Isolamento e Quantificação da neurotoxina botulínica a partir de matrizes complexas usando os BoTest Matrix Ensaios

Summary

A neurotoxina botulínica BoTest Matrix (BoNT) ensaios de detecção de purificar e quantificar rapidamente BoNT a partir de uma variedade de matrizes de amostra. Aqui, apresentamos um protocolo para a detecção e quantificação de BoNT a partir de matrizes sólidos e líquidos e demonstrar o ensaio com BOTOX, tomate e leite.

Abstract

Detecção e quantificação de neurotoxina botulínica (TB) em matrizes complexas exacta é necessário para produtos farmacêuticos, ambientais e de teste da amostra de alimento. É necessário o teste rápido BoNT de alimentos durante surto forense, o diagnóstico do paciente e testes de segurança de alimentos, enquanto for necessário os testes de potência exata para fabricação de produtos à base de drogas BoNT e segurança do paciente. O bioensaio amplamente utilizado para testes de BoNT é altamente sensível, mas não tem a precisão e rendimento necessário para o teste rápido e rotineiro BoNT. Além disso, o uso do bio-ensaio de animais resultou em apelos de autoridades reguladoras de produtos de drogas e defensores dos direitos dos animais em os EUA e no exterior para substituir o bioensaio em ratos para testar BoNT. Vários ensaios in vitro de substituição têm sido desenvolvidos que funcionam bem com BoNT purificada em tampões simples, mas a maior parte não tem sido mostrado para ser aplicável a ensaios em matrizes altamente complexas. Aqui, um protocolo para a detecção deBoNT em matrizes complexas utilizando os BoTest Matrix ensaios é apresentado. O ensaio consiste em três partes: A primeira parte envolve a preparação das amostras para teste, a segunda parte é um passo de imunoprecipitação utilizando anticorpos anti-BoNT esferas paramagnéticas revestidas de anti-corpo para purificar BoNT a partir da matriz, e a terceira parte quantifica proteolítica da BoNT isolado atividade usando um repórter fluorogênico. O protocolo é escrito para o teste de alto rendimento em placas de 96 poços utilizando matrizes tanto de líquidos e sólidos e requer cerca de 2 hr da preparação manual com tempos totais de doseamento de 4-26 horas, dependendo do tipo de amostra, carga de toxinas, e sensibilidade desejada. Os dados são apresentados para BoNT / D teste com solução salina tamponada com fosfato, um medicamento, o sobrenadante de cultura, de 2% de leite, e os tomates frescos e inclui a discussão de parâmetros críticos para o sucesso do ensaio.

Introduction

Neurotoxinas botulínicas (BoNTs) são as substâncias mais letais conhecidos, com doses letais humanos intravenosos estimadas em 1-3 ng / kg ^1,2. Sete serotipos estruturalmente semelhantes de BoNT, rotulados de A a G, existem, cada um constituído por um domínio de cadeia pesada responsável pela ligação à célula, a absorção e a translocação para o citosol e uma cadeia leve que codifica uma endopeptidase de zinco ^3-5. A toxicidade requintado de BoNT resulta, em parte, a sua entrada obrigatória e específica para os neurônios motores na junção neuromuscular ^6. Uma vez dentro do neurônio, a endopeptidase cadeia leve cliva especificamente um ....

Protocol

1. Preparação de ensaio Reagentes

1. Thaw ditiotreitol 200x (DTT), 10x Matrix Binding Buffer (10x Binding seguir buffer), 10x tampão de neutralização (apenas alimentos ou de pH amostras desequilibradas) e 10x tampão de reação BoTest (doravante 10x Reaction buffer) à temperatura ambiente (RT) por 15 min ou até que esteja completamente descongelado. Ver Tabela 1 para uma lista de buffers e dos reagentes utilizados neste protocolo. Ver Tabela 2 para uma lista de materiais e equipamentos necessários para esse protocolo.
2. Agitar no vortex os buffers descongelados para 5 segundos para misturar. 10x tampão de neutralização,....

Results

Um diagrama que resume as etapas do protocolo descrito é mostrado na Figura 2. O ensaio requer entre 4-26 horas para ser concluído, dependendo do tipo de amostra e sensibilidade do ensaio desejado, mas apenas ~ 2 horas de hands-on do tempo. O ensaio é realizado em placas de 96 poços e, dependendo do tipo de teste a ser realizado, permite o teste em triplicado de uma amostra de 20, incluindo as normas por placa.

A Figura 3 mostra os resultados do ensaio usand.......

Discussion

Este protocolo descreve procedimentos para a quantificação de BoNT / A complexa, holotoxina, Clostridium ou de sobrenadante de cultura em matrizes complexas. O protocolo é o mesmo, no entanto, ao testar outros serotipos BoNT (por exemplo, de BoNT / B, E e F), com os seus respectivos ensaios de matriz ^56,60, embora a sensibilidade do ensaio irá variar entre os serotipos e ensaios. Este protocolo não conta para cada tipo de amostra possível e algumas modificações que podem ser necessárias, dep.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kit de detecção de neurotoxina botulínica BoTest Matrix A	BioSentinel	A1015	Kits de detecção para BoNT/B e F também estão disponíveis.
Leitor de microplacas de fluorescência Varioskan Flash	Thermo Fisher Scientific	5250040	A maioria das unidades baseadas em monocromador ou filtro com excitação de 434 nm e capacidade de emissão de 470 nm e 526 nm podem ser usadas.
Placa de separação de esferas magnéticas de 96 poços	V & P Scientific	VP771H	Outras placas magnéticas podem ser usadas, mas a placa deve ser projetada para separar as contas ao lado do poço.
Arruela de Placas Compatível com Contas Magnéticas	BioTek	ELx405 VSRM	Opcional, necessário apenas para lavagem automatizada de placas.  Outras arruelas de placa compatíveis com contas magnéticas também podem ser usadas, mas devem ser testadas antes do uso.
Microcentrífuga			Opcional, necessário apenas para amostras que necessitam de centrifugação.
Misturador de placas MixMate	Eppendorf	22674200
Orbital Shaker			Usado à temperatura ambiente ou a 25 &graus; C Se o controle de temperatura estiver disponível
, comprimidos inibidores de protease sem EDTA	Roche	4693132001	Necessário apenas para testes alimentares ou ambientais. Os inibidores da protease devem ser isentos de EDTA.
BoNT/A	Metabiológicos	Opcional, necessário apenas para fins de padronização e quantificação
	Thermo Fisher Scientific	15036