Um método de precipitação de modificação para isolar exossomas urinária

Summary

Este manuscrito descreve um protocolo para isolar exossomos da urina humana usando uma técnica de precipitação modificada.

Abstract

A identificação de biomarcadores que permitem a detecção precoce de doenças renais na urina e no plasma tem sido uma área de interesse ativo há vários anos. As vesículas do exossomo urinário, com 40-100 nm de tamanho, são liberadas na urina em condições normais por células de todos os segmentos de néfrons e podem conter proteínas, mRNA e microRNA representativos de seu tipo de célula de origem. Em condições de disfunção ou lesão renal, os exossomos podem conter proporções alteradas desses componentes, que podem servir como biomarcadores para a doença. Atualmente, existem vários métodos disponíveis para isolamento de exossomos urinários, e já realizamos uma comparação experimental de cada uma dessas abordagens, incluindo três baseadas em ultracentrifugação, uma usando um concentrador de ultrafiltração de nanomembrana, uma usando um reagente de precipitação comercial e uma usando uma modificação da técnica de precipitação usando o reagente ExoQuick que desenvolvemos em nosso laboratório. Descobrimos que o método de precipitação modificado produziu o maior rendimento de partículas de exossomos, miRNA e mRNA, tornando essa abordagem adequada para o isolamento de exossomos para perfis de RNA subsequentes. Concluímos que o método de precipitação de exossomos modificado oferece uma alternativa rápida, escalável e eficaz para o isolamento de exossomos da urina. Neste relatório, descrevemos nossa técnica de precipitação modificada usando o reagente ExoQuick para isolar exossomos da urina humana.

Introduction

Exosomes urinário são pequenas vesículas internas de 100 nm de corpos multivesiculares (MVB) derivados de todos os tipos de células em condições normais e patológicas no espaço urinário incluindo podocytes glomerular, células tubulares renais e células que revestem os sistemas de drenagem urinária que parecem ser enriquecido para miRNAs ^{1 -2.} Muitos investigadores detectaram proteínas distintas em exossomas isoladas a partir da urina de indivíduos saudáveis, bem como aqueles com insuficiência renal e / ou doenças sistemáticas ^3-5. Os exossomas podem ser isoladas utilizando métodos diferentes, tais como de dois passos de ultracentrifugação diferencial com ou sem sacarose ^6-7, combinando filtro nanomembrane com ultracentrifugação ^{8-9, 10-11} ou precipitação. Recentemente, desenvolveu um método simples, rápido, escalável e eficaz para isolar exossomos urinárias e detectar miRNA e biomarcadores de proteínas ^11. Embora biomarcadores pode ser detectada numa variedade de diferentes fluidos biológicos, urina é a escolha mais conveniente para os doentes com doenças do rim e do tracto urinário, porque pode ser obtido em grandes quantidades de forma relativamente não invasivo.

Embora existam vários métodos para isolar exossomas urinário ^6-11, o processo mais vulgarmente usado depende ultracentrifugação diferencial com uma almofada de sacarose a 30%. Enquanto este método é eficiente e a qualidade das resultantes isolados exossomas com este procedimento é alta, a técnica em si requer pessoal especializado e é, que exige vários passos de ultracentrifugação demorado. Outros métodos, tais como filtração e precipitação, têm sido desenvolvidos para o isolamento de exossomas, incluindo um que utiliza um reagente de precipitação proprietário (ou seja, ExoQuick-TC: Biosciences sistema; Mountain View, CA). Embora a precipitação utilizando este reagente é rápido e relativamente fácil, a pureza dos isolados exossomas é baixa em comparação com o met ultracentrifugaçãood. Recentemente, em comparação seis métodos para o isolamento de exossomas urinário, incluindo uma modificação do método de precipitação utilizando ExoQuick-TC que nós desenvolvemos no nosso laboratório ^11. Descobrimos que este método de precipitação modificada produziu maiores quantidades de proteína, miRNA e mRNAs e o procedimento em si foi mais rápido e mais fácil de implementar do que ultracentrifugação. Aqui, nós descrevemos o protocolo experimental do nosso método de precipitação modificado de forma gradual, e incluem uma discussão sobre as vantagens e desvantagens da técnica em comparação com outros métodos de isolamento de exossomas. O método envolve uma precipitação modificado precipitação inicial de partículas de exossoma, seguido de remoção de proteína Tamm-Horsfall, que está correlacionada com proteínas exosomal, e conhecido por reduzir a produção de urina a partir de exossoma. Descobrimos que essas modificações aumentaram o rendimento e a pureza da preparação exosomal a partir de urina.

