Produção eficiente e Purificação de recombinante murino Kindlin-3 a partir de células de insetos de Estudos biofísicos

Resumo

Kindlins são fundamentais para a adesão celular através de integrinas mas os estudos deles foram prejudicados pela dificuldade encontrada em expressá-las de forma recombinante em hospedeiros bacterianos. Descrevemos aqui métodos para a sua produção eficiente em células de insecto infectadas com baculovírus.

Resumo

Kindlins coativadores são essenciais, com talina, dos receptores de integrinas da superfície celular e também participar na integrina de fora para dentro de sinalização, e o controlo de transcrição do gene no núcleo da célula. Os kindlins são ~ 75 kDa proteínas vários domínios e se ligam a um motivo NPxY ea montante grupo T / S da cauda citoplasmática integrina β-subunidade. A isoforma kindlin hematopoietically importante, kindlin-3, é essencial para a agregação de plaquetas durante a formação de trombos, leucócitos rolando em resposta a infecção e a inflamação e a formação de osteoclastos em podócitos reabsorção óssea. O papel de Kindlin-3 nestes processos resultou em extensos estudos celulares e fisiológicas. No entanto, existe uma necessidade para um método eficiente de aquisição de quantidades de miligrama de alta qualidade da proteína para estudos posteriores. Nós desenvolvemos um protocolo, aqui descrita, para a expressão eficiente e purificação da recombinante murino kindlin-3 pela utilização de um baculovirus-dsistema de expressão dividida em células Sf9 produzindo quantidades suficientes de proteína de alta pureza de corpo inteiro para permitir a sua caracterização biofísica. A mesma abordagem pode ser feita no estudo das outras isoformas kindlin mamíferos.

Introdução

As proteínas da família kindlin são um componente essencial do conjunto de adesão focal, e, por conseguinte, essencial para a vida complexo. Kindlins, dos quais existem três isoformas em mamíferos (kindlin-1, kindlin-2, e kindlin-3), são considerados coativadores extracelulares dos receptores integrinas juntamente talina ^1. A adesão das células mediada pela integrina liga a superfície da célula com a matriz extracelular (ECM) em eucariotas superiores. É um processo crítico e comum num grande número de fenómenos fisiológicos, incluindo a integridade do tecido, a embriogénese, o metabolismo do osso, a hemostasia e a imunidade. A adesão das células mediada pela integrina é activado através de dentro para fora a transdução do sinal através da ligação do talina e kindlin para as integrinas β-subunidade caudas citoplasmáticas (TCs) os seus motivos NPxY conservadas. A importância biomédica de proteínas kindlin estende no entanto, tanto quanto o núcleo, onde kindlin-2 tem sido demonstrado em vários relatórios recentes para ser envolvida na transcriçãoai controlar ^2,3.

Kindlins são proteínas vários domínios de aproximadamente 75 kDa, caracteriza-se por a posse de uma FERM bipartido C-terminal (4,1 banda, Ezrin, radixina, moesin) de domínio, que é interrompida por uma homologia plecstrina (PH) de domínio no centro do seu subdomínio F2 ^4,5. Estudos dos domínios kindlin-2 e kindlin-3 PH mostraram que ele se liga ao segundo mensageiros lipídicos fosfatidilinositol-(3,4,5)-trifosfato e fosfatidilinositol-(4,5)-bifosfato ^6-8. No entanto, os estudos do domínio PH kindlin-1 mostram que se liga a PtdIns (3,4,5) P _3, com uma afinidade muito mais baixa, o que pode ser explicado em kindlin-1 por uma ponte de sal específico da isoforma impedindo lípidos de ligação ^9. Além disso, há um circuito de aminoácidos ~ 100 inserido no domínio F1 das kindlins que está previsto para ser desdobrada, mas se liga a fosfatidilserina no folheto interno da membrana plasmática ^10,11. O FERM kindlindomínio é considerado homólogo ao domínio talina FERM, embora o domínio talina FERM não possui um domínio de homologia plecstrina. Ambos kindlins talina e interagir com motivos NPxY nas β-caudas integrina através da região F3 do seu domínio FERM, mas kindlin se liga ao motivo da membrana distal, enquanto que tem como alvo a talina proximal membrana um ^12-16. Kindlins e talina, tanto em adição possuem um domínio N-terminal F0 com uma dobra da ubiquitina-like que não se encontra em outras proteínas FERM ^11,17. Estudos sobre o domínio de F0 kindlin-2 têm demonstrado que se liga de forma independente para o fosfatidilinositol-(4,5)-bifosfato membranas enriquecidas ^17.

Os kindlins apresentam padrões de expressão tecido-específica parálogo e funções fisiológicas não redundantes. Kindlin-1 é expresso principalmente na epiderme, mas também, em menor grau do cólon, do estômago e dos rins; kindlin-2 é expressa ubiquamente, mas concentra-se no estriado e lisomusculares e é a única kindlin expressa no desenvolvimento embrionário ⁴ e kindlin-3 é expressa em tecidos hematopoiéticos, com a maior concentração de kindlin-3 encontrados em megacariócitos ^18. No entanto, estudos mais recentes sugerem que a proteína funcional é expresso nos tecidos endoteliais, bem ^19.

Kindlin-3 é de interesse médico agudo, devido ao seu papel fisiológico importante no sangue. É essencial para a agregação de plaquetas e formação de trombos durante o espalhamento ^20, leucócitos de rolamento, em resposta à infecção e inflamação ^21,22 e a formação de osteoclastos em podócitos reabsorção óssea ^23. Além disso, a depleção de kindlin-3 em seres humanos conduz à deficiência de adesão dos leucócitos do tipo III - uma doença caracterizada por desordens de sangramento com risco de vida e infecções bacterianas recorrentes ^20,24,25. Kindlin-3 estudos knock-out em camundongos revelaram a função crucial da proteína emadesão celular KIND3 ^{-. / -} ratos exibir fenótipos distintos, tais como hemorragia grave devido a integrinas inativos plaquetas, osteopetrose grave, e prejudicada a adesão de leucócitos ^20,22, lembrando os sintomas em humanos falta kindlin-3.

Dados estruturais de alta resolução nas kindlins, até à data, tem sido restrito a subdomínios individuais, tais como a homologia plecstrina (PH) domínio de kindlin-1 ⁹ e kindlin-2 ^26,27 eo domínio de F0 kindlin-1 ¹¹ e kindlin -2 ^17. A maioria dos subdomínios de cada polipeptídeo kindlin têm, porém, resistiu a clonagem e análise estrutural (Yates e Gilbert, observações não publicadas), e os estudos das proteínas completos foram impedidos pela dificuldade de expressar e purificar quantidades suficientes usando E. coli (observações não publicadas e Harburger et al. ^14). Há um interesse considerável em medicina kindlin-3 e sua function, juntamente com os outros dois membros da família, e, recentemente, geramos miligramas dele por expressão recombinante em células de Spodoptera frugiperda impulsionado por infecção baculovírus ^12. Por isso, aqui descrevem métodos para a produção de quantidades de miligrama de rato recombinante kindlin-3 em cultura de células de insecto, adequados para estudos estruturais extensas e análise bioquímica.

Neste protocolo, fazer uso de um bacmídeo nocaute engenharia (BAC10 _{KO: 1629)} que é, por si só, incapaz de produzir partículas virais viáveis ^​​28. O DNA viral é assim resgatado por recombinação com um vector de transferência que neste caso inclui também o gene kindlin-3 (FERMT3) e resulta no gene FERMT3 substituindo o vírus gene muito tardio