Avaliando o Desenvolvimento da murino células dendríticas plasmocitóides em placas de Peyer Usando transferência adoptiva de Progenitores hematopoiéticos

Resumo

Este protocolo descreve os procedimentos experimentais para avaliar a diferenciação de células dendríticas plasmacytoid em placas de Peyer de progenitores de células dendriticas comuns, utilizando técnicas que envolvem o isolamento de FACS mediada por células, a transferência de genes hidrodinâmico, e análise de fluxo de subconjuntos imunes em placas de Peyer.

Resumo

Este protocolo detalha um método para analisar a capacidade dos progenitores hematopoiéticos purificadas para gerar células dendríticas plasmocitóides (PDC) em placa de Peyer intestinal (PP). Progenitores de células dendríticas comuns (CDPs, lin ^- de c-kit ^eis CD115 ^{+ +} FLT3) foram purificadas a partir da medula óssea de ratinhos C57BL6 por FACS e transferido para murganhos receptores que não possuem uma população significativa pDC em PP, neste caso, o IFNAR ^{- / -} ratinhos foram utilizados como os receptores de transferência. Em alguns camundongos, a superexpressão do fator de crescimento de células dendríticas Flt3 ligante (Flt3L) foi aplicada antes adotivos transferência de CDPs, utilizando transferência de genes hidrodinâmico (HGT) de Flt3L-plasmídeo. Flt3L a superexpressão expande as populações DC provenientes transferidos (ou endógenos) células progenitoras hematopoéticas. No 7-10 dias após a transferência progenitor, pDCs que surgem a partir dos progenitores adotivamente transferidos foram distinguidas das células receptoras nobase de CD45 expressão do marcador, com pDCs de CDPs transferidos sendo CD45.1 ⁺ e destinatários sendo CD45.2 ^+. A capacidade de LDC transferidos para contribuir para a população pDC em PP e para responder a Flt3L foi avaliada por citometria de fluxo de PP suspensões de células individuais a partir de ratinhos receptores. Este método pode ser utilizado para testar se a outras populações progenitoras são capazes de gerar PP pDCs. Além disso, esta abordagem pode ser usada para examinar o papel de factores que estão previstos para afectar o desenvolvimento do pDC em PP, transferindo subconjuntos progenitoras com um knockdown apropriado, eliminar ou sobre-expressão do factor de putativa de desenvolvimento e / ou através da manipulação de citocinas circulantes através HGT . Este método também pode permitir a análise de como pDCs PP afetar a freqüência ou função de outros subconjuntos imunes em PPs. Uma característica única deste método é o uso de IFNAR ^{- / -} ratos, que mostram dizimadas PP pDCs em relação ao tipo selvagem animais, assim allowing reconstituição do PP pDCs na ausência de efeitos de confusão de irradiação letal.

Introdução

Aqui, nós demonstramos um protocolo para avaliar se progenitores de células dendríticas comuns (CDPs) são capazes de dar origem a células dendríticas plasmocitóide população (PDC) em placa de Peyer (PP). O objetivo geral deste método foi avaliar a regulação do desenvolvimento de pDCs na placa de Peyer (PP pDCs). A razão pela qual isto é importante é que pDCs PP diferem de pDCs encontrado em outros tecidos, incluindo a medula óssea, do sangue e do baço, e, por conseguinte, não está claro se pDCs PP e outras populações pDC são termos de desenvolvimento e / ou funcionalmente relacionados. Especificamente, pDCs são amplamente conhecido por ser o principal tipo I interferon (IFN) produtores dentro do sistema hematopoiético, respondendo ao receptor Toll-like 7 e 9 (TLR7 / 9) estimulação por IFN rápida secreção ^1-3. No entanto, pDCs PP são deficientes na produção de IFN tipo I em resposta a estimulação agonista TLR ^4,5. Além disso, PP pDCs também diferem de pDCs encontradas na medula óssea e no baço, emrequerendo sinais provenientes do receptor do interferão do tipo I (IFN) (IFNAR1) ou sinalização de IFN STAT1 molécula para o seu desenvolvimento e / ou a acumulação ^5. Estes dados sugerem a possibilidade de que os mecanismos reguladores distintos controlar pDCs PP contra pDCs noutros órgãos (por exemplo, medula óssea, baço) ^5.

