Classificando de Streptomyces pellets de células usando um objeto complexo Parametric Analyzer e Sorter

Summary

Adulto líquidos culturas de Streptomyces são caracterizados por pelotas de micélio que são heterogêneos em tamanho. Nós aqui descrever um método para analisar e classificar essas pelotas de uma forma de alto rendimento. Essas pelotas podem ser usados ​​para análises posteriores, que irá fornecer pistas para compreender e controlar a heterogeneidade do crescimento.

Abstract

Streptomycetes são bactérias filamentosas do solo que são utilizados na indústria para a produção de enzimas e antibióticos. Quando cultivadas em biorreactores, estes organismos formar redes de hifas interligado, conhecido como peletes, que são heterogéneos no tamanho. Aqui nós descrevemos um método para analisar e pelotas tipo de micélio usando um objeto complexo Parametric Analyzer e Sorter (COPAS). Instruções detalhadas são dadas para a utilização do instrumento e a análise estatística dos dados de base. Nós ainda descrever como pelotas podem ser classificados de acordo com as configurações definidas pelo usuário, o que permite o processamento a jusante, como a análise do RNA ou proteína. Usando esta metodologia o mecanismo de crescimento heterogêneo subjacente pode ser combatida. Isto irá ser útil para melhorar estreptomicetos, como uma fábrica de células, considerando o facto de que a produtividade se correlaciona com o tamanho da pastilha.

Introduction

Streptomycetes são bactérias filamentosas do solo que são bem conhecidos pela sua aptidão para fazer antibióticos, bem como os compostos que podem ser utilizados como agentes imunossupressores ou para combater infecções fúngicas ou ^1,2 cancro. Além disso, estes organismos produzem enzimas que são de interesse para uma grande variedade de aplicações industriais ^3. A maioria destes compostos comercialmente interessantes são produzidas em bioreactores. Crescimento de estreptomicetos em biorreactores é caracterizada pela formação de estruturas complexas de hifas interligado, conhecidos como aglomerados ou peletes. Estas estruturas multicelulares são altamente heterogênea em relação ao tamanho ⁴ e pode chegar a tamanhos que são mais de um milhão de vezes maior do que uma bactéria unicelular, como Escherichia coli, Bacillus subtilis. Apesar da heterogeneidade é considerada como uma característica benéfica em sistemas biológicos naturais ^5, considera-se uma armadilha de produção na indústria. Biocultivos reator tem que ser reproduzível e controlável para obter os maiores rendimentos possíveis. Uma compreensão detalhada do papel de cada um dos tipos de pelotização em um biorreator, é fundamental para melhorar estreptomicetos como uma fábrica de células.

A citometria de fluxo é utilizada para analisar as células individuais de uma população de ^6. Cytometers fluxo podem adquirir informações multiparamétrica por características das células (como tamanho, densidade e multicolor de fluorescência) medir simultaneamente. Desta forma, as propriedades das células pode ser correlacionada contribuindo assim para a nossa compreensão da heterogeneidade dentro de uma cultura e a existência de populações distintas de células ^6. Instrumentos mais especializados tornaram possível classificar as células de acordo com os parâmetros definidos pelo usuário. Por exemplo, os mutantes podem ser rastreados. Após a separação, tais células mutantes podem ser cultivadas para posterior caracterização. Isso já provou ser útil, entre outros,para melhorar a produtividade de linhagens ^7,8. Os bicos de citómetros de fluxo geralmente permitem a passagem de células, com um diâmetro máximo de cerca de 10 um. Por isso, os aglomerados de estreptomicetos não podem ser analisados ​​com os citómetros de fluxo normal. Eles, no entanto, podem ser analisados ​​com o Complexo Objeto Parametric Analyzer e Sorter (COPAS). Como cytometers fluxo regulares, COPAS pode adquirir dados multiparamétricos de partículas de uma maneira alta taxa de transferência. Dependendo do tipo de COPAS 10-1,500 mM partículas de tamanho podem ser analisados. Além disso, ele permite a triagem de partículas individuais que podem ser utilizados para o cultivo ou análises a jusante, tais como o isolamento do ADN, ARN, ou proteínas. COPAS foi inicialmente concebido para a análise e classificação de pequenos organismos multicelulares, como os nematóides Caenorhabditis elegans ⁹ e embriões de Drosophila e larvas ^10. Os instrumentos também têm sido utilizados para um peixe-zebra ¹¹ª para filamentosas ^12,13 fungos. Os últimos organismos também formar peletes miceliais que são ainda maiores do que aqueles formados por bactérias filamentosas. Nós demonstramos recentemente que o uso de COPAS também é viável para estreptomicetes ^4. Nós aqui descrever o procedimento experimental para utilizar as COPAS avaliar heterogeneidade sedimento em Streptomyces coelicolor, incluindo detalhes sobre a metodologia para classificar pelotas acordo com o tamanho. Por favor note, contudo, que este método também pode ser utilizado para a análise de outros estreptomicetos formador de pelota.

