As células fagocíticas desempenhar um papel importante no sistema imune inato de remoção e eliminação de microrganismos invasores nas suas phagosomes. Maturação do fagossoma é o processo complexo e bem regulado durante o qual um phagosome nascente passa por uma transformação drástica por meio de interações bem orquestrados com diversas organelas celulares e compartimentos no citoplasma. Este processo, que é essencial para a função fisiológica das células fagocíticas, dotando phagosomes com suas propriedades líticas e bactericidas, culmina na fusão de fagossomos com lisossomos e biogênese de phagolysosomes que é considerada a última e crucial fase de maturação para phagosomes. Neste relatório, nós descrevemos um método baseado imagens de células vivas para a análise qualitativa e quantitativa do processo dinâmico de lisossoma para phagosome entrega de conteúdo, o que é uma característica da fagolisossomo biogênese. Esta abordagem utiliza microesferas IgG revestidas como um modelo para phagocytose e moléculas de dextrano fluoróforos como uma sonda de carga lisossômico luminal, a fim de acompanhar a entrega dinâmica de conteúdo lysosmal aos phagosomes em tempo real em macrófagos ao vivo usando imagens time-lapse e microscopia confocal a laser. Aqui vamos descrever em detalhe o plano de fundo, as etapas de preparação e configuração passo-a-passo experimental para permitir a implantação fácil e preciso desse método em outros laboratórios. Nosso método descrito é simples, robusta, e mais importante, pode ser facilmente adaptado para estudar as interações phagosomal e maturação em diferentes sistemas e em várias configurações experimentais, tais como uso de vários tipos de células fagocíticas, experiências de perda de função, as diferentes sondas e partículas fagocíticas.
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Artigo de método
Estudo da fagolisossomo Biogenesis em macrófagos ao vivo
Neste artigo
Resumo
Introdução
Fagócitos profissionais, incluindo macrófagos, desempenham um importante no sistema imune. Para além de ser a primeira linha de defesa do sistema imune inato, eles também desempenham um papel crítico na activação da imunidade adaptativa através da sua sinalização e apresentação de antigénio papel 1-3. Enquanto a função de fagócitos profissionais é multifacetada, maturação do fagossoma é crítica a espinha dorsal da função de processamento de antigénio e bactericida dos fagócitos profissionais 4,5. Após a imersão e absorção de um alvo fagocíticas, tais como bactérias receptor mediada, o fagossomo nascente passa por uma seqüência complexa e bem orq....
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Protocolo
Cuidados com os animais e todos os procedimentos neste protocolo seguir as diretrizes institucionais e nacionais.
Prepare as preparações que são indicados por "Π-" de antemão.
1. Preparação de BMMs
- Execute o abate dos ratos por deslocamento cervical.
- Retirar fémur e ossos da tíbia, ossos isentos de tecido e cortar ambas as extremidades para a acessibilidade da medula óssea.
- Manter ossos em PBS gelado ou meio DMEM gelado (suplementado com 100 U / ml de penicilina e 100 ug / ml de estreptomicina, em gelo até que o próximo passo.
Nota: Siga as seguintes etapa....
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Resultados
A preparação correcta das células e as pérolas de imagiologia é crítica. Figura 1 mostra o contorno da semeadura, a sonda de carregamento e as etapas iniciais de imagem neste método, com base no nosso protocolo optimizado para BMMs. É, portanto, essencial que os parâmetros de protocolo ser testada e optimizada, dependendo do tipo de células e as sondas que são para ser usados.
Após a adição dos grânulos revestidos com IgG às células pré-carregadas, é importante que o campo d.......
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Discussão
Na seção seguinte, vamos discutir as etapas críticas do método apresentado e as suas limitações. Além disso, iremos ligar alguns dos problemas comuns com as suas soluções, introdução de modificações possíveis e considerar as vantagens de nosso método, bem como métodos complementares adequadas para esta abordagem.
A preparação dos grânulos, incluindo o acoplamento de IgG para a superfície do grânulo, é essencial e deve ser evitado o uso de preparações unfresh. Em adição a isso, também é funda.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Agradecemos a membros do Laboratório de Biologia phagosome para a leitura crítica do manuscrito. Este trabalho é apoiado por uma bolsa de Helmholtz Young Investigator (Iniciativa e os fundos de rede da Associação Helmholtz) e um Programa Prioritário SPP1580 Grant do Conselho de Pesquisa Alemão (Deutsche Forschungsgemeinschaft, DFG).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Meio de Eagles Modificado de Dulbecco (D-MEM) | PAA, Áustria | E15-009 | |
| Meio de Eagles Modificado de Dulbecco sem vermelho de fenol (D-MEM) | PAA, Áustria | E15-047 | |
| Soro Fetal Bovino (FBS) | PAA, Áustria | A15-151 | |
| L-Glutamina | PAA, Áustria | M11-004 | |
| PBS | PAA, Áustria | H15-002 | |
| Penicilina/Estreptomicina | PAA, Áustria | P11-010 | |
| WillCo-dish® Prato de fundo de vidro (35 mm &vazio;, #1.5) | WillCo Wells, Holanda | GWSt-3522 | |
| Prato de fundo de vidro CELLviewTM, 35 mm | Greiner Bio one, Alemanha | 627871 | Alternativa: Disponível como |
| microesferas de látex carboxilado | Polysciences, USA | #09850 | Disponível em diferentes diâmetros, usamos 3 μ m |
| Micropartículas de poliestireno | Kisker Biotech, Alemanha | PPs-3.0COOH | |
| Triton-X 100 | ROTH, Alemanha | 305.1.3 | |
| camundongo inteiro IgG Rockland | , EUA | 010-0102 | |
| Reticulador EDAC | Sigma-Aldrich, EUA | E6383-1g | |
| 10 mM Tris | Sigma-Aldrich, EUA | T1503 | |
| Seringa de 1 ml Omnifix -F | B.Braun, Alemanha | 9161406V | |
| 26 Agulha G (0,45 * 25 mm) | B.Baun, Alemanha | 4657683 | |
| RPMI 1640 | PAA, Áustria | E15-039 | |
| Soro de cavalo | Gibco, EUA | 16050-122 | |
| MES hidrato | Sigma-Aldrich, EUA | M2933 | |
| 0,2 μ Filtro montado em seringa M | Sartorius, Alemanha | 83.1826.001 |
Referências
- Greenberg, S., Grinstein, S. Phagocytosis and innate immunity. Curr. Opin. Immunol. 14, 136-145 (2002).
- Jutras, I., Desjardins, M. Phagocytosis: at the crossroads of innate and adaptive immunity. Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 21, 511-527 (2005).
- Iwasaki, A., Medzhit....
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Reimpressões e permissões
