluição, tanto a um feito com CGM e com o corante vital têm de ser tomadas em consideração. Como um exemplo, se as células 160 foram contadas nas quatro esquinas, a densidade final (células / ml) de suspensão de células será:
   
   160/4 x 5 (diluição com CGM) x 2 (diluição com corante vital) x 10 ⁴
   
   1. Ligue um capuz dissecação equipado com um microscópio de dissecação.
   2. Limpar todas as superfícies com etanol a 70% (em água), e pulverizar com uma solução anti Mycoplasma para diminuir o risco de contaminação.
   3. Coberturao fundo de uma taça com uma gaze estéril (para preservar instrumentos afiadas) e preenchê-lo com etanol a 70% (em água). Mergulhe no copo de dois pares de fórceps, um par de micro tesoura e uma lâmina cirúrgica.
   4. Coloque todo o cérebro na matriz cérebro-fatiador.
   5. Usando duas lâminas de barbear realizar uma coronal seccionar 2 mm da câmara anterior do cérebro, excluindo as vias ópticas, e 3 mm posterior ao corte anterior; e colocar o tecido em um prato limpo Petri.
   6. Sob o microscópio de dissecação isolar o tecido SVZ e cortada em pedaços de 1 ^mm3 utilizando uma tesoura iridectomia. Repita o procedimento para todos os cérebros.
      1. Misture bem as duas soluções (seção 1.1.2) acima e filtrar através de um filtro de 0,22 imediatamente após os cérebros são dissecados e as SVZs está pronto para ser digerido.
   7. Transferir as secções em 30 ml de solução 'A digestão', ressuspender cuidadosamente com uma pipeta a10 ml e incubar 30 min a 37 ° C em 5% de CO _2. A cada 15 min agitar suavemente o tubo 2-3x.
   8. Centrifugar a 300 xg durante 10 min.
   9. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 200 ul de CGM pipetando primeiro com um P1000 e, em seguida, com uma pipeta de P200 (10-20x cada), até se obter uma suspensão de célula única.
   10. Tome a suspensão até 5 ml com CGM e transferir para um balão T25 cm ^2.
   11. Após 5-7 dias in vitro (DIV) neuroesferas formarão. Recolha a suspensão para um tubo de 15 ml e centrifugar 10 min a 150 x g.
   12. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 200 ul de CGM.
       Dissociar a neurospheres mecanicamente por passagem a células 100-150x com uma pipeta P200, até obter uma suspensão única célula e levá-la até 1 ml com CGM.
   13. Dilui-se a suspensão de células, por exemplo, 10 ul de suspensão de células em 40 ul de CGM para obter uma diluição de 1:5, e misturar bem. Misturar 10 ml da dilutsuspensão de células e com 10 ul de um corante vital e misturar bem.
   14. Encha uma câmara de contagem hemocitômetro com 10 ml de uma suspensão de células 01:01: solução corante vital. Separadamente contar o número de (azuis) de células vivas (branco) e mortos nos 4 quadrados de canto. Para determinar o número de células / ml, aplique o seguinte cálculo:
   15. Ressuspender 2 x 10 ⁵ células em 5 ml de CGM e transferir para um frasco T25 cm ^2;
   16. Repita seções 1.3.11-1.3.12 cada 4-5 DIV. A partir da segunda passagem de expansão em diante, avaliar a viabilidade celular por exclusão com corante vital e começar a construir-se uma curva de crescimento contínuo por plaqueamento a uma densidade clonal NPCs (8000 células/cm2), tal como descrito ^21. Mantenha o número de células e repetir o procedimento a cada 4-5 DIV. Para gerar uma curva de crescimento contínuo, proceda da seguinte forma:
       NB: Para ter uma boa preparação celular, após 4-5 esferas DIV deve ter alcançado um diâmetro de 150-200 m. Para ter uma boa estimativa de tele densidade celular, é importante encontrar um factor de diluição óptima, a fim de ter bem distribuídas, as células que não se sobrepõem ao longo do hematocytometer. Idealmente, deveria estar entre 50-200 células totais. Quando a contagem, apenas as células que fazem parte do quadrado, sem tocar as bordas tem que ser considerada. Além disso, a viabilidade das células é um factor crucial ter uma preparação saudável. É importante, que deve ser maior de 90%. A curva de crescimento linear é outro indicador de uma preparação de células saudáveis.
       
