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Artigo de método

Estudo da fagolisossomo Biogenesis em macrófagos ao vivo

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DOI:

10.3791/51201

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10 de março de 2014

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1Research Group Phagosome Biology, Helmholtz Centre for Infection Research, 2Division of Mycobacterial Research, National Institute for Medical Research

Neste artigo

Resumo

As células fagocíticas desempenhar um papel importante no sistema imune inato de remoção e eliminação de microrganismos invasores nas suas phagosomes. Maturação do fagossoma é o processo complexo e bem regulado durante o qual um phagosome nascente passa por uma transformação drástica por meio de interações bem orquestrados com diversas organelas celulares e compartimentos no citoplasma. Este processo, que é essencial para a função fisiológica das células fagocíticas, dotando phagosomes com suas propriedades líticas e bactericidas, culmina na fusão de fagossomos com lisossomos e biogênese de phagolysosomes que é considerada a última e crucial fase de maturação para phagosomes. Neste relatório, nós descrevemos um método baseado imagens de células vivas para a análise qualitativa e quantitativa do processo dinâmico de lisossoma para phagosome entrega de conteúdo, o que é uma característica da fagolisossomo biogênese. Esta abordagem utiliza microesferas IgG revestidas como um modelo para phagocytose e moléculas de dextrano fluoróforos como uma sonda de carga lisossômico luminal, a fim de acompanhar a entrega dinâmica de conteúdo lysosmal aos phagosomes em tempo real em macrófagos ao vivo usando imagens time-lapse e microscopia confocal a laser. Aqui vamos descrever em detalhe o plano de fundo, as etapas de preparação e configuração passo-a-passo experimental para permitir a implantação fácil e preciso desse método em outros laboratórios. Nosso método descrito é simples, robusta, e mais importante, pode ser facilmente adaptado para estudar as interações phagosomal e maturação em diferentes sistemas e em várias configurações experimentais, tais como uso de vários tipos de células fagocíticas, experiências de perda de função, as diferentes sondas e partículas fagocíticas.

Introdução

Fagócitos profissionais, incluindo macrófagos, desempenham um importante no sistema imune. Para além de ser a primeira linha de defesa do sistema imune inato, eles também desempenham um papel crítico na activação da imunidade adaptativa através da sua sinalização e apresentação de antigénio papel 1-3. Enquanto a função de fagócitos profissionais é multifacetada, maturação do fagossoma é crítica a espinha dorsal da função de processamento de antigénio e bactericida dos fagócitos profissionais 4,5. Após a imersão e absorção de um alvo fagocíticas, tais como bactérias receptor mediada, o fagossomo nascente passa por uma seqüência complexa e bem orquestrada de interação e intercâmbio com compartimentos da rede endocítica e várias outras organelas celulares 6. A natureza dos compostos trocados com essas entidades celulares, bem como a regulação e do calendário de eventos de fusão determina a phagosomal meio luminal e as phagoscomposição omal membrana e, portanto, 7, o destino do phagosome amadurecimento 8.

A relevância fisiológica da maturação do fagossoma é exemplificado pelas diversas estratégias empregadas por vários patógenos intracelulares para escapar, prender ou subverter maturação phagosome 9. A maioria destas estratégias directamente ou indirectamente impedir a fase final e crítica do processo de maturação do fagossoma: a fusão do fagossoma com tardias compartimentos endossomal / lisossomal, que lhes confere, com a maior parte das enzimas hidrolíticas e factores anti-bacteriana de um fagossoma madura 7 , 8,10. A análise desta etapa final e crítico, portanto, pode fornecer-nos com fortes indicadores sobre o estado de maturação das phagosomes e se o estado fisiológico natural está a ser positiva ou negativamente afetados nas configurações experimentais particulares que estão sendo utilizados.