Protocol

NOTA:. As etapas envolvidas no isolamento dos exossomas urinário, utilizando o método de precipitação modificados são ilustrados na Figura 1 Os passos iniciais envolvem a remoção de grandes células mortas e detritos celulares por centrifugação. O sedimento final obtido a partir do sobrenadante recolhido a partir de cada etapa subsequente corresponde à exosoma, que é dissolvido em solução de isolamento por extracção adicional da proteína, ARN, e ADN.

1. Coleta de Urina

1. Antes da recolha de urina, cocktail inibidor de protease de preparar de acordo com as instruções do fabricante e adicionar 3,125 ml de este cocktail para um receptáculo vazio e estéril. O tubo contendo a mistura de inibidores de protease pode então ser distribuída aos voluntários para a recolha de urina.
   Observação: A razão para a adição de inibidor de protease é o de minimizar a degradação das proteínas na amostra de urina. Apesar de termos usado especificamente um cocktail inibidor de protease deSigma, outros inibidores de protease disponíveis comercialmente pode ser substituído.
2. Recolher cerca de 10 ml de urina primeiro-void. Processar a urina imediatamente após a coleta, sem armazenamento ou refrigeração. Isolar os exossomos urinário em duplicata, utilizando o método de precipitação modificado; um de ambos os resultados para o DNA, o RNA total e a extracção de proteínas, enquanto que o outro é para a quantificação de partículas de exossoma urinário.
   NOTA: Uma amostra de urina de 24 horas pode ser recolhida para o isolamento exosome armazenando a 4 ° C.

2. remoção de restos celulares e Tamm-Horsfall Protein (THP)

1. Transferir as amostras de urina para tubos de centrífuga de 15 ml. Centrifugar 10 ml de urina em 17.000 xg durante 10 min a 37 ° C para eliminar as células e os resíduos celulares (Figura 1).
2. Usando uma pipeta, transferir o sobrenadante para um tubo fresco para processamento adicional. Ressuspender o sedimento em 500 ul de solução de isolamento (250 mM de sacarose, 10 mM que provaanolamine, pH 7,6) seguido por 10 min de incubação com DL-ditiotreitol (DTT: concentração final de 200 mg / ml) a 37 ° C.
   NOTA: DTT é adicionado para degradar THP, que aprisiona exossomos, levando à diminuição da produtividade. Tome o cuidado de deixar o pellet imperturbável durante a transferência do sobrenadante, e confirmar que o sobrenadante é claro de pellet.
3. De amostras de sedimentos de vórtice cada 2 min, até o pelete estar completamente dissolvido. Em seguida adicionar 500 ul de solução de isolamento para o sedimento dissolvido.
4. Imediatamente após a adição da solução de isolamento para o sedimento, centrifugar a 17.000 xg durante 10 min a 37 ° C. Pipeta-se o sobrenadante e combinam-se com o sobrenadante recolhido anteriormente.
5. Ressuspender o sedimento em 50 ul de solução de isolamento por análise de SDS-PAGE.
   NOTA: PBS ou TBS pode ser usado em vez de solução de isolamento para ressuspender o sedimento.

3. Isolamento de exossomo Pellet

1. Para 11 ml do supern recolhidosatant, adicionar 3,3 ml de reagente ExoQuick-TC e incubar a 4 ° C durante pelo menos 12 horas.
   NOTA: O índice de volume de sobrenadante de reagente ExoQuick-TC pode ser ajustada para aumentar ou diminuir o rendimento exosomal. Observou-se que volumes menores de reagente adicionado produzir rendimentos menores de exossomos.
2. Após a incubação, centrifugar a mistura amostra / ExoQuick-TC a 10.000 xg durante 30 min a 25 ° C.
3. Transferir o sobrenadante para um tubo fresco para a análise de SDS-PAGE.
4. O sedimento de exossoma pode ser armazenado a -80 ° C para o ADN, ARN e proteína de extracção e quantificação de partículas de exossoma utilizando ELISA CD9 ^11.
   NOTA: O sedimento exossoma pode ser armazenado a -80 ° C durante 1 ano com a congelação e descongelação limitada.