       1. Contar o número de células vivas e mortas (por exemplo, 1,3 x 10 ^6).
       2. Definir a taxa de crescimento da divisão do número de células vivas pelo número de células plaqueadas (por exemplo, 1,3 x 10 ^6/2 x 10 ⁵ = 6,5).
       3. Calcular o número total de células através da multiplicação da taxa de crescimento para o número total de células presentes no ponto de tempo anterior (no início = 2 x 10 ^5).
       4. Indicar a média7; desvio padrão para construir uma linha de tendência linear.
   17. Começando a partir da passagem 6, a dissociação mecânica é substituído por dissociação enzimática. Após centrifugação a 150 xg durante 10 min, remover o sobrenadante, ressuspender o sedimento em 200 ul de solução de dissociação de agregados de células, ressuspender 7-8x com um P200 e incubar 10 min a 37 ° C, 5% de CO _2.
   18. Ressuspender 7-8x com P200 para se obter uma suspensão de células única e adicionar 800 ul de CGM. Contar as células (tanto vivos e mortos) e estabelecer a sua viabilidade. Ressuspender 2 x 10 ⁵ células em 5 ml de CGM e transferência para um frasco T25 cm ^2.
4. Transdução viral de NPCs para rastreamento de células in vivo
   NB: Para verificar a eficiência da transdução viral, construir uma curva de crescimento paralelo com NPCs transduzidas e nontransduced. Além disso, a eficiência clonal, que é o número absoluto de células formadoras de neuroesferas presente dentro de uma preparação de célulasção ou uma análise do ciclo celular por conteúdo de DNA (com iodeto de propídio, PI), podem ser utilizados como novas indicações sobre o estado celular. Se a percentagem de células infectadas não deve ser boa, o protocolo de transdução virai pode ser repetido uma segunda vez com a mesma população de células. Uma vez que o nível de infecção é satisfatória e que a curva de crescimento é semelhante à obtida com as células de tipo selvagem, NPCs transduzidas pode ser expandida e / ou transplante.
   
   1. Colher as neuroesferas e se obter uma suspensão de célula única. Placa as células a uma densidade elevada (1,5 x 10 ⁶ células num frasco T75 cm ²⁾ em 10 ml de CGM.
   2. Após 12 hr adicionar 3 x 10 ⁶ TU / ml de uma terceira geração pRRLsin lentiviral vetor. PPT com hCMV engenharia com a E. coli derivado de β-galactosidase (lacZ) ou com a proteína verde fluorescente (GFP).
   3. 48 horas mais tarde, a colheita de células, centrifugar a 300 xg durante 10 min e replate as células em uma relação de 1:1.
   4. Depois3 passagens in vitro verificar a eficiência da infecção. A citometria de fluxo é utilizada para testar a eficácia de infecção, e a um nível satisfatório de infecção é geralmente aceite como sendo na gama de 75-95% de células positivas. Verificar novamente a eficiência da infecção depois de três passagens adicionais de expansão para verificar a manutenção da expressão do marcador.
5. Neurosphere congelamento
   1. Colher as neuroesferas a partir de um frasco de T25 cm ^2, centrifugar a 300 xg durante 10 min, e desprezar o sobrenadante.
   2. Ressuspender o sedimento em 1 ml de meio de congelação (CGM com 10% de dimetilsulfóxido (DMSO).
   3. Coloque as criotubos a -80 ° C dentro de um recipiente de congelamento.
   4. Após pelo menos 24 horas mover as células para um cryobox e armazenar a -80 ° C, durante meses, ou levar a azoto líquido _(N2), para um armazenamento mais prolongado.
6. Neurosphere descongelamento
   NB: Para evitar os efeitos tóxicos do contato prolongado of NPCs com DMSO, o processo de descongelação deve ser tão rápida quanto possível.
   
   1. Retirar o frasco de congelação do -80 ° C / N ₂ e mantê-lo em gelo seco.
   2. Descongelar rapidamente o frasco em um banho de água, até que quase toda a suspensão de células é descongelada e apenas uma pequena parte da suspensão gelada permanece.
   3. Ressuspender a suspensão de células com 5 ml de pré-aquecido fresco CGM.
   4. Centrifugar a 300 xg durante 10 min.
   5. Remover o sobrenadante, ressuspender cuidadosamente com 5 ml de fresco CGM e placa da suspensão de células em um frasco limpo, sem tratamento T25 cm ^2.
7. 1.7) NPC caracterização
   NB: A última lavagem de PBS pode ser substituído por 0,05% de azida de sódio-fosfato de modo a impedir o crescimento de fungos ou de contaminações e, coverslides são armazenadas a 4 ° C durante 2-3 semanas.
   