O compartimento final endossomal / lisossomals são geralmente considerados como os compartimentos de terminais da via endocítica, definidos e distintos dos compartimentos endocíticas início com a presença de vários, Palco, moléculas marcadoras específicas. Por exemplo enzimas hidrolíticas ou componentes de membrana tais como proteínas de membrana Lysosomal associados (lâmpadas), entre outros 11. O terminal endocítico compartimentos-doravante referidos simplesmente como lisossomos-também servir como o principal local para as fases finais da digestão no final do fagocitária / endocítico caminho 12. Deste modo, as sondas não digeríveis podem ser carregados através de endocitose e macropinocitose do meio extracelular e transportado através da via endocítica para os lisossomas, onde se acumula 13,14 depois de seguir um ciclo de absorção definido e perseguição. Sondas fluoróforos para a microscopia de fluorescência, tais como o dextrano não digerível polímero orgânico são geralmente usados ​​como endocyticprobes 15-17.

Neste método, que descrevem a utilização de micro-esferas revestidas com IgG como carga fagocítica investigar maturação do fagossoma, analisando a entrega do conteúdo luminal lisossomal para fagossomas. Ao usar uma sonda dextrano fluoróforo conjugado como um marcador facilmente detectável dos lisossomos na medula óssea ao vivo macrófagos derivados (BMM) e imagens de vídeo time-lapse com um microscópio de varredura a laser confocal, acompanhamos o processo dinâmico de entrega da carga em phagosomes com alta resolução temporal. Em seguida, descrevem como os dados de imagens de lapso de tempo coletados podem ser avaliados usando o código-fonte aberto e software de análise de imagens disponíveis gratuitamente, Fiji (ou ImageJ), e analisados ​​estatisticamente usando o Microsoft Excel e apresentados utilizando software GraphPad Prism 14,18.

Após a descrição do nosso método, experiências análogas podem ser projetados usando as configurações e os fatores modificados para investigar sua influência na maturação phagosome; praticamente qualquer otseu tipo de células fagocíticas primárias ou de linha de células aderentes, perda genética de experimentos de função, incluindo gene knock-out e knock-down, mutantes ou expressão de proteínas de fusão, fagocíticas-alvos, compostos de revestimento microbead, sondas endosomal / lisossomais e fatores de citocinas, inibidores químicos, ou siRNA entre outros, são todos variáveis ​​que podem ser aplicadas à abordagem básica deste método.

Definimos o objetivo e os requisitos básicos deste método da seguinte forma:

  • Objetivo do método: para permitir a observação directa, quantitativa e qualitativa e análise de maturação do fagossoma com alta resolução temporal em células fagocíticas vivo.
  • Carga fagocítica: Uma micropartícula apropriadamente revestidos ou alvo biológico. Aqui usamos IgG-revestido 3 mM micropartículas de poliestireno esféricas que são rapidamente internalizados através do receptor de Fc-γ fagocitose mediada. Alternativamente, qualquer microrganismo ou microfone revestidoroparticle para o qual um receptor de fagocítica está presente nas células pode ser utilizado.
  • As células fagocíticas: células fagocíticas aderentes que expressam os receptores apropriados fagocíticas. Aqui usamos primários BMMs rato que abundantemente expressam os receptores Fc-γ. Alternativamente, as células dendríticas (DC), monócitos ou células epiteliais fagocíticas ou seus mutantes ou variantes genéticas knock-out podem ser usados.
  • Carga Lysosomal: Uma sonda fluorescente etiquetado lisossômico. Aqui, conjugado com vermelho do Texas 70000 kDa dextrano (Dex70kD) é usado como carga o lúmen dos lisossomos. Alternativamente, qualquer marcador detectável por fluorescência de um compartimento celular ou organelo, ou uma sonda adequada para propriedades phagosomal como acidez ou de degradação da capacidade, pode ser utilizado para estudar a progressão da maturação do fagossoma.
  • Fatores que influenciam: Por exemplo, moléculas de sinalização, compostos químicos, gene knock-down, ou expressão transitória de proteínas mutantes poderia. Aqui, nós Forgum uso de tal fator para uma questão de simplicidade, mas para um exemplo recente com a expressão da proteína mutante e knock-down que influenciam fatores por favor ver Kasmapour et al. 18 Qualquer fator que pode afetar a fagocitose ou as circunstâncias e mobilidade dos phagosomes e / ou os compartimentos que interagem com phagosomes maturação poderia potencialmente ser usada.

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Protocolo

Cuidados com os animais e todos os procedimentos neste protocolo seguir as diretrizes institucionais e nacionais.