Protocol

O procedimento para analisar e classificar Streptomyces peletes a partir de um de dois dias de idade, a cultura cresceu de líquido encontra-se esquematicamente representado na Figura 1. Detalhes sobre o método são dadas abaixo.

1. Crescimento (incluindo a preparação de Mídia e amortecedores)

1. Prepare 1 L de 10x tampão fosfato salino (PBS, 80 g de NaCl, 2 g de KCl, 14,4 g de Na ₂ HPO _4, 2,4 g _de KH ₂ PO ₄ em 1 L de água destilada ajustada a pH 7,4). No momento da utilização, adicionar 100 ml de 10x de PBS a 900 ml de água destilada para se obter 1 L de PBS.
2. Prepare 1 litro de meio YEME (3 g de extracto de levedura Disco, 5 g de Bacto peptona, 3 g de extracto de malte Oxoid, 10 g de glucose, 340 g de sacarose, água destilada até 1 L) e 100 ml de 2,5 M _MgCl2. Esterilizar ambas as soluções em autoclave. Note-se que também outros meios de Streptomyces pode ser utilizado ^4,14.
3. Adicionam-se 100 ml de meio YEME e 0,2 ml de 2,5 M _MgCl2 para umaestéril balão de 250 ml Erlenmeyer equipado com molas de metal enrolada. Prepare tantos balões como amostras de bactérias para estudar.
4. Inocular cada frasco com 10 ⁸ esporos de Streptomyces para obter uma concentração de esporos de 10 ⁶ esporos / ml. Crescer as bactérias durante 2 dias a 30 ° C, agitando a 180 rpm.

2. Amostragem

1. Transferir uma amostra de 5 ml de cada cultura para um tubo Falcon de 15 ml usando uma pipeta de 5 ml estéril. Agite suavemente a cultura, tendo a amostra para assegurar que a amostra é representativa de toda a cultura.
2. Quando as amostras são analisadas imediatamente com COPAS não são necessárias etapas de preparação da amostra. Manter a amostra em gelo e vá para o passo 3.1 do presente protocolo. Quando as amostras são analisadas em um ponto de tempo depois, fixar os peletes como descritos nos passos 2,3-2,5 deste protocolo. Note-se que a fixação também impede o crescimento das bactérias no sistema de tubagem, quando não adequadamente limpos após Analyses. Certifique-se de que a fixação com formaldeído não está dificultando análises a jusante. Por exemplo, o ARN não pode ser isolado a partir de pelotas de fungos após fixação com formaldeído. Em contraste, o ARN foi isolado com sucesso após a fixação com etanol a 70% ^12.
3. Adicionar 600 ul de 37% de formaldeído a 5 ml de amostra e misturar por inversão do tubo de 3x. Fixar as amostras em gelo durante 30 min.
4. Centrifugar as amostras a 2500 x g num rotor fixado a 4 ° C durante 10 min. Remover cuidadosamente o sobrenadante e lava-se as peletes com 5 ml de PBS.
5. Repetir o passo 2.4, de modo que as peletes são lavadas 2x com PBS. As amostras podem ser armazenadas em PBS a 4 ° C durante várias semanas.