   NB: A mancha de marcadores intracelulares, adicionar um agente de permeabilização de PBS na solução de bloqueio. Se a fonte do anticorpo primário é de cabra, soro de bovino Albumin (BSA) ou de soro de cabra diferente deve ser usado.
   
   NB: A mancha de marcadores intracelulares utilizar um agente de permeabilização da solução de anticorpo primário.
   
   1. Colocar um vidro coverslide 13 milímetros na parte inferior de uma placa de 24 poços. Adicionar 150 ul de solução de revestimento sobre a parte superior de cada coverslide para criar uma pequena gota. Incubar durante pelo menos 30 min a 37 ° C, 5% de CO _2.
   2. Colher as neuroesferas e dissociar a obter uma suspensão de célula única.
   3. Contagem de células vivas e diluir para obter 80.000 cells/35 mL. Retire o excesso de solução de revestimento do coverslide por aspiração suave, e placa 35 mL de suspensão de células.
   4. Incubar 25 min a 37 ° C, 5% de CO _2. Rapidamente verificar ao microscópio de contraste de fase, se as células começaram a aderir.
   5. Preparar o meio de diferenciação através da mistura de meio basal do rato com os suplementos apropriados (ver Tabela 1) e antibióticos (PEn / Strep).
   6. Adicionar 400 ul de meio de diferenciação e incubar a 37 ° C, 5% de CO _2.
   7. Após 3 DIV, a mudança da metade do meio com meio de diferenciação fresco.
   8. Após 6 DIV, o meio de remover e lavar uma vez com PBS. Sob um capuz químico remover o PBS e adicionar 300 mL de pré-aquecido paraformaldeído 4% (PFA) 4% de sacarose. Incubar durante 5 min a temperatura ambiente (RT). Remover o PFA e lavar 3x com PBS.
   9. Para prosseguir com a imunocitoquímica, remover o PBS e bloquear com PBS a 10% de soro de cabra normal (NGS) (solução de bloqueio), e incubar 1 hora à temperatura ambiente.
   10. Remover a solução de bloqueio e adicionar o anticorpo primário desejado diluída com PBS 1% NGS. Incubar a 4 ° CO / N ou, alternativamente, de 120 min à temperatura ambiente.
   11. Após a incubação, lavar 2x com PBS. Incubar com o anticorpo secundário adequado diluída com PBS 1% NGS. Incubar 60 min a RT.
   12. Lavar 2x com PBS e contra-manchar os núcleos com 4 ',6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) diluído 1:20000 em PBS agente de permeabilização de 3 min à temperatura ambiente no escuro. Lavar duas vezes com PBS e uma vez com água destilada.
   13. Coloque uma gota de meio de montagem sobre uma lâmina de vidro e tecido com uma pinça montar o coverslide com as células de frente para o meio de montagem. Pressione suavemente o coverslide para espremer o excesso de meio de montagem. Deixar a coverslide no escuro à temperatura ambiente, até o meio de montagem é seca e armazenar a 4 ° C.

2. Mielina Oligodendrocyte glicoproteína (MOG) induzida por auto-imunidade experimental em camundongos C57BL / 6

1. Preparação da emulsão
   1. Em um copo de vidro de preparar uma emulsão composta de adjuvante incompleto de Freund contendo 4 mg / ml de Mycobacterium tuberculosis [outra forma definido como Adjuvante Completo de Freund (CFA)] e 200 mg de MOG (de péptido 35-55), tendo em conta que a quantidade total de emulsão por rato será de 300 mL.
      NB: aproprcontroles te de camundongos imunizados em MOG-CFA são ratos imunizados com apenas CFA. A variância esperada de início da doença nos ratinhos imunizados MOG é de 11,3 (± 1,8) dpi.
      
      NB: Ao calcular o volume total de emulsão necessário, considerar o dobro do volume que o número de ratos para imunizar. Material de vidro deve ser preferido a Plasticware para minimizar o desperdício de parte da emulsão.
      