A lógica que levou ao desenvolvimento deste método foi baseada em avanços recentes na compreensão da biologia das células dendríticas (DC). A maioria, se não todos, os subconjuntos de DC derivar de progenitores hematopoiéticos que expressam a tirosina-quinase 3 de receptor tipo fms (FLT3), ^6-10, no entanto, o desenvolvimento DC não se restringe ao mielóide clássico e vias linfóides. Por exemplo, FLT3 ⁺ progenitores mielóides comuns (CMPs, lin ^- IL-7R ^- Sca-1 ^- c-kit ⁺ CD34 ⁺ FcγR ^{lo / -)} dão origem a CDPs (lin ^- c-kit ^lo CD115 ⁺ Flt3 ^+), which diferenciar ainda mais em pDCs e DCs convencionais (CDCs) ^9,10. Por outro lado, Flt3 ⁺ progenitores linfóides comuns (CLPs, Lin ^- IL-7R ⁺ Sca-1 ^lo c-kit ^lo) se desenvolvem principalmente em pDCs ^11. Portanto, estudos anteriores indicam pDCs surgem pelo menos duas populações progenitoras hematopoiéticas distintas ao abrigo do regulamento de Flt3L, embora a análise típica tem sido restrita para a medula óssea, baço e / ou subconjuntos pDC sangue. Assim, a população de (s) progenitor que gera PP pDCs necessária investigação. Compreender as origens do PP pDCs vai lançar luz sobre se eles compartilham as vias de desenvolvimento comuns a outras populações PDC ou utilizar mecanismos distintos durante a sua geração no PP.

A única vantagem da abordagem aqui descrita é a utilização de ratos que apresentam uma deficiência grave em PP pDCs como receptores para a transferência adoptiva de células progenitoras hematopoiéticas. Ratos com genesupressão tique no gene que codifica a IFNAR1 (IFNAR ^{- / -} murganhos) ou STAT1 (Stat1 ^{- / -)} revelou uma depleção marcante em PP pDCs ^5. Portanto, estas linhagens proporcionar um ambiente no qual os pDCs PP são reduzidos, permitindo estudos de transferência adoptivos ser realizada na ausência de potentes regimes de ablação celular, tais como a irradiação letal. Teor adicional método apresentado é utilização de transferência gene hidrodinâmico (HGT) estimular montantes elevadas circulantes Flt3L. Isso fornece uma abordagem de custo eficaz para induzir Flt3L in vivo, contra injeção de proteína recombinante. Inúmeros estudos, incluindo aqueles em nosso laboratório, empregaram HGT para induzir quantidades de citocinas em uma variedade de condições experimentais ^5,12,13.

A divisão do trabalho e funções imunológicas precisas para DCs é de grande interesse na área de imunologia. Em particular, pDCs são mediadores importantes de tolerância oral e sistémica anti-viralrespostas, ainda que também parecem contribuir para o desenvolvimento e persistência de auto-imunidade e cancro ^14-17. O protocolo aqui descrito vai permitir que os mecanismos que regulam o desenvolvimento PP pDCs ser mais plenamente exploradas. Além disso, esta abordagem pode permitir estudos para avaliar a função PP PDC e pode ser prorrogado para o entendimento da regulação e função de outras populações imunológicas dentro PPs.

Protocolo

Aprovação Institucional deve ser obtida com antecedência para todas as manipulações experimentais aqui descritos envolvendo camundongos. Estes incluem o uso de ratos C57BL6 para o isolamento de células progenitoras de medula óssea, o IFNAR ^{- / -} murganhos como receptores para a transferência adoptiva de células progenitoras hematopoiéticas e à utilização de HGT para a sobre-expressão de citoquinas, in vivo. Habitação adequada e cuidados com os animais também deve ser fornecido pelo investigador ou instituição. Além disso, a aprovação institucional pode ser necessário para os plasmídeos utilizados na transferência de genes hidrodinâmico (isto aprovação de ADN recombinante). Os estudos aqui descritos foram aprovados pelo Comitê Institucional Animal Care e Use a UT MD Anderson Cancer Center.