Prepare as preparações que são indicados por "Π-" de antemão.

1. Preparação de BMMs

  1. Execute o abate dos ratos por deslocamento cervical.
  2. Retirar fémur e ossos da tíbia, ossos isentos de tecido e cortar ambas as extremidades para a acessibilidade da medula óssea.
  3. Manter ossos em PBS gelado ou meio DMEM gelado (suplementado com 100 U / ml de penicilina e 100 ug / ml de estreptomicina, em gelo até que o próximo passo.
    Nota: Siga as seguintes etapas em uma cabine de segurança biológica classe II para minimizar o risco de contaminação.
  4. Lave a cavidade medular com PBS frio + penicilina / estreptomicina, utilizando um 26 G (0,45 mm) de agulha ligada a uma seringa de 1 ml.
  5. Células por centrifugação suave a 350 g durante 10 min, ressuspender o sedimento em med BMMium e placa em microbiologia estéril não revestida placas de Petri.
    1. Preparação do meio BMM
      • Modified Eagles Médium da Dulbecco DMEM
      • 10% de FCS inactivado
      • 20% de fibroblastos de rato linha L929 célula sobrenadante da cultura (fonte de fator estimulante de colônias de macrófagos, M-CSF)
      • 5% de soro de cavalo
      • 2 mM de glutamina
    2. Preparação da linha de meio de cultura celular L929;
      • RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640
      • 10% de FCS inactivado
      • 2 mM de glutamina
    3. Preparação de fibroblastos de rato L929 linha celular sobrenadante da cultura;
      • Células confluentes L929 foram divididas 1:04, cultivadas em frascos de 175 centímetros 2 durante 2 dias, utilizando 20 ml de meio de L929 e o sobrenadante de cultura foi recolhido após 48 h, filtrada e adicionada ao meio-BMM
  6. Incubar as células liberadas a partir deo fémur numa incubadora a 37 ° C em 5% de CO2.
  7. Após cada 48 horas (máximo 72 horas) de incubação, aspirar o meio e substituir por meio BMM fresco, por até 10 dias. Mais de 95% das células foram positivas para CD14 como testado por citometria de fluxo. CD14 é um receptor de reconhecimento de padrões expresso principalmente pelos macrófagos. Por meio da determinação da percentagem de células positivas para este receptor, de uma cultura pura de BMMs aderentes foi gerado.

Nota: preparar e cultura das células de acordo, se forem utilizados outros tipos de células.

2. Revestimento de Microbeads como fagocítica Carga

  1. Para a preparação de 1 ml de suspensão de esferas, utilizar 400 ul de 2,5% de 3 mM de micropartículas de poliestireno carboxiladas ou micropartículas alternativos.
  2. Transferência da suspensão de esferas para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, lavar 3x com PBS e adicionar 100 ul de 500 mM de 2 - (N-morfolino) etanossal de sódio do ácido ulfonic, tampão MES a pH 6,7 para o sedimento talão.
  3. Dissolve-se 50 ug de IgG de rato (anticorpo IgG policlonal) em 50 ul de ddH2O estéril e adicionar a suspensão de pérolas.
  4. Encher a suspensão até 1 ml com ddH 2 O estéril (450 mL).
  5. Incubar a solução durante 15 minutos numa roda rotativa à temperatura ambiente.
  6. Prepare EDAC reticulante, N-(3-dimetilaminopropil)-N'-etilcarbodiimida a uma concentração de 10 mg / ml e adicionar 14 ul de suspensão de esferas.
    Nota: EDAC ligações cruzadas grupos amino da IgG com os grupos carboxilo sobre a superfície das pérolas e facilita a imobilização da IgG na superfície do grânulo. Isto é crítico para a captação do grânulo e, por conseguinte, a solução deve ser preparada de fresco.
  7. Incubar a suspensão sobre uma roda rotativa, durante 1 h à TA.
  8. Adicionar 14 ul de EDAC de reticulação e incubar a suspensão sobre uma roda rotativa, durante 1 h à TA.
  9. Centrifugar a suspensão a 10.000 xg durante 2 minutos numa microcentrífuga.
  10. Lavar as pérolas 3x em tampão de paragem (1% de Triton X-100 em Tris 10 mM, pH 9,4), a fim de parar a reacção de reticulação, por ressuspensão do sedimento em tampão de paragem e girando a solução a 10000 g durante 2 min.
  11. Lavar as pérolas 3x em PBS e ressuspender o pellet em 1 ml de PBS.
    Opcional: Preparar alíquotas de trabalho de 30-50 mL.
  12. Armazenar a suspensão de contas de IgG-revestidas a 4 ° C durante não mais de 4 semanas e não permitir que a suspensão a ser congelado.