      1. Com uma seringa de vidro segurando uma mistura 19 G agulha por cerca de 30 min, mantendo sempre a emulsão no gelo.
      2. Para verificar se a emulsão está pronto, cair uma pequena quantidade de emulsão em água. A emulsão está pronto para ser injectado apenas se a quebra permanece como está e não se dispersa.
      3. Imunizar o grupo de ratos de controlo apenas com CFA. Trate camundongos experimental (MOG imunizados) com MOG no CFA. A variação esperada de início da doença em camundongos imunizados MOG é de 11,3 (± 1,8) dpi.
   2. Transferir a agulha 19 G para uma seringa de plástico de 1 ml de umand aspirar a emulsão. Evitar bolhas, mudar a agulha com um 25 L e deixar a seringa no gelo. Seringas preenchidas com a emulsão está pronto para ser utilizado e deve ser mantido no gelo por um par de horas.
2. Imunização
   1. Coloque os ratos (6-8 semanas de idade, do sexo feminino) em uma caixa de aquecimento e aguarde cerca de 10 minutos para permitir que a veia da cauda para dilatar.
   2. Transferir um rato na caixa de aquecimento a um limitador mouse. Feche o limitador para evitar qualquer movimento do mouse.
   3. Encher uma seringa de insulina de 1 ml com 100 ml de toxina da tosse convulsa (5 ug / ml), evitando fazer bolhas. Injectar-se lentamente a solução na veia da cauda. Retire a agulha e pressione por alguns segundos com um pedaço de papel para tapar o sangramento.
   4. Colocar o rato volta na gaiola e repetir o mesmo procedimento para todos os ratinhos.
   5. Anestesiar um rato com a inalação contínua isoflurano (1-2%, 2 L / min) e injectar 100 ul da emulsão por via subcutânea no níveldos dois flancos e a base da cauda (300 emulsão ul / ratinho). Lentamente, remover a seringa, evitando a fuga da emulsão.
   6. Marque com o mouse com um perfurador de ouvido, coloque os ratos na gaiola e deixe até a recuperação completa. Repetir para todos os ratinhos.
   7. Depois de 48 horas (2 dias após a imunização, dpi) seção de repetição 2.2.3.
3. Análise comportamental de ratos EAE
   1. A partir de 5 dpi, pesar os ratinhos diariamente e monitorar os seus desempenhos do aparelho locomotor, utilizando o sistema de pontuação escala descrita na Tabela 1.

3. Injeção de células-tronco neurais / progenitoras na veia da cauda (iv)

1. Preparação celular
   1. Neuroesferas colheita por centrifugação a 300 xg durante 10 min.
   2. Remover o sobrenadante e adicionar 200 mL de solução de dissociação de agregados de células. Incubar 10 min a 37 ° C, 5% de CO _2.
   3. Delicadamente ressuspender 10 12x (avoidinbolhas de g) com um P200 até a obtenção de uma suspensão de células individuais e levar para 800 mL com meio basal, sem Ca ^{2 +} e Mg ^{2 +.}
   4. Contar as células usando um corante vital para testar a viabilidade das células e dilui-se a suspensão com o meio basal sem Ca ^{2 +} e Mg ^{2 +} para se obter uma densidade final de 10 ⁶ células/150 ul. Manter a suspensão de células em gelo até à utilização.
2. NPC injeção iv
   NB: A dissociação ideal em suspensão única célula ea ausência de bolhas de ar são dois aspectos importantes a considerar para reduzir o risco de qualquer clumps / agregados vs formação êmbolos que pode resultar em oclusão da veia ea consequente morte.
   
   1. No pico da doença (16-18 dpi), pesar e marcar os ratos. Distribua os camundongos de acordo com sua pontuação, a fim de que os grupos homogêneos.
   2. Coloque os camundongos em uma caixa de aquecimento e aguarde cerca de 10 minutos para permitir que a veia da cauda para dilatar.
   3. Transferir um rato na caixa de aquecimento a um limitador mouse. Feche o limitador para evitar qualquer movimento do mouse.
   4. Encha uma seringa de 1 ml de insulina com 150 mL de suspensão celular e certifique-se de remover todas as bolhas. Injectar-se lentamente a solução para dentro da veia da cauda. Retire a agulha e pressione por alguns segundos com um pedaço de papel para tapar o sangramento (Figuras 6A e 6B).
   5. Posicione o mouse na gaiola e deixe até a recuperação. Repetir o mesmo procedimento para todos os ratinhos.