1. Transferência de Gene hidrodinâmica (HGT)

Esta etapa deve ser realizada 2 dias antes da transferência adoptiva de LDC para induzir circulando Flt3L para expansão DC in vivo ^5. Prepare pelo menos 5 destinatário ratinhos / grupo.

1. Para alcançar eficiente HGT, os vasos sanguíneos do receptor IFNAR ^{- / -} murganhos (CD45.2 ⁺⁾ deve ser dilatada por expor os ratos a uma lâmpada de aquecimento durante 5-10 minutos.
2. Posicione o mouse em um dispositivo limitador e desinfectar a sua cauda com etanol 70%.
3. Injectar 5 ug de plasmídeo Flt3L, em 2 ml de PBS estéril, na veia da cauda usando uma agulha G 27. Para o grupo de controlo, injecta-se 5 ug de vector vazio (pORF) através da veia da cauda, ​​tal como indicado.
4. Monitorar os ratos para 15-30 min para garantir que não haja efeitos deletérios da injeção veia da cauda. Retornar ratos para instalação de alojamento para 2 dias.

2. Isolamento de hematopoéticas Progenitores de Rato Medula Óssea

Esta etapa deve ser realizada 2 dias após HGT. Use CD45.1 congênica ⁺ ratinhos como fonte de células progenitoras da medula óssea para a transferência adoptiva para receptor IFNAR ^{- /}- animais (CD45.2 ^+). Neste protocolo, estirpes congénicas devem distinguir doador e DCs derivada do receptor, bem como para evitar a depleção imune-mediada, devido à incompatibilidade do MHC. Aproximadamente 10-20 ratos serão obrigados a fornecer um número suficiente de células progenitoras hematopoiéticas (10 ⁵ células / rato destinatário) para os experimentos de transferência.

1. Eutanásia 10 congênica CD45.1 ⁺ ratos por asfixia CO ₂ e deslocamento cervical.
2. Coloque cada carcaça em uma bandeja de dissecação e esterilizar o abdômen e pernas com etanol 70%.
3. Faça uma incisão no meio do abdômen e cortar a pele do abdômen para cada perna, cortando a pele para baixo o comprimento da perna.
4. Remova cuidadosamente a pele de cada perna, e cortar e remover as pernas da carcaça ao nível da articulação do quadril usando tesouras afiadas.
5. Remova cuidadosamente os músculos do fêmur e da tíbia de cada perna usando uma lâmina afiada.
6. Removerambas as extremidades do fémur e da tíbia com um bisturi afiado e colocar ossos numa placa de cultura contendo meio RPMI completo (RPMI com 10% de soro inactivado por calor fetal bovino, 1% de penicilina / estreptomicina, piruvato de sódio 1 mM e 50 uM β-mercaptoetanol) .
7. Prepare uma seringa contendo 1 ml de RPMI completo, conectado a uma agulha G 27.
8. Insira a agulha de 27 G em uma extremidade do fêmur ou tíbia. Lave a medula óssea do fêmur ou tíbia injetando suavemente o RPMI completo dentro do osso. Certifique-se de que as células de medula óssea são removidos a partir do osso, o que pode ser conseguido por meios de detecção visual expelido que aparece turvo.
9. Repita a lavagem cada fêmur ea tíbia 3x para remover completamente as células da medula óssea.
10. Prepare uma suspensão única célula cuidado pipetando células para cima e para baixo 3-5x na placa de cultura.
11. Remover os detritos, passando as células de medula óssea por meio de um filtro de 40 | iM de células, colocando as células de exsudados para um novo culture prato. Interromper quaisquer aglomerados de células que aparecem no filtro através de pressão suave com a extremidade de um êmbolo de seringa estéril.
12. Lise das células vermelhas do sangue (RBC) presentes na suspensão total de células de medula óssea com tampão de lise comercial RBC acordo com as instruções do fabricante. Utilizar 2 ml de lise buffer/4-6 x 10 ⁷ células (em geral, as células de um rato) e um tempo de incubação de 5 minutos à temperatura ambiente.
13. Lave as células da medula óssea por células granulação por centrifugação durante 4 minutos a 500 x g, aspiração suavemente o meio de cultura, ressuspensão em 10 ml de tampão de FACS (PBS 1x + 2 mM de EDTA e 1% de FBS), as células de revestimento por centrifugação e suavemente aspiração lavagem tampão.
14. Repetir a lavagem, tal como descrito no passo 2.13, para um total de duas lavagens.

