Alongamento Células micropatterned num PDMS Membrana

Resumo

Este manuscrito apresenta uma técnica de aplicar ou libertar forças em células aderentes ou tecidos usando alongamento unidirecional.

Resumo

Forças mecânicas exercidas sobre as células e / ou tecidos, desempenham um papel importante em numerosos processos. Desenvolvemos um dispositivo para esticar as células semeadas em um polidimetilsiloxano (PDMS) de membrana, compatível com a imagem. Esta técnica é reproduzível e versátil. A membrana pode ser micropadronadas PDMS, a fim de limitar as células ou tecidos a uma geometria específica. O primeiro passo é a impressão micropadrões sobre a membrana de PDMS com uma técnica de UV profundo. A membrana PDMS é, em seguida, montado sobre um esticador mecânica. A câmara está ligada na parte superior da membrana com lubrificante biocompatível para permitir deslizamento durante o estiramento. As células são semeadas e deixada espalhar-se por várias horas nas micropadrões. A amostra pode ser esticado e não esticada várias vezes com a utilização de um parafuso micrométrico. Demora menos de um minuto para aplicar o trecho em toda sua extensão (cerca de 30%). A técnica aqui apresentada não inclui um dispositivo motorizado, o qual é necessário para umapplying ciclos repetidos de alongamento de forma rápida e / ou controlado alongamento computador, mas isso pode ser implementado. Alongamento de células ou tecidos podem ser de interesse para as questões relacionadas com as forças de celulares, a resposta celular ao estresse mecânico ou morfogênese do tecido. Esta apresentação de vídeo vai mostrar como evitar problemas típicos que podem surgir quando se faz este tipo de experimento aparentemente simples.

Introdução

As células que constituem um tecido em organismos superiores estão sujeitos a tensões mecânicas e as forças de alongamento ou provenientes do ambiente externo, ou a partir de células que rodeiam ^1,2. As células devem se adaptar e resistir a essas forças, a fim de manter a integridade do tecido. Essas forças também são importantes para os tecidos morfogênese durante o desenvolvimento ^3,4. Aplicação de forças mecânicas sobre as células em cultura é uma forma de imitar o que pode acontecer num tecido, mas com um controlo quantitativo e independente da forma da célula e de deformação célula ^5,6. Por isso, várias técnicas podem ser usadas. Pode-se pressionar sobre as células (a célula inteira ou parte dela), por exemplo, usando AFM ou derivados ^7,8 ou esticar o substrato as células estão crescendo diante.

O método descrito neste artigo demonstra como esticar um substrato plano revestida com as células. Esta técnica foi originalmente desenvolvido para avaliar o papel das forças exercidas sobre mcélulas de mamíferos itotic ^9. As células mitóticas ficar ligado ao substrato por meio de fibras de retracção e o alongamento da membrana exercida uma força sobre as fibras, o que por sua vez, provocou a rotação do fuso mitótico. O interesse de se combinar micropadrões adesivas e de alongamento é conseguir um controlo independente das forças e forma de células individuais. Por exemplo, é possível esticar uma célula oval em uma forma perfeitamente redonda isotrópica, enquanto estiramento uniaxial é aplicada. Se as células não estão em tecendo micropadrões, estiramento uniaxial resultados do alongamento celular, com a maioria das células com um longo eixo alinhado com o eixo de estiramento. Em seguida, é difícil separar o efeito do alinhamento do eixo longo e o efeito do alongamento aplicado às células.

O dispositivo é adequado para qualquer imagem de células vivas, incluindo microscopia fluorescente lapso de tempo longo, e os medicamentos podem ser acrescentados durante o experimento. O método UVs micropatterning profunda ¹⁰foi descrito em detalhes em Azioune et al. ¹¹ Patterning em PDMS foi descrito em ¹² Azioune et al. O presente protocolo de alongamento é uma versão em vídeo de Carpi et al. ¹³

Protocolo

1. A passivação do PDMS

1. Corte um pedaço de PDMS aproximadamente 35 mm x 20 mm a partir de uma folha pré feita (por exemplo, GelPak, conforme listado na tabela de materiais).
2. Remover a parte superior e as camadas de protecção inferior de plástico (se necessário) e usar uma pinça para colocar o PDMS numa plástico (não tratados de cultura celular), uma placa de Petri.
3. Lavar o PDMS com etanol a 70% durante 5 minutos num rotor a 30 oscilações / min.
4. Seca-se a superfície de fluxo de ar sobre ela.
5. Iluminar com UV profunda (λ = 180 nm), durante 5 min, a uma certa distância das lâmpadas de UV de cerca de 5 cm (ver folha de Materiais para referência lâmpada; parâmetros irão variar de acordo com diferentes lâmpadas).
6. Prepare a 200 ul de solução de EDC / NHS para cada pedaço de PDMS (isto deve ser preparado imediatamente antes da utilização porque a reactividade da solução decai em questão de horas). Para se 1 ml de 0,05 M de MES + 0,5 M de tampão de NaCl a pH 6,0, adiciona 11,5 mg de Sulfo-NHS e 19,2 mg de EDC.
7. Transferir oPDMS folhas da placa de Petri para a tampa da caixa de Petri, a qual não foi esclarecida. Isto irá assegurar que o ambiente de PDMS são muito hidrofóbicas e facilitar o passo seguinte.
8. Adicionar solução de EDC / NHS e incubar durante 15 min à temperatura ambiente.
9. Enxágüe EDC / NHS com água.
10. Adicionar solução de PLL-g-PEG (0,5 mg / ml em HEPES 10 mM, pH 8,6) e incuba-se a partir de 3 horas a durante a noite à temperatura ambiente.
11. Lavar o PLL-g-PEG com água. PDMS passivadas (funcionalizadas com PLL-g-PEG) podem ser armazenadas durante vários dias a 4 ° C.