Nota: Um conservante, tal como azida de sódio a uma concentração final de 0,02% (w / v) pode ser adicionada à suspensão para prevenir o crescimento bacteriano e contaminação. Neste caso, a lavagem das esferas, antes da sua utilização tem de ser realizada para evitar os efeitos citotóxicos do agente de conservação. Centrifugar um volume de suspensão a 10.000 xg durante 2 minutos e lavar as contas por novasuspender o sedimento em PBS. Repita 3x de lavar.

3. Preparação do dextrano Sonda da Solução

  1. Dissolve-se o vermelho de Texas 70000 kDa dextrano (Dex70kD) em PBS a 20 mg / ml e armazenar a -20 ° C, de acordo com as instruções do fabricante.
    Nota: Mantenha os estoques a -20 ° C por até vários meses, ou a 4 ° C por algumas semanas, consulte a documentação do fabricante.
  2. Preparar a solução de dextrano para a experiência da diluindo-o em DMEM meio de cultura celular completo (DMEM, 10% FCS, 2 mM de L-glutamina) a aproximadamente 1 mg / ml (várias vezes solução concentrada que irá ser diluído com o concentração final de trabalho de 20 ug / ml antes da adição às células).
  3. Usar um banho de água de ultra-sons a sonicar a alíquota de dextrano durante 5 minutos para homogeneizar a solução e dissolver os agregados que poderiam mais tarde levar a geração artefacto durante o exame.
  4. Centrifugar a máxima gdurante 5 minutos numa microcentrífuga para remover quaisquer aglomerados não dissolvidas ou de contaminantes a partir da solução.
  5. Mover cuidadosamente o sobrenadante para um tubo novo, evitando o sedimento no fundo do tubo e dilui-se a solução para a concentração de trabalho final de 20 ug / ml em meio de cultura DMEM célula completa.
  6. Filtrar a solução estéril usando um filtro de seringa de 0,2 fim montado.

4. Dextran pré-carregamento

  1. Células de sementeira em um imagens de células com fundo de vidro prato vivo e incubar durante pelo menos 12 horas (a 37 ° C em 5% de CO2) para garantir a fixação e de aclimatação.
    Nota: Há vidro segmentado pratos de fundo disponíveis que permitem executar várias experiências (até quatro compartimentos) por prato.
  2. Prepare o dextrano em solução DMEM, conforme descrito no Protocolo no 3. Aquecer o dextrano preparado em solução de DMEM, usando um banho de água a 37 ° C.
  3. Aspirar meio de umnd adicionar solução de dextrano às células cuidadosamente e incuba-se a 37 ° C em 5% de CO2 durante 2-8 horas, para a absorção.
    Nota: Plano e optimizar o protocolo de acordo com o tipo de sonda e de células que é utilizado e estritamente manter a esta duração quando repetindo experiências. Isto é essencial para o perfil de acumulação de dextrano na via endocítica e, assim, a reprodutibilidade dos experimentos.
  4. Lave as células 3x com pré-aquecido meio DMEM completo, médio aspirado e lavar as células com cuidado com meio fresco.
  5. Incubar as células com meio DMEM completo para 4-12 horas a 37 ° C em 5% de CO2.
  6. Lave as células uma vez com fenol filtrada meio DMEM sem vermelho completo pré-aquecido.
  7. Para obter resultados de imagem ideal, a mudança para pré-aquecido completa fenol filtrada meio DMEM sem vermelho, pelo menos, 30 minutos antes do início da imagem. Vermelho de fenol pode causar extinção de sinais fluorescentes, aumentando o ruído de fundo e, assim, reduzir o contraste da imagem e clareza.