3. Análise COPAS

1. Verifique se o COPAS Além disso, a bomba, o computador eo laser de argônio de 488 nm estão ligados e iniciar o software Biosort. Embora ligado, o laser será ainda em modus espera.
2. Verifique se o frasco de fluido do invólucro está cheio eofrasco de resíduos está vazio.
3. Clique em 'Start' e depois em 'RUN' para ligar o laser de argônio de 488 nm da espera para diante. Depois de aproximadamente 60 segundos, quando o laser estiver ligado, clique em "Concluído".
4. Verifique os medidores de pressão. As pressões para 'bainha', 'Amostra', 'classificador' e 'limpa' deve ler em torno de 4,0, 0,5, 2,7 e 10,9, respectivamente.
5. Clique na caixa de seleção ao lado de "OK Pressão '. O sistema, então, prepara a célula de fluxo e está pronto para uso.
6. Configurações padrão são assumidos com a 'Atraso' em 11 e 'Largura' 7. Os limites são fixados em 50 para "sinal" e 40 para "TOF mínima», com TOF representando o vôo do tempo de serviço. (Para completar: todos os 'ganhos' são definidos em 1, o gatilho está definido para EXT (Extinção) e no separador "Configuração" em "Escolha taxa de varredura '2,50 MHz é escolhido Coincidência é definido como' avançado '.).
7. Retire a água restante do copo de amostra de umad adicionar 0,1 ml de amostra Streptomyces do passo 2.2 ou 2.5 no copo juntamente com PBS (cerca de 50 ml). Verifique se o copo de amostra está bem fechada.
8. Clique em 'Acquire' para iniciar a coleta de dados. Gerenciar a velocidade do fluxo de obter entre 30-50 eventos por segundo. Se o caudal for demasiado elevado, adicionar PBS para o copo de amostra. Se a velocidade de escoamento é muito baixa, adicionar mais amostra.
9. Quando pelo menos 2.500 eventos são coletados clique 'STOP'. Para salvar todos os dados, clique em "Loja" e salve o arquivo para posterior análise estatística. O software Biosort vai salvar os dados em quatro arquivos, dos quais apenas o arquivo txt. Será utilizado para a análise posterior.
10. Limpar o copo de amostra através da remoção da amostra com uma seringa de 50 mL e lavar com 2x água.
11. Repita os passos 3,7-3,10 até são analisadas todas as amostras.

4. Análise de Dados

1. Abra o arquivo txt. E descarte de dados com uma EXT inferior a 25 (usando, por exemplo, MS Excel). Estecorresponde a restos e fragmentos de hifas soltas (por Aspergillus niger todos os dados com uma EXT inferior a 150 são descartados) ^4,12. Em seguida, salve todos os TOFS em uma coluna em uma planície de arquivos (para muitos arquivos de dados que pode ser automatizado na linguagem de programação R, disponível em: 'txt'. http://www.r-project.org ).
2. Certifique-se de SciLab (versão 5.3.2 ou mais recente de http://www.scilab.org/) é instalado juntamente com a biblioteca "fittools ', que está disponível, juntamente com o manual, a partir de:
   http://web.science.uu.nl/microbiology/images/fung/fittools.zip
   http://web.science.uu.nl/microbiology/images/fung/manual% 20fittools.pdf
3. Iniciar SciLab e executar as funções necessárias da biblioteca fittools para modelar os dados. Em suma: Instalar a biblioteca fittools como mostra o manual (só precisava de uma vez).
   1. Carregar a biblioteca fittools.
   2. Leia os dados (arquivos ". Txt ') no Scilab.
   3. Entrar transformar os dados (log natural é a função de log padrão).
   4. Coloque o modelo de 2 populações aos dados.
   5. Traçar uma curva com o histograma e modelo (opcional).
   6. Bootstrap os dados (1000 repetições).
   7. Ajustar o modelo para os conjuntos de dados bootstrap.
   8. Seja o intervalo de confiança estimativas dos parâmetros 5. Isto irá fornecer informações sobre a fração de participação (p) das populações, os seus dois meios (μ ₁ e μ ₂₎ e os desvios-padrão de acompanhamento (α ₁ e α _2). Além disso, os intervalos de confiança de 95% são determinados por remontagem com o modelo, depois bootstrapping (1000 repetições) ^12,13,15. Quando os intervalos de confiança a que os meios não se sobrepõem e o intervalo de confiança de p está entre 0,025-0,975 o conjunto de dados pode ser explicada como uma combinação de duas populações de distribuições normais. (Nota tha fracção a participação de pequenas peletes é p, enquanto a participação de grandes aglomerados é 1 -. p) A relação entre o TOF e o diâmetro de uma pastilha de Streptomyces é igual a 0,57 × TOF + 159 mM ^4.
4. No caso de duas populações são encontradas uso das TOFS média como classificação parâmetros na COPAS como limites superior e inferior para classificar os pequenos e grandes pelotas posteriormente. Note-se que também os outros parâmetros de classificação podem ser seleccionadas em função das exigências do utilizador.