3. Celular ativado por fluorescência (FACS) para isolar CDPs

Este passo requer acesso a um separador de células MidiMACS e colunas MACS LD por um processo de selecção inicial negativo,, bem como uma máquina de FACS com, pelo menos, três lasers para purificar o subconjunto de células progenitoras multicolor após coloração com anticorpos conjugados com fluorescência.

1. Após a segunda lavagem no passo 2.14, a contagem das células de medula óssea. Agregar as células por centrifugação, tal como descrito no passo 2.13 e ressuspender em tampão FACS para alcançar uma concentração final de 4 x 10 ⁷ células por 30 ul de tampão de FACS.
2. Para preparar as células para FACS, as células de linhagem negativa são primeiro enriquecidas por uma técnica de selecção negativa que remove as células de linhagem positiva a partir da mistura de medula óssea utilizando cromatografia em coluna de esférulas magnéticas. Para o processo de selecção negativa, adicionar 1 ug de cada um dos seguintes anticorpos anti-ratinho de rato comercial (ABS) que reconhecem marcadores de linhagem hematopoiética: CD3, CD19, CD11c, CD11b, e Ter-119 Abs. Os Abs deve ser adicionado num volume de 2 mL / Ab à suspensão de células 30 mL de tampão de FACS.
3. Incubar a suspensão de células a 4 ° C durante 30min. Após a incubação, lavar as células duas vezes com 10 ml de tampão de FACS, tal como descrito no passo 2.13.
4. Ressuspender as células para conseguir uma concentração final de 4 x 10 ⁷ cells/40 ul de tampão de FACS. Adicionar 20 ul de cabra anti-rato IgG microesferas magnéticas por cada 40 uL de suspensão de células. Misturar suavemente e incuba-se a 4 ° C durante 30 min. Lavar as células com 10 ml de tampão de FACS, tal como descrito no passo 2.13.
5. Ressuspender até 10 células de medula óssea ^{de 8} em 500 mL de tampão de FACS.
6. Carregar uma coluna MACS LD para um separador de células MidiMACS acordo com as instruções do fabricante e prerinse a coluna com tampão de SCAF 2 ml.
7. Aplicar a suspensão de células da medula óssea para a coluna, carregando-se com 5 x 10 ⁸ células em 2,5 ml de tampão de FACS. Certifique-se de um tubo de recolha (15 ml tubo cónico) é colocado na coluna. Lavar a coluna 3 vezes com 2 ml de tampão de FACS / lavagem, e recolher as células que passam através da coluna, que será enriquecida paracélulas da linhagem-negativos. Contar as células do material fluido (wash-through) da coluna.
8. Para efectuar a selecção positiva de subconjuntos progenitoras hematopoiéticas por FACS, as células são coradas com os seguintes Abs conjugado fluorescente: IL-7R (Pacific Blue), FLT3 (PE), Sca-1 (PE.Cy7), CD115 (APC), c-kit (APC.Cy7) Abs, além de uma mistura de linhagem Abs marcador contra CD3, CD19, CD11c, CD11b, F4/80 e Ter119 (todos rotulados com PerCP Cy5.5). Use 0,5-1 ul de cada Ab num volume total de 100 ul. Incubar a suspensão de células a 4 ° C durante 20-30 min.
9. Lavar as células, tal como indicado no passo 2.13 e ressuspender em tampão FACS a uma concentração de 2-3 x 10 ⁷ células / ml. Filtrar as células através de um tubo de 35 uM tampão filtro celular para remover aglomerados de células. Este último passo é crucial para evitar o entupimento da máquina FACS.
10. Coloque a suspensão de células em um tubo de FACS no palco FACS e classificar CDPs (LIN ^- c-kit ^lo CD115 ⁺ Flt3 ⁺⁾ nobase do perfil de marcador indicado. Recolher as células purificadas num tubo de 15 ml contendo 5 ml de meio RPMI completo.
11. Gravar o número absoluto de células classificadas no final da execução de FACS. Agregar as células por centrifugação, tal como indicado no passo 2.13 e ressuspender em PBS estéril para as experiências de transferência adoptivos.