Nota: Configure o microscópio e as configurações de imagem de antecedência, de acordo com o protocolo pré-planejada e otimizada com base no tipo de sonda e células que são usadas.

5. Adicionando Contas IgG-revestidos

  1. Equilibrar uma alíquota de 1% preprepared suspensão de esferas para a TA e sonicar num banho de água de ultra-sons durante 2-3 min.
  2. Adicionar 1-6 ul da suspensão de esferas de 1% para o meio completo filtrada fenol-vermelho livre de DMEM sob uma cabine de segurança biológica de classe II para minimizar o risco de contaminação (uma boa concentração de partida é de 1 ^ l / 2 cm2 de superfície prato).
    Nota: aqui BMMs foram semeadas a 25000 células / poço e de 6 mL de uma% suspensão de esferas foi adicionado ao meio no prato. Isto iguala aproximadamente uma proporção de grânulo / célula de 15:01. A proporção tem de ser ajustado para o tipo de células que é utilizado e ao material do cordão, i.e. esferas de látex têm baixa densidade e não vão para o fundo rapidamente, enquanto esferas de poliestireno pia e entram em contato com as células aderentes muito mais rápido e, portanto, em maior número.
    Nota: Dependendo da experiência, que pode ser uma vantagem para seleccionar a região que vai ser observada em avanço. Suspensão de esferas pode então ser adicionado apenas para que a região específica de o fundo da placa de vidro, por conseguinte, aumentando a probabilidade de observar os eventos de absorção favoráveis.
  3. A nuvem densa de esferas podem ser difundido pipetando suavemente a suspensão no fundo da placa de vidro.
  4. Espere até que os grânulos vão para o fundo do prato de vidro de fundo e estão aproximadamente no mesmo plano com as células fagocíticas aderentes.
  5. Concentre-se na região de interesse (ROI) e começar a imagem time-lapse.

Nota: Pode ser necessário ajustar o foco enquanto gráfica se encontra em andamento, de acordo com o sistema de imagem que é usado, o seu stabilidade e a mobilidade das células observadas. No entanto, note que isso pode tornar impossível, a análise adequada de phagosomes que fortemente se desviam do plano de foco, como resultado de reorientação.

6. Imagem

Siga as orientações gerais a seguir para a qualidade de imagem ideal;

  1. Use um sistema de imagem confocal, como um sistema a laser de varredura ou disco giratório.
    Nota: A Leica TCS SP5 AOBS Laser confocal microscópio de varredura controlado pelo software Leica LAS AF e equipado com uma câmara de controle ambiental foi usado aqui para imagens de vídeo time-lapse.
  2. Otimizar as configurações de imagem, como velocidade de digitalização, ampliação, resolução, etc. de forma a permitir uma taxa de uma armação em cada 7-20 segundos, dependendo do sistema utilizado.
    Nota: Aqui, uma velocidade de varredura de 200 Hz, zoom de 2x e um scanner de linha média de 2 a 3 vezes em uma resolução de 512 x 512 pixels resuLted em um tempo de gravação entre 3-5 seg / rame. A taxa de um quadro em cada 10 segundos foi usado para gravar filmes de lapso de tempo com duração de pelo menos 120 min.
  3. Use as configurações de excitação / emissão adequadas com base no sistema utilizado imagens e sonda (s).
    1. Otimizar as configurações para evitar excessiva de foto-branqueamento.
      Nota: Aqui, o vermelho do Texas dextrano 70kD foi animado utilizando um DPSS (561 nm) e a emissão de luz do laser foi detectado por um detector de híbrido Leica (HYD) a 600-650 nm, com o pico de emissão a 610 nm. Intensidade do laser tem de ser adaptado para a intensidade de sinal e mantido tão baixo quanto possível para minimizar o foto-branqueamento do fluoróforo (s) e foto toxicidade efeito da luz do laser sobre as células. Geralmente, é importante equilibrar a velocidade de varredura, linha média, resolução de digitalização, intervalo do quadro e da duração da imagem para obter a intensidade de sinal adequado e estável e capturar a duração completa de captação de grânulo e phagosome maturação processo.
  4. Incluir uma brilhante campo (BF) canal para observar as contas, se eles não são conjugados com um fluoróforo.
    Nota: Para além do canal de Texas Red, canal BF foi utilizado para visualizar as esferas, o mesmo laser DPSS foi usado tal como foi detectado a fonte luminosa e o sinal com um fotomultiplicador (PMT) do detector.
    Nota: Certifique-se de aplicar as configurações de gravação idênticos quando a aquisição de dados que está a ser agrupadas. Parâmetros mais importantes são: intensidade do laser de excitação, configuração, definições de detector de aquisição, ampliação e intervalos de quadros. Não usar intervalos de quadros idênticos exigirá um passo curva de média como os pontos de dados de observação não se sobrepõem (por exemplo, para agrupar uma observação com quadros adquiridos a cada 7 segundos com um outro conjunto de quadros a cada 12 segundos). Isso aumentaria os passos necessários para a avaliação dos dados e requer software adicional com função curva-média, como OriginLab 's Origin software Pro estatísticas ( http://www.originlab.com/ ).
  5. De preferência, salvar o vídeo time-lapse no arquivo de formato nativo do sistema de imagens utilizado e evitar exportar em formatos compactados.