5. Pellet Sorting

1. Carregar a amostra de Streptomyces que precisa de ser classificados como descrito no passo 3.7.
2. Definir 'Classificando Limites "e fornecer detalhes sobre o mínimo (Lo) e máxima (Hi) valores TOF. Como alternativa, defina uma área, selecionando 'Regiões' e depois 'Definir Portão Região' para selecionar as bolinhas com as dimensões ou propriedades desejadas.
3. Coloque um tubo de 50 ml acoletar várias pastilhas que atendam aos parâmetros de classificação. Em alternativa, uma placa de micro-titulação pode ser usado para classificar peletes individuais. Vários pelotas (10 ⁴ -10 ⁵⁾ são necessários para DNA e extração de proteínas. Uma única pastilha é suficiente para a análise de qPCR da expressão do gene, mas vários pelotas são necessários para RNA seqüenciamento.
4. Decida e definir o número de peças que precisam ser resolvidas e clique em "Ordenar manualmente" para classificar para os parâmetros selecionados. Quando a quantidade definida de peletes é atingido, a triagem termina automaticamente.
5. Remover sobra amostra com uma seringa de 50 ml do copo de amostra e lavar o copo com água 2x. Repita os passos de 5,1-5,5 se outras amostras precisam ser classificados.
6. Antes de encerrar as COPAS lave o copo de amostra com água para remover as pedras que faltam e limpar o copo de amostra com etanol 70% e / ou 2% de hipoclorito na água. Executar uma amostra de água clorada para limpar todo o sistema e repita isso com água. Vazio tele transbordar recipiente e limpe ou substitua o filtro que reside neste recipiente.
7. Quando terminar, clique em 'STOP' para liberar a pressão do sistema. Quando o motor pára fechar o programa e clique em "Shutdown sem purgação. Em seguida, desligue o computador, o COPAS, o laser, ea bomba.

Results

Medições Copas de pelotas de Streptomyces
Estreptomicetos formar peletes do micélio em culturas líquidas, que têm uma ampla gama de tamanhos. Para analisar a distribuição de tamanho de sedimento, um líquido de dois dias de idade, cultivadas Streptomyces coelicolor cultura foi submetida a grande fluxo de partículas de citometria usando um COPAS Profiler Além disso equipado com um bocal de 1 mm. A saída típica COPAS é um gráfico de dispersão, como visualizado na Figura 2A. O eixo dos x representa o tempo-de-voo (TOF), que se correlaciona com o tamanho da pastilha (isto é, leva mais tempo para pastilhas de maior dimensão para passar o feixe de laser). O eixo y mostra a extinção, que representa a densidade óptica do objecto. Cada ponto no gráfico de dispersão corresponde a um evento individual, ou seja, uma única pelete passar o feixe de laser. É importante ressaltar que quando a amostra é muito concentrada (ou seja, quando o laser detecta mais de 100 eventos / s), o COPAS freqüentemente não consegue detectar indivíduo pellets. Isto leva a valores TOF falsos que são demasiado elevados. A diluição da amostra reduz os valores médios TOF, até um ponto em que uma maior diluição já não faz impacto TOF. Este ponto é atingido quando foram analisados ​​cerca de 100 pelotas / seg.