4. A transferência adoptiva de CDPs

Este passo é tipicamente realizado na instalação para animais, onde os ratinhos receptores são alojados. Dependendo da localização da máquina de FACS, pode envolver o transporte das populações de células progenitoras purificadas para a instalação dos animais antes da transferência adoptiva. As suspensões de células progenitoras devem ser mantidos estéreis e transportadas em gelo.

1. Preparar suspensões de células por injecção, diluindo 10 ⁵ LDC purificados, num volume total de 100 ul de PBS estéril. Colocar a suspensão de células em uma seringa ligada a uma agulha G 27.
2. Expor o receptor IFNAR ^{- / -} ratinhos (CD45.2 ⁺⁾ a uma lâmpada de aquecimento durante 5-10 minutos para atingir a injecção eficiente através da veia da cauda.
3. Posicione o mouse em um dispositivo limitador e desinfectar a sua cauda com etanol 70%.
4. Injectar 10 ⁵ FACS purificado LDC em 100 ul de PBS na veia da cauda usando uma agulha G 27.
5. Monitorar os ratos para 15-30 min para garantir que não haja efeitos deletérios da injeção veia da cauda. Retornar ratos para instalação de alojamento.

5. Isolamento de PP e Mensuração de pDC Valores

1. No 7-10 dias após a transferência adotiva, eutanásia os ratos receptores. Abra cuidadosamente o mouse por dissecção e expor o intestino.
2. Remova todo o intestino e colocá-lo em papel toalha PBS-encharcado. Colete todos os PPs visíveis ao longo da parede do intestino delgado usando uma pinça fina e tesoura. C57BL6 e IFNAR ^{- / -} murganhos têm tipicamente 5-10 PP / rato, que são diferentes dos folículos linfóides isoladas encontradosao longo do intestino delgado ^18. Note-se que as PPs são frequentemente estruturalmente distintas, mesmo dentro de um único rato, tão cuidadosamente garantir que todos os PPs são identificados e dissecados.
3. Coloque PPs em uma placa de Petri contendo PBS, e utilizar uma pinça para remover fezes. Repita este procedimento duas vezes para limpar PPs.
4. Digest PPs com 1 mg / ml de colagenase IV em 10 ml de solução salina equilibrada de 1x Hank (HBSS) em um frasco de 50 ml com agitação vigorosa durante 1 hora a 37 ° C.
5. Coloque o PP digerido no topo do compartimento de um 40 um filtro de células e células de força através de peneira com um êmbolo da seringa estéril. Recolha a suspensão de células PP num tubo cónico de 15 ml.
6. Granulado de células PP tensas por centrifugação a 500 xg durante 5 min e ressuspender em 6 ml de solução de Percoll a 37% (37% de Percoll no meio RPMI). Colocar suavemente 6 ml de uma solução de Percoll a 70% (70% de Percoll no meio RPMI) por baixo da suspensão de células, para formar um passo de gradiente de Percoll.
7. Células centrifugadas por 20 min at 800 xg, com a centrífuga romper. As células mononucleares irão migrar para a interface 37/70%. Após centrifugação, a população de células mononucleares deve ser recolhida por pipetagem cuidadosa na região da interface. Pellet células recolhidas por centrifugação e lava-se duas vezes em 50 ml de meio RPMI completo / lavagem. Uma grande volume é usado para assegurar a remoção completa de Percoll.
8. Mancha as células PP coletados com os seguintes anticorpos para detectar pDCs murino que derivam dos progenitores adotivamente transferidos (CD45.1 ⁺⁾ ou ratos destinatário (CD45.2 ^+): CD45.1 (APC.Cy7), CD45.2 (PE . Cy7), CD11c (azul do Pacífico), CD11b (PerCP Cy5.5), B220 (APC), Siglec-H (PE) e PDCA-1 (ITCF) Abs. Realizar a análise de citometria de fluxo de células PP, tal como indicado nos passos 3.9 e 3.10. Identificar pDCs por sua CD11c ⁺ CD11b ^- B220 ^{+-H +} Siglec PDCA-1 ⁺ fenótipo. Números absolutos pDC pode ser determinada pela seguinte equação:% de pDCs xnúmero de células tal PP = PP pDCs.