Nota: Aqui, os filmes de lapso de tempo foram salvos no formato Leica LAS AF nativo de arquivos, que foram importados diretamente para abrir em Fiji (LIF.). Fiji é capaz de ler os formatos de arquivos nativos da maioria dos fabricantes de microscópios que utilizam o incluída Bio formatos importador plug-in. Exportando o arquivo de filme de lapso de tempo em uma série de imagens com JPG ou TIFF ou como um arquivo de vídeo em formato AVI recipiente não é necessário nem recomendado. Além de preservar a melhor qualidade de imagem possível a partir da observação original, evitando algoritmos de compressão com perdas (por exemplo, JPEG), utilizando o formato de arquivo nativo microscópio assegura que os meta-dados do arquivo (carimbos de tempo, de ampliação, de laser e de aquisição de intensidades, Configurações detector etc) é preservada e disponível para Fiji. No entanto, se por qualquer motivo, os arquivos de vídeo time-lapse precisam ser exportados em um formato diferente para a análise, certifique-se de usar formatos de arquivo sem compressão, como a série de imagens TIFF e cor RGB separados (vermelho, verde, azul) canais já nesta passo, como Fiji, muitas vezes não se pode separar com sucesso o canal de BF de outros canais de cores em arquivos exportados. Além disso, certifique-se de preservar os arquivos originais do microscópio como uma referência.