Traçando os pontos de dados em um histograma indica que os tamanhos não estão normalmente distribuídos (Figura 2B). A distribuição parece estar inclinado para a direita. Log transformando o conjunto de dados também não conduziu a uma distribuição normal (Figura 2C). Para avaliar se a distribuição de tamanho pode ser explicado assumindo que uma mistura de duas distribuições normais os dados foram modelados matematicamente ^12,15. Modelação de facto indicou que a distribuição de tamanho pode ser explicado assumindo que a existência de duas populações distintas de peletes. A população de pequenos peletes consistiu de 92% de todos os peletes com um tamanho médio de 248 um, enquanto que a população de grande pelpermite (8% de todas as pastilhas) tinha um tamanho médio de 319 um (note que duas populações são assumidos de existir quando a fracção de participação é entre 2,5-97,5%).
Classificando de pelotas de Streptomyces acordo com o tamanho

Micro-colônias das populações de grandes e pequenas pelotas foram ordenados. Para este fim, os tamanhos médios de aglomerados de duas populações foram utilizados para definir os limites para a triagem. Pellets menores do que 248 um foram considerados a partir da pequena população pelota, ao passo que os pontos maiores do que 319 um foram considerados a partir da grande população de sedimento (Figura 3), de modo a limitar a triagem de peletes a partir da porção de sobreposição das duas tamanho distribuições. A análise microscópica dos peletes ordenados mostrou seus tamanhos distintos (Figura 3). Os peletes recolhidos podem ser ainda utilizados para o ADN, ARN, ou isolamentos de proteínas.

Figura 1. Representação esquemática da instalação experimental para medir e analisar pelotas Streptomyces usando COPAS. Para mais detalhes, consulte os procedimentos experimentais. Clique aqui para ver imagem ampliada.

Heterogeneidade Figura 2. Tamanho da pelota em culturas de Streptomyces adulto líquidos. Análise COPAS de S. 2 dias de idade cultura coelicolor YEME (A) indica que os tamanhos de pelotização (indicados como Time of valores vôo) são, normalmente, não distribuird (B), e também não tornar-se assim, quando transformado em registo (C). Em vez disso, foram detectadas duas populações de pelotas que diferem em TOF (e, portanto, tamanho). Clique aqui para ver imagem ampliada.

Figura 3. O fraccionamento de peletes de acordo com o tamanho de Streptomyces. Peletes com um tamanho menor do que 248 um (indicado na rosa) foram consideradas pequenas peletes, que as peletes com um tamanho maior do que 319 um (indicado em azul) foram considerados como grandes aglomerados. A análise microscópica confirmou a diferença de tamanho. Note-se que estes tamanhos foram calculados a partir de dados log-transformados utilizando a relação descrita entre TOF e a diameter de uma bolinha de Streptomyces, o que equivale a 0,57 × TOF + 159 m. Clique aqui para ver imagem ampliada.

Discussion

A citometria de fluxo permitiu a análise em alta velocidade de um grande número de células individuais, o que contribuiu para a nossa compreensão da heterogeneidade em populações clonais ^6. Citometria de fluxo regular não é viável para a análise das pelotas de micélio multicelulares de estreptomicetos e fungos. O nosso trabalho mostrou que a análise de alto rendimento de peletes de Streptomyces é viável utilizando COPAS. O procedimento descrito aqui é simples, rápido e altamente reprodutível. O parâmetro fundamental para manter em mente durante a operação do instrumento é a velocidade do fluxo, o que não deve exceder os 100 eventos / s (passo 3.8 do presente protocolo). Se a concentração de sedimento, e, por conseguinte, também a velocidade de escoamento, torna-se demasiado elevado, os valores de TOF será calculado mal porque o instrumento não detectar peletes individuais. Suficientemente diluindo a amostra por adição de PBS supera este problema.

Limitações
O uso COPAS Mais d aqui tem um diâmetro de bocal de 1 mm, o que é adequado para medir partículas com um tamanho variando 30-700 mM. Por conseguinte, este bocal permite medir pelotas formadas por estreptomicetes. No caso de fungos filamentosos as micro-colónias pode ser maior, o que limita a aplicabilidade geral do COPAS Plus. O COPAS XL pode medir partículas de até 1.500 uM de tamanho, mas a sua sensibilidade na gama inferior de diâmetro é menor em comparação com a do COPAS Plus. Tanto o COPAS Plus e do COPAS XL não pode analisar partículas menores do que 30 mm. Isto implica que os esporos microbianas individuais ou células não pode ser analisado. Além disso, o COPAS não pode analisar com precisão pequenos agregados de células ou esporos e as muito pequenas micro-colónias. Por isso, os analisadores de célula regulares deve ser usado. Esta limitação é ultrapassada pela Biosorter da União biométrica, que pode analisar partículas na gama de 1-1,500 fim. O prêmio de compra, porém, é superior.