2. Padronização do PDMS

1. Pegue uma folha de PDMS e colocá-lo em um photomask quartzo sintético tendo as microestruturas para padronização (veja a Figura 1). Coloque o lado do PDMS tendo a PLL-g-PEG de frente para o lado cromo do photomask.
2. Iluminar durante 7 min através da fotomáscara a uma distância das lâmpadas de UV de cerca de 5 cm.
3. Adicionar água sobre a máscara + PDMS e descascar as PDMS lentamente para fora da máscara.
4. Incubar com uma solução de fibronectina, a 50 mg / mL em tampão de HEPES, a pH 8.6 durante 1 hora à temperatura ambiente. É possível utilizar outras proteínas de ECM, mas estes não foram testados com este protocolo.
5. Lavar com PBS.

3. Montagem do Dispositivo

1. Monte os PDMS anteriormente passivadas para o dispositivo de alongamento (ver discussão para solução de problemas).
   1. Anexar um lado do PDMS para a parte fixa da maca.
   2. Corrigir o outro lado à parte móvel da maca sem apertar demasiado a folha de PDMS.
2. Corte um retângulo de PDMS (22 mm x 19 mm) em um facada PDMS espessura e corte outro retângulo dentro, a fim de ter uma piscina (ou frame) que vai manter as células e meios de comunicação (ver Figura 2).
3. Adicionar graxa de silicone sob este PDMS piscina e colocá-lo no topo da folha de PDMS para criar um medium retenção piscina. A massa vai permitir o deslizamento da piscina sobre a folha de PDMS durante o alongamento.

4. Padronização das Células

1. Retire as células a partir de uma confluência garrafa de cultura de 50% com Versene.
2. Contar as células e ressuspender-los a uma concentração de 200.000 células / ml.
3. Adicionar 1 ml de suspensão de células na piscina (ver discussão para obter detalhes adicionais).
4. Deixe as células ligam-se aos padrões de 10-30 minutos (dependendo do tipo de célula, células EPR-1 terá 10 min, e as células HeLa de 20 min).
5. Lavar suavemente as células flutuantes com meio equilibrada (equilibrar médio na incubadora).
6. Que as células se espalham por algumas horas sobre os padrões (RPE-1 precisará de pelo menos 2 horas; células HeLa terá 3 horas).
7. Adicionar uma lamela por cima da piscina para evitar a evaporação e meio de fuga no caso de o PDMS quebras.
8. Colocar o dispositivo sobre um microscópio invertido e começar a imagiologia. Evite o uso de ob imersão em óleotivos, uma vez que não vai funcionar devido a problemas de foco.

5. Alongamento

1. Gire o parafuso micrométrico enquanto corrige a posição estágio no x, y, e z-axis (principalmente x). A posição de fase deve ser corrigido para compensar o aumento do PDMS e a perda do foco. (Consulte "Durante o trecho" parágrafo na discussão).

Resultados

A técnica apresentada neste protocolo de vídeo permitiu a aplicação de forças sobre as fibras de retração da mitose de células de mamíferos. Com efeito, durante a divisão celular, na fase de mitose, as células de mamíferos retrair a tomar a forma de uma esfera e deixar para trás os cabos de actina finas rodeado por uma membrana, que estão ligadas ao substrato. Estes cabos (fibras de retração), são a memória da geometria da célula antes de entrar em divisão. Fazendo micropadrões com UV profundo através de uma fotom...

Discussão

Embora esta técnica tem sido utilizada inúmeras vezes e é exaustivamente testado, há várias etapas críticas que podem levar a uma experiência fracassada.

Sobre o PDMS:

Para este trabalho, GelPak, uma folha fina de PDMS comercialmente disponível, foi usado. Alternativamente folhas PDMS pode ser convertido diretamente do mix PDMS. Recomendamos a utilização de GelPak porque é mais reprodutível e é menos propensos a quebrar em comparação com custom made PDMS.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
GelPak	GelPak	PF-60-X4	Diferentes espessuras / viscosidade estão disponíveis. Uma alternativa poderia ser lançar seu PDMS  se.
Graxa de silicone	GE Bayer Silicones	Baysilone-Paste	Este é biocompatível
Dispositivo de alongamento	GREM mé Maca Canique	2011
EDC (N- (3-Dimetilaminopropil) -N′ Cloridrato de etilcarbodiimida)	Sigma	3450	Estável 6 meses a -20 & C
NHS (N-Hydroxysulfosuccinimida sodium salt)	Sigma	56485	Protect from humidity
Pll-g-peg (PLL(20)-g[3.5]-PEG(2) 20 mg)	SurfaceSolutions (Zurich)
Fotomáscara de Quartzo Sintético	Toppan		Pegue a fotomáscara binária padrão em
Quartzo Fibronectina de plasma bovino	Sigma	F1141