7. Análise dos Time-lapse Filmes

  1. Use ImageJ, Fiji ou qualquer outro software que fornece uma capacidade de análise de associação de sinais análogos.
    Nota: Aqui, Fiji foi utilizado para a análise de filmes de lapso de tempo. Fiji é uma distribuição ImageJ contendo um pacote de processamento de imagem com menus de ferramentas reorganizados e plug-ins nativos adicionais, disponíveis para download gratuito em http://fiji.sc . O processo descrito nesta seitade iões é apresentado na Figura 2.
  2. Abra o arquivo em Fiji, clicando em "Arquivo", "Abrir" e escolher o arquivo, ou ao arrastar e soltar o arquivo para Fiji.
  3. Escolha as seguintes opções;
    1. Empilhe visualização: Vista acumulam com hyperstack,
    2. As opções de cor: Modo de cor colorida,
    3. Divisão de canais em janelas separadas: Divisão de canais (para cada canal de cor RGB que foi gravada uma janela separada será aberta).
  4. No caso de uma série de imagens é para ser usado, coloque a série para Fiji, indo para "Arquivo", "Importar", "Sequência de Imagens" e escolha qualquer arquivo de imagem na pasta que contém a série imagem de destino.
    1. Defina os filtros e as condições para carregamento imagens selecionadas da série, por exemplo;
      1. Número de imagens: quantos quadros são para ser carregado.
      2. A partir da imagem: qual a imagem é o quadro de partida na série.
      3. Incremento: o incremento entrequadros a serem carregados (cada quadro, cada segundo quadro, etc.).
      4. O nome do arquivo contém: a filtragem de canal específico usando o nome do arquivo (por exemplo, definindo "c001", que é como normalmente as imagens do "Canal 1" são rotulados após cor-separação de um vídeo time-lapse multicanal).
  5. Remover dimensionamento, indo para "Analisar", "Definir escala ...", marcando a caixa "Global" e clicando em "Clique para remover escala".
    Nota: Este passo permite a análise à base de pixel das imagens no caso ampliações diferentes foram utilizadas para os vários conjuntos experimentais que estão a ser avaliadas. Se as configurações de ampliação sempre foram mantidas constantes eo arquivo microscópio nativa foi importado diretamente para Fiji, esta etapa pode ser ignorada, como Fiji possam compreender e utilizar os dados de ampliação de escala e de metadados do arquivo microscópio.
  6. Configure parâmetro de mediçãos, indo para "Analisar", "Definir Medidas" e verificando as seguintes caixas: "Área", "Desvio Padrão", "densidade integrada", "etiqueta de Display" e "valor de cinza média".
  7. Redirecionar para o canal de cores que contém o sinal da sonda que está a ser medido e confirme com "OK".
  8. Ir para o quadro, em que as medições devem ser iniciados e seleccionar o canal de janela BF clicando sobre a borda superior da janela.
  9. Use a "ferramenta de seleção oval" para selecionar uma região de interesse (ROI), ou seja, um ROI circular na esfera internalizado. Assegure-se que a selecção é montado rigidamente até ao bordo exterior do rebordo como se vê no canal de BF.
    Nota: Ao usar um PC, segure a tecla Shift enquanto estiver usando a ferramenta de seleção para garantir um ROI circular.
  10. Inicie a medição de forma otimizada alguns quadros antes da imersão total do cordão está concluído e observe oquadro no qual uma nascente talão-phagosome completamente formada é formada eo cálice fagocitária está fechada. Isto deve ser relativamente claramente discernível no canal de BF.
  11. Vá em "Analisar" e clique em "Measure" para executar a medição, o resultado será exibido em uma janela separada intitulada "Resultados".
  12. Ir para o quadro seguinte, ajustar a posição do ROI no caso de o cordão se desloca, e repetir a medição. O resultado irá ser adicionado à lista na janela de resultado, cada quadro analisado pode ser identificado com base no valor na coluna "etiqueta".
    Nota: Usando as teclas de atalho (por exemplo, "m" para a medida) pode acelerar significativamente o processo de avaliação, ver a lista de atalhos e atribuir os trajes sob o menu "Plugins".
  13. Depois de completar a medição de todos os quadros relevantes, os resultados podem ser copiados para um aplicativo de planilha, como o Microsoft Excel. A coluna "IntDen" descreve o intensities da área selecionada no canal que a medida foi redirecionado para.

8. Correção Branqueamento

Dependendo da sonda utilizada e as definições de imagem, foto-branqueamento pode ocorrer. Dependendo de sua extensão, isto pode afetar fortemente o resultado da avaliação. No entanto, este efeito pode ser parcialmente corrigido pela aplicação de uma taxa igual mas oposto da variação dos valores medidos. Se estiver presente, o coeficiente de foto-branqueamento pode ser calculado medindo a diminuição dependente do tempo, a intensidade de sinal em toda a estrutura, ou área especificamente recortada da moldura, durante o período de tempo relevante para a análise de cada fagossoma. Este processo é ilustrado nas Figuras 3 e 4.

  1. Sob o menu "Plugins" de Fiji, use o "Time Series Analyzer" plug-in para determinar a diminuição geral em toda a quadro, ou ROI intensidade específica sinal da sonda ao longo do tempo (Figura 3).
    Nota: Time Series Analyzer plug-in está disponível para download em http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/time-series.html , caso ainda não estiver presente no menu Plugins.
  2. Traçar a medida contra o tempo (em segundos) em MS Excel, somente para os quadros que correspondem aos quadros de uma phagosome analisado.
  3. Aplique uma linha de tendência linear (Figura 4A) para a trama, uma inclinação negativa para o sinal diminuindo indica a presença de efeito de branqueamento foto.
  4. Aplique a inclinação revertida para valores de um phagosome analisado (Figuras 4B e 4C): intensidade do sinal corrigido (SI) = matéria-SI + (tempo em segundos * inclinação para trás)

Nota: cada um phagosome analisada terá um período de tempo específico (a partir de quadro absorção completa) durante um filme de lapso de tempo gravado, o foto-bleaching deve ser recalculado para esse período específico e será válido apenas para corrigir os valores medidos a partir daquela phagosome específico.