t "> Solução de problemas
O COPAS é um instrumento robusto que é fácil de operar. No entanto, às vezes pelotas não são detectados após o carregamento de uma amostra no copo de amostra e iniciar a medição. A causa é tipicamente um tubo de entrada entupida, o que pode ser facilmente resolvido premindo o comando "limpa". Isso vai forçar as pelotas de volta do sistema de tubulação para o copo de amostra. Uma razão alternativa pode ser que a tampa não está correctamente colocado no recipiente de amostra. Isto leva à perda de pressão e o fracasso concomitante para detectar peletes.

Significado e direções futuras
Nós aqui focado na análise do tamanho da pelota, mas a configuração COPAS também é capaz de analisar e classificar com base em fluorescência e densidade. Detecção de fluorescência nos permite analisar a expressão gênica baseada em jornalistas como GFP. Além disso, a composição das células pode ser avaliada. Ainda mais potente é a opção para separar pastilhas de acordo com estes parâmeters. Grânulos classificados podem ser usados ​​para as análises a jusante, incluindo todos os estudos-genómica. De fato, anteriormente classificadas 60.000 grandes e 200.000 pequenas pelotas, e demonstrou que o proteoma foi significativamente diferente entre grandes e pequenas pelotas ^4. Assim, esta tecnologia fornece novas pistas para melhorar estreptomicetos como fábricas celulares.

O principal benefício da tecnologia COPAS é o tempo. Estudos anteriores sobre os sedimentos celulares foram realizadas utilizando a microscopia, e isto limita o número de aglomerados que podem ser analisadas até várias centenas ^16. Estudos de microscopia já sugeriu a existência de duas populações de pelotas em Streptomyces culturas adulto líquidos ^16. Na verdade, duas populações de peletes foram detectadas independentemente das condições de cultura, em um grande número de diferentes estreptomicetos ^4. Esta heterogeneidade de tamanho não é restrita a estreptomicetos filamentosos, mas também foi observada em fungos filamentosos ^{12 <}/ Sup>. Em todos os casos, os mecanismos subjacentes à heterogeneidade ainda não são conhecidas. A possibilidade de classificar pastilhas de acordo com o tamanho e a fluorescência nos permite desvendar tais mecanismos.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
COPAS Plus	Union Biometrica	PLUS	Citômetro de fluxo de partículas grandes incluindo lasers e software
NaCl	Sigma Aldrich	S3014	PBS componente
KCl	Sigma Aldrich	P9541	PBS componente
Na2HPO4	Sigma Aldrich	S3264	PBS componente
KH2PO4	Sigma Aldrich	P9791	Componente PBS
Extrato de levedura Difco Componente	de mídia	210933	Biosciences
Bacto Peptona	BD Biosciences	Componente de mídia	211677
Extrato de malte oxóide Fisher	Scientific	Componente de mídia	OXLP0039B
glicose	Sigma Aldrich	G8270	Mídia componente
Sucrose	Sigma	Aldrich S9378	Componente de mídia
MgCl2• Componentes de	Sigma Aldrich	M2670	. Adicione após a autoclavagem.
Solução de Formaldeído	Sigma Aldrich	F8775	Fixação de pellets
Solução de Hipoclorito de Sódio	Sigma Aldrich	71696	Para limpeza do instrumento
EtOH	VWR	20816.367	Para limpeza do instrumento
Erlenmeyer Flask (250 ml)	Fisher Scientific	214-1132	Frasco de cultura para cultivo de Streptomyces
Springs	Verenfabriek De Spiraal	à medida	Utilizado em frasco de cultura. RVS1.4401/Comprimento 210 mm/Diâmetro 17 mm/Passo 5 mm
Tubo de Centrífuga Estéril (15 ml)	Sarstedt	62.554.002
Seringas (50 ml)	Sigma	Z683698