Métodos para a detecção quantitativa de anticorpos induzida pela ativação do complemento no Glóbulos Vermelhos

Summary

Aqui nós descrevemos dois ensaios para medir a ativação do complemento induzida por anticorpos contra células vermelhas do sangue. A vantagem principal sobre os ensaios actuais é a sua natureza quantitativa e fácil de interpretar.

Abstract

Os anticorpos contra os glóbulos vermelhos (hemácias) pode levar a ativação do complemento, resultando em um procedimento acelerado através de receptores do complemento no fígado (hemólise extravascular) ou levando a lise intravascular de hemácias. Aloanticorpos (por exemplo, ABO) ou auto-anticorpos contra os antigénios de RBC (como visto na anemia hemolítica auto-imune, AIHA) que conduzem à activação do complemento são potencialmente prejudiciais e podem ser - especialmente quando conduzindo à lise intravascular - fatal ^1. Atualmente, a ativação do complemento devido a (auto)-anticorpos em hemácias é avaliada in vitro através do teste de Coombs refletindo deposição de complemento na RBC ou por um ensaio hemolítico não quantitativa refletindo de lise dos ^1-4. No entanto, para avaliar a eficácia de inibidores de complemento, é obrigatória a existência de técnicas quantitativas. Aqui nós descrevemos dois tais técnicas. Em primeiro lugar, um ensaio para detectar a deposição de C3 e C4 em células vermelhas do sangue que é induzido por anticorpos no soro de um paciente é préapresentadas. Por isso, a análise de FACS é usado com os anticorpos anti-C3 ou anti-C4 marcados com fluorescência. Em seguida, um ensaio hemolítico quantitativa é descrito. Hemólise Neste ensaio, mediada pelo complemento induzida por soro do doente é medido fazendo uso de detecção espectrofotométrica da hemoglobina libertada. Ambos os ensaios são muito reprodutíveis e quantitativa, facilitando estudos de activação de complemento induzida pela anticorpo.

Introduction

Os anticorpos contra as células vermelhas do sangue (RBC) pode ser induzida por transfusão de glóbulos vermelhos que expressam um antigénio, que não está presente em eritrócitos de destinatários. Esses anticorpos podem causar graves alo reações transfusionais hemolíticas agudas devido à ativação do complemento no seguinte transfusão ^5. Na anemia hemolítica auto-imune (AHAI), os pacientes têm auto-anticorpos contra suas próprias hemácias. Isto leva a folga acelerada das células através da interacção de IgG ligada a glóbulos vermelhos com receptores Fcy em fagócitos do baço e / ou no caso de auto-anticorpos capazes de activar o complemento por meio de recept....

Protocol

1. Preparação de tratados com bromelina Glóbulos Vermelhos

1. Glóbulos vermelhos Lave 0 tipados 3x com PBS 1x (centrifugação a 664 xg por 2-5 min).
2. Incubar 1 volume de concentrado de eritrócitos com dois volumes de uma solução bromelina 0,5% por 10 min a 37 ° C.
3. Lavar as células 3x com PBS 1x.
4. As células podem ser armazenadas como uma solução a 3% a 4 ° C em 1 x PBS durante pelo menos uma semana.

2. C3 e C4 Análise Deposição sobre GVs por FACS

1. Heat-inactivar a quantidade necessária de soro de um paciente (ou outra fonte de anticorpos anti-RBC) por aquecimento da amostra durante 30 min....

Results

Figura 2A mostra um gráfico representativo de dispersão para hemácias. Gating adequado para eritrócitos individuais pode ser vista em de FSC-W - FSC-A trama (P1). Normalmente, cerca de 95% dos GVs são abrangidas por esta porta P1 (células isoladas), mas quando uma elevada percentagem de soro do paciente é usado, este pode cair para 70-80%, especialmente quando o anti-RBC IgM está presente no soro do paciente.

Os resultados representativos para o efeito de AHAI soro do pacien.......

Discussion

Os ensaios acima são reprodutíveis e robusto. Eles são fáceis de realizar e é possível realizá-las com várias amostras ao mesmo tempo (em uma placa de 96 poços). Assim, esta abordagem também seria adequado para um sistema totalmente automatizado, por exemplo, um sistema robotizado de ELISA. Em contraste com as técnicas actualmente utilizadas, estes ensaios são quantitativos e isso irá ajudar, por exemplo, no estudo do efeito de inibidores de complemento. Além disso, a interpretação é objetiva, o que é .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS	Fresenius Kabi
BSA	Sigma	B-4287
Barbital	Fagron	0261	Este produto químico está sujeito à regulamentação de medicamentos.
Sódio Barbital	Fagron	0263	Este produto químico está sujeito à regulamentação de medicamentos.
Gelatina	Merck	1.0470.0500
Cloreto de sódio	Merck	1.06404.1000
Cloreto de Magnésio	Merck	1.05833.0250
Cloreto de cálcio	Merck	1.0238.0500
Dylight 488 corante reativo de amina	Pierce	46402
Dylight 650 corante reativo de amina	Pierce	62265
&alfa; C5 (Eculizumabe)	Alexion Pharmaceuticals
FACS (Canto)	BD		Qualquer FACS pode ser usado que tenha os lasers apropriados.
Espectrofotômetro (por exemplo, espectro Multiskan)	Thermo Labsystems	1500-193	Qualquer espectrofotômetro com a faixa de comprimento de onda correta pode ser usado
BD FACSDiva software v 6.1.2	BD	643629	Qualquer software de análise FACS compatível pode ser usado
Bromelaína	Sanquin	K1121