Resultados

Os nossos resultados mostram a estratégia de propagação para o isolamento de LDC a partir de células de medula óssea de ratinho (Figura 1), tal como descrito em Protocolos 2 e 3. LDC compreendem cerca de 0,1% do total de células de medula óssea, e de cerca de 4-6 x 10 ⁴ CDP pode ser isolado a partir de um rato. Após a transferência adotiva, CDPs diferenciar em pDCs e CDCs ^10.

Discussão

A técnica de transferência adoptiva descrita aqui avaliada a contribuição de LDC a população PP pDC em ratinhos receptores que são deficientes em PP pDCs (por exemplo, elemento de IFNAR ^{- / -} ratinhos). Em experimentos futuros, será importante para avaliar o potencial de outros subconjuntos progenitoras na geração pDCs PP, em especial, se pDCs PP derivam FLT3 ⁺ CLPs. Esta questão é importante, uma vez que ainda não está claro por que pDCs PP são excepcionalmente sensíveis aos sinais IFNAR-...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
C57BL / 6J	JAX	664
B6. SJL	JAX	2014
RPMI	Invitrogen	11875-093
Tubos cônicos de 15 ml	BD Biosciences	352095
Tubos cônicos de 50 ml	BD Biosciences	352070
Pinças cirúrgicas
Tesoura
Tesoura grande estéril
40 μ filtro de células m	BD Biosciences	352340
35 μ tubos de filtro de células m	BD Biosciences	352235
tampão de lise de hemácias	Sigma	R7757
Tampão			PBS, 2 mM EDTA, 1% FCS, esterilizado por filtro
Percoll	GE Healthcare	17089102
10x HBSS	Sigma	H4641
Collagenase IV	Worthington	LS004188
Microesferas de IgG anti-rato de cabra	Milteyni Biotec	130-048-501
Coluna LD	Milteyni Biotec	130-042-901
Rato anti-D3	BD Biosciences	555273
Rato anti-CD19	BD Biosciences	553783
Rato anti-CD11b	BD Biosciences	553308
Rato anti-CD11c	BD Biosciences
Rato anti-Ter119	BD Biosciences	553671
Anti-CD3 (PerCP)	eBiosciences	45-0031
Anti-CD19 (PerCP)	eBiosciences	45-0193
Anti-CD11b (PerCP)	eBiosciences	45-0112
Anti-CD11c (PerCP)	eBiosciences	45-0114
Anti-F4/80 ( PerCP)	eBiosciences	45-4801
Anti-Ter119 (PerCP)	eBiosciences	45-5921
Anti-SCA-1 (PE. Cy7)	eBiosciences	25-5981
Anti-CD115 (APC)	eBiosciences	17-1152
Anti-c-kit (APC. Cy7)	eBiosciences	47-1171
Anti-IL-7R (Azul Pacífico)	eBiosciences	48-1271
Anti-Flt3 (PE)	eBiosciences	12-1351
Anti-CD45.1 (APC. Cy7)	BD Biosciences	560579
Anti-CD45.2 (PE. Cy7)	Biolegend	109830
Anti-CD11c (Azul Pacífico)	eBiosciences	48-0114
Anti-B220 (APC)	eBiosciences	25-0452
Anti-Siglec-H (PE)	eBiosciences	12-0333
Anti-PDCA-1 (FITC)	eBiosciences	Nov-72
Classificador de células	BD Biosciences		por exemplo, BD Fortessa
Lâmpada
Mouse resretenção
1 ml Seringas	Becton Dickinson	309602
27½ Agulhas G (estéreis)	Becton Dickinson	305109