4. detecção e análise de exossomo Pellet Biomarker

1. Para as análises a jusante, extrair DNA, RNA e proteínas a partir do sedimento exossoma utilizando o / ARN / ADN kit de isolamento de proteína e um ki de isolamento de ARNt de acordo com as instruções do fabricante. Determinar as concentrações por espectrofotometria Nanodrop medindo a absorvância a 260 nm e 280 nm com 2 ul de amostra.
2. Realizar quantitativa em tempo real de RT-PCR (qPCR) utilizando ensaios microRNA TaqMan (em nosso caso, foi utilizada humanos miR-192- e específicos miR-1207-5p-ensaios) ou iniciadores específicos de miARN.
3. Para a análise de SDS-PAGE, 4-12% usar Bis-Tris gel e amostras de proteínas separadas por electroforese unidimensional. Visualizar géis utilizando o kit de coloração com prata de acordo com as instruções do fabricante.
4. Realizar a análise de Western blot utilizando membranas de PVDF de acordo com as instruções fornecidas pelo fabricante. Use anticorpo policlonal de coelho para ligados a apoptose gene-2 ​​interagindo proteína X ou ALIX e anticorpo monoclonal mouse para gene de susceptibilidade tumor 101 proteína ou TSG101 na detecção de western blot. Quantificar a densidade das bandas de acesso aberto software NIH ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/) ouum programa semelhante.
5. Quantificar o número de partículas de exossoma urinários obtidos utilizando um kit de ELISA CD9, conforme as instruções do fabricante.

Results

Exosomes urinário transportar proteínas, miRNA e mRNA biomarcadores secretadas a partir de células epiteliais renais. O isolamento e detecção destes exossomas podem fornecer uma ferramenta de diagnóstico útil para a detecção precoce de doenças renais tais como nefropatia diabética. Existem vários métodos para o isolamento de exossomas a partir de amostras de urina colhidas de indivíduos humanos. Anteriormente, em comparação seis métodos de isolamento exosome urina e investigados resultante de proteína, níveis de mRNA e ...

Discussion

A maioria dos métodos que envolvem a precipitação de exossomas a partir de urina não abordam a remoção da rede polimérica formada pela proteína Tamm-Horsfall (THP). Esta proteína está presente em grandes quantidades na urina, onde entra em armadilhas putativamente exossomas inicial durante a centrifugação a baixa velocidade. Em nosso método modificado reduzimos THP usando DTT antes da precipitação exosome. Como mostrado na Figura 2, uma quantidade mais elevada de THP foi observado na urina e não transfo...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tubo de Centrífuga Corning 15 ml	Corning (Sigma Aldrich)	CLS430791
Inibidor de Protease Coquetel	Sigma Aldrich	P8340
Centrífuga	Sorvall
DL-ditiotreitol	Sigma Aldrich	D9779	usado na concentração final de 200 mg/ml
Sistema Novex NuPAGE SDS-PAGE (4-12% Bis-Tris Gel 1,0 mm, 10 poços	Invitrogen	NP0321BOX	Para análise SDS-PAGE
ECL Advance Western blotting detection kit	GE Healthcare Life Sciences	RPN2135	Para detecção de western blot de biomarcadores
Exoquick-TC	Reagent System Biosciences (SBI)	EXOTC50A-1	Para isolamento de exossomos
Exossomo CD9 ELISA Kit Completo	System Biosciences (SBI)	EXOEL-CD9-A-1	Para quantificação de exossomos
Mini kit AllPrep DNA/RNA/Proteína	Qiagen	80004	Para DNA, RNA, isolamento de proteínas
Kit de limpeza Rneasy MinElute	Qiagen	74204
NanoDrop 2000 UV-Vis Espectrofotômetro	Thermo Scientific		para quantificação de proteínas
Kit de coloração de tira ProteoSilver	Sigma Aldrich	PROTSIL1-1KT	Para coloração de
géis SDS-PAGESistema de Eletroforese de Mini-Células Xcell SureLock	Life Technologies		Para executar os géis SDS-PAGE
Ensaios de microRNA TaqMan	Life Technologies		Para ensaios de RT-PCR
software qBasePlus v1.5	Biogazelle NV		Para análise de dados de ensaio RT-PCR
Anticorpo policlonal de coelho para ALIX	Millipore		Para detecção de western blot de biomarcadores
Anticorpo monoclonal de camundongo para TSG101	Abcam		Para detecção de biomarcadores de western blot