Alongamento Células micropatterned num PDMS Membrana

Resumo

Este manuscrito apresenta uma técnica de aplicar ou libertar forças em células aderentes ou tecidos usando alongamento unidirecional.

Resumo

Forças mecânicas exercidas sobre as células e / ou tecidos, desempenham um papel importante em numerosos processos. Desenvolvemos um dispositivo para esticar as células semeadas em um polidimetilsiloxano (PDMS) de membrana, compatível com a imagem. Esta técnica é reproduzível e versátil. A membrana pode ser micropadronadas PDMS, a fim de limitar as células ou tecidos a uma geometria específica. O primeiro passo é a impressão micropadrões sobre a membrana de PDMS com uma técnica de UV profundo. A membrana PDMS é, em seguida, montado sobre um esticador mecânica. A câmara está ligada na parte superior da membrana com lubrificante biocompatível para permitir deslizamento durante o estiramento. As células são semeadas e deixada espalhar-se por várias horas nas micropadrões. A amostra pode ser esticado e não esticada várias vezes com a utilização de um parafuso micrométrico. Demora menos de um minuto para aplicar o trecho em toda sua extensão (cerca de 30%). A técnica aqui apresentada não inclui um dispositivo motorizado, o qual é necessário para umapplying ciclos repetidos de alongamento de forma rápida e / ou controlado alongamento computador, mas isso pode ser implementado. Alongamento de células ou tecidos podem ser de interesse para as questões relacionadas com as forças de celulares, a resposta celular ao estresse mecânico ou morfogênese do tecido. Esta apresentação de vídeo vai mostrar como evitar problemas típicos que podem surgir quando se faz este tipo de experimento aparentemente simples.

Introdução

As células que constituem um tecido em organismos superiores estão sujeitos a tensões mecânicas e as forças de alongamento ou provenientes do ambiente externo, ou a partir de células que rodeiam ^1,2. As células devem se adaptar e resistir a essas forças, a fim de manter a integridade do tecido. Essas forças também são importantes para os tecidos morfogênese durante o desenvolvimento ^3,4. Aplicação de forças mecânicas sobre as células em cultura é uma forma de imitar o que pode acontecer num tecido, mas com um controlo quantitativo e independente da forma da célula e de deformação célula ^5,6. Por isso, várias técnicas podem ser usadas.....

Protocolo

1. A passivação do PDMS

1. Corte um pedaço de PDMS aproximadamente 35 mm x 20 mm a partir de uma folha pré feita (por exemplo, GelPak, conforme listado na tabela de materiais).
2. Remover a parte superior e as camadas de protecção inferior de plástico (se necessário) e usar uma pinça para colocar o PDMS numa plástico (não tratados de cultura celular), uma placa de Petri.
3. Lavar o PDMS com etanol a 70% durante 5 minutos num rotor a 30 oscilações / min.
4. Seca-se a superfície de fluxo de ar sobre ela.
5. Iluminar com UV profunda (λ = 180 nm), durante 5 min, a uma certa distância das lâmpadas de UV de cerca de 5 cm (ver folha de Ma....

Resultados

A técnica apresentada neste protocolo de vídeo permitiu a aplicação de forças sobre as fibras de retração da mitose de células de mamíferos. Com efeito, durante a divisão celular, na fase de mitose, as células de mamíferos retrair a tomar a forma de uma esfera e deixar para trás os cabos de actina finas rodeado por uma membrana, que estão ligadas ao substrato. Estes cabos (fibras de retração), são a memória da geometria da célula antes de entrar em divisão. Fazendo micropadrões com UV profundo através de uma fotom.......

Discussão

Embora esta técnica tem sido utilizada inúmeras vezes e é exaustivamente testado, há várias etapas críticas que podem levar a uma experiência fracassada.

Sobre o PDMS:

Para este trabalho, GelPak, uma folha fina de PDMS comercialmente disponível, foi usado. Alternativamente folhas PDMS pode ser convertido diretamente do mix PDMS. Recomendamos a utilização de GelPak porque é mais reprodutível e é menos propensos a quebrar em comparação com custom made PDMS.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
GelPak	GelPak	PF-60-X4	Diferentes espessuras / viscosidade estão disponíveis. Uma alternativa poderia ser lançar seu PDMS  se.
Graxa de silicone	GE Bayer Silicones	Baysilone-Paste	Este é biocompatível
Dispositivo de alongamento	GREM mé Maca Canique	2011
EDC (N- (3-Dimetilaminopropil) -N′ Cloridrato de etilcarbodiimida)	Sigma	3450	Estável 6 meses a -20 & C
NHS (N-Hydroxysulfosuccinimida sodium salt)	Sigma	56485	Protect from humidity
Pll-g-peg (PLL(20)-g[3.5]-PEG(2) 20 mg)	SurfaceSolutions (Zurich)
Fotomáscara de Quartzo Sintético	Toppan		Pegue a fotomáscara binária padrão em
Quartzo Fibronectina de plasma bovino	Sigma	F1141