4. Injeção de células-tronco neurais / progenitoras para a Cisterna Magna (ICV)

1. Preparação celular
   1. NPCs colheita por centrifugação a 300 xg por 10 min.
   2. Remover o sobrenadante e adicionar 200 mL de solução de dissociação de agregados de células. Incubar 10 min a 37 ° C, 5% de CO _2.
   3. Delicadamente ressuspender 10 12x com um P200, até a obtenção de um único csuspensão ell e levar para 800 mL com meio basal sem Ca ^{2 +} e Mg ^{2 +.}
   4. Contar as células e dilui-se a suspensão com o meio basal sem Ca ^{2 +} e Mg ^{2 +} para se obter a densidade de células desejada. Manter a suspensão de células em gelo até à utilização.
2. 4.2) NPC injeção icv
   1. No pico da doença (16-18 dpi), pesar e marcar os ratos. Distribua os camundongos de acordo com sua pontuação, a fim de que os grupos homogêneos.
   2. Posicione o mouse em um aparelho estereotáxico sob inalação contínua isoflurano (1-2%, 2 L / min). Proteja a cabeça do rato com as barras de ouvido. Em seguida, ajuste a boca eo nariz peças. Certifique-se que a cabeça do rato é plana e fixa.
   3. Pincelar a cabeça do rato com povidona-iodo (PVP-I) e fazer uma incisão para cortar a pele na parte posterior da cabeça para expor o crânio.
   4. Usando um micromanipulador, insira a ponta de um microlseringa de iter para a fenda entre o occipital e da vértebra atlas através dos músculos intactos e ligamentos na linha média na parte de trás do pescoço. A parte dobrada da agulha é mantida em contacto íntimo com a superfície interna da região occipital a todo o comprimento, conforme descrito ^22.
   5. Insira lentamente a agulha e esperar alguns segundos. O operador destina-se a aprender a reconhecer a sensação da agulha estar "viciado" no crânio mouse, antes de começar a injetar a preparação celular. Injectar lentamente o volume de células (dentro de 3-5 min). Deixe a agulha no local durante alguns segundos adicionais após a injecção e retirar lentamente a seringa.
   6. Costurar a pele e coloque o rato em uma gaiola de recuperação até a recuperação completa.

5. Processamento de Tecidos

1. Profundamente anestesiar os ratos com uma mistura de 0,5 ml de cetamina (100 mg / mL), 0,25 mL de xilazina (23,32 mg / ml) e 4,25 ml de água estéril e transcardically perfundir, wincineração com solução salina-EDTA e fixação com PFA 4%. Retirar as colunas vertebrais e cérebros e sufixo em PFA a 4% durante 12 horas a 4 ° C. Lavar o tecido em PBS, remover as medulas espinais dos ossos e deixar o tecido, pelo menos, 48 ​​h em sacarose a 30% (em PBS) a 4 ° C. Incorporar os tecidos da temperatura de corte ideal (OCT) composto e encaixe congelamento com nitrogênio líquido, conforme descrito ^2.
2. Use um micrótomo para cortar os tecidos em 10-12 ^ M fatias grossas.
3. Alternativamente, incorporar tecido fresco em agarose e cortar o tecido usando um vibratome 50-80 ^ M fatias grossas.
4. Em ambos os casos, incubar O / N a 37 ° C numa solução de D-galactopiranosido (X-gal), para detectar a actividade β-galactosidase nuclear-cloro-3-indolil-β 5-bromo-4.
5. Recorte de seções contendo β-gal + células com 5 mm fatias e duplo mancha usando proteína ácida fibrilar antiglial (GFAP) para astrócitos (50 mg / ml), antígeno nuclear antineuronais (NeuN) para os neurônios (1 e# 956; g / ml) e antiNestin para células neurais indiferenciadas (10 ug / ml).
6. Proceder conforme descrito nas seções 1.7.11 e 1.7.12. Para várias colorações certifique-se usar anticorpos secundários conjugados com diferentes fluoróforos.
7. Para tecidos que contêm células GFP rotulados proceda como explicado nos passos 5,1-5,3 e prossiga com as múltiplas colorações.
8. Adicione algumas gotas de meio de montagem para os slides e cobrir com uma lamela de tecido.
9. Para cortes corados com anticorpos conjugados biotina preparar uma solução do complexo avidina biotina (ABC solução, ver Tabela 2) e deixar em agitação por 45 min.
10. Incubar a fatias de 5 min com 1% _de H ₂ O ₂ para bloquear a actividade da peroxidase endógena.
11. Lavar duas vezes com PBS.
12. Incubar com solução ABC durante 1 hora à TA.
13. Lavar duas vezes com PBS.
14. Incubar com uma solução de 3,3 '-diaminobenzidina e 0,3% _de H ₂ O _2. Monitorar a un reaçãoder um microscópio e lavar com PBS, logo que a fatia de começar a ficar castanho (geralmente em torno de 5-10 min).
15. Lavar duas vezes com PBS e proceder conforme descrito no passo 5.7.

Lista detalhada de materiais e reagentes é mostrada na Tabela 2.

Resultados

NPC derivação e caracterização
Dissecções SVZ são realizadas em piscinas (n = 5-7 ratinhos / piscina) de 6-8 semanas de idade C57BL / 6 ratos por meio de dissociação mecânica e enzimática (Figura 1A). Depois de alguns dias de cultura em CGM, neuroesferas flutuantes começar a formar (Figuras 1A e 1B). Esferas primárias são recolhidos e mecanicamente passada casa 4-5 DIV. Após passagem, o número de células vivas e mortas são verificadas e os números de células cumula...

Discussão

Terapias baseadas em células estaminais somáticas estão emergindo como uma das estratégias mais promissoras para o tratamento de distúrbios do sistema nervoso central inflamatórias crônicas, como MS2 ^11. Embora os mecanismos que sustentam os seus efeitos terapêuticos ainda precisam ser completamente elucidada, o impacto significativo do transplante NPC em diferentes modelos experimentais de doenças neurodegenerativas deu origem à crença um tanto provocante que as células estaminais podem em breve ser aplicado...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Cultura de células
EBSS	Sigma	E2888
L-Cisteína	Sigma Aldrich	C7352
Papain	Worthington	30H11965
EDTA	Fisher Scientific	D/0700/50
Mouse NeuroCult meio basal	Tecnologias de células-tronco	05700
Suplementos de proliferação NeuroCult	Stem Cell Technologies	05701
Heparina	Sigma	H3393
Fator básico de crescimento de fibroblastos	Peprotech	100-18B-1000
Fator de crescimento epidérmico	Peprotech	AF-100-15-1000
Caneta / Strep	Invitrogen	1514012
Matrigel (solução de revestimento)	BD Biosciences	354230
NeuroCult® Kit de diferenciação (Mouse)	Stem Cell Technologies	05704
Accumax	eBioscience	00-4666-56
PBS de Dulbecco (DPBS) (10x) sem Ca e Mg	PAA Laboratories	H15-011
Myco trace	PAA Laboratories	Q052-020
Dimetilsulfóxido (DMSO)	Sigma	D2650
Imunofluorescência
Soro de cabra normal	PAA Laboratories	B11-035
Polietilenoglicol p- (1,1,3,3-tetrametilbutil)-éter fenílico	Sigma Aldrich	T8787
Rato anti Nestin	Abcam	ab11306
Coelho anti GFAP	DAKO	203344
Rato anti histona H3 (fosfo S10)	Abcam	ab14955
Coelho anti MAP-2	Abcam	ab32454
Rato anti MBP	AbD SEROTEC	MCA409S
Anticorpo anti-O4, clone 81 | MAB345	Millipore	MAB345
DAPI	Invitrogen	D1306
Solução de montagem	DAKO	S3023
EAE
Freund's Adjuvant Incompleto	Sigma Aldrich	F5506
Mycobacterium tuberculosis	DIFCO	H37Ra
MOG(35– 55)	Espikem
Pertussis	Laboratórios Biológicos	181
Processamento de tecidos
Iris tesoura reta	Ferramentas de Ciências Finas	14060-09
Pinça romba/dobrada	Ferramentas de Ciências Finas	11080-02
Fatiador de cérebro	Zivic Instruments	BSMAS005-1
Lâminas cirúrgicas	Swann-Morton	324
P200, P1000 pipetas
Cetamina (Vetalar)	Boehringer Ingelheim	01LC0030
Xilazina (Rompun)	Bayer	32371
Quadro estereotáxico	KOPF	Modelo 900
Seringa Hamilton		7762-04
PK-6100		vetor do jogo da elite ABC
do Sigma 158127 de PFA) do Sigma do paraformaldeído (PFA)