9. Avaliação dos dados

  1. Agrupar os dados e calcular o erro médio e estatístico dos valores corrigidos de branqueamento em software apropriado.
  2. Plotar os dados avaliados de uma forma adequada.

Nota: Aqui, as estatísticas científicas e plotagem software GraphPad Prism ( http://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ foi usado). Software Prism é capaz de gerar e traçar uma curva média com os indicadores de erro correspondente, desde que todos os dados tenham a mesma taxa de quadros (ou seja, todos foram adquiridos com nos mesmos intervalos, como por exemplo uma estrutura a cada 10 segundos).

Nota: Grandes variações dos valores absolutos SI dentro de repetições do mesmo experimconjunto ent introduzirá muito grande erro estatístico e tornar os dados inutilizáveis. Este pode ser o caso se o protocolo, por exemplo, configurações de imagem, não são mantidas estritamente idêntica entre diferentes repetições da experiência que são para ser coligidos.

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Resultados

A preparação correcta das células e as pérolas de imagiologia é crítica. Figura 1 mostra o contorno da semeadura, a sonda de carregamento e as etapas iniciais de imagem neste método, com base no nosso protocolo optimizado para BMMs. É, portanto, essencial que os parâmetros de protocolo ser testada e optimizada, dependendo do tipo de células e as sondas que são para ser usados.

Após a adição dos grânulos revestidos com IgG às células pré-carregadas, é importante que o campo d...

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Discussão

Na seção seguinte, vamos discutir as etapas críticas do método apresentado e as suas limitações. Além disso, iremos ligar alguns dos problemas comuns com as suas soluções, introdução de modificações possíveis e considerar as vantagens de nosso método, bem como métodos complementares adequadas para esta abordagem.

A preparação dos grânulos, incluindo o acoplamento de IgG para a superfície do grânulo, é essencial e deve ser evitado o uso de preparações unfresh. Em adição a isso, também é funda...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Agradecemos a membros do Laboratório de Biologia phagosome para a leitura crítica do manuscrito. Este trabalho é apoiado por uma bolsa de Helmholtz Young Investigator (Iniciativa e os fundos de rede da Associação Helmholtz) e um Programa Prioritário SPP1580 Grant do Conselho de Pesquisa Alemão (Deutsche Forschungsgemeinschaft, DFG).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Meio de Eagles Modificado de Dulbecco (D-MEM)PAA, ÁustriaE15-009
Meio de Eagles Modificado de Dulbecco sem vermelho de fenol (D-MEM)PAA, ÁustriaE15-047
Soro Fetal Bovino (FBS)PAA, ÁustriaA15-151
L-GlutaminaPAA, ÁustriaM11-004
PBSPAA, ÁustriaH15-002
Penicilina/EstreptomicinaPAA, ÁustriaP11-010
WillCo-dish® Prato de fundo de vidro (35 mm &vazio;, #1.5)WillCo Wells, HolandaGWSt-3522
Prato de fundo de vidro CELLviewTM, 35 mmGreiner Bio one, Alemanha627871Alternativa: Disponível como
microesferas de látex carboxiladoPolysciences, USA#09850Disponível em diferentes diâmetros, usamos 3 μ m
Micropartículas de poliestirenoKisker Biotech, AlemanhaPPs-3.0COOH
Triton-X 100ROTH, Alemanha305.1.3
camundongo inteiro IgG Rockland, EUA010-0102
Reticulador EDACSigma-Aldrich, EUAE6383-1g
10 mM TrisSigma-Aldrich, EUAT1503
Seringa de 1 ml Omnifix -FB.Braun, Alemanha9161406V
26  Agulha G (0,45 * 25 mm)B.Baun, Alemanha4657683
RPMI 1640PAA, ÁustriaE15-039
Soro de cavaloGibco, EUA16050-122
MES hidratoSigma-Aldrich, EUAM2933
0,2 μ Filtro montado em seringa MSartorius, Alemanha83.1826.001
segmentadas

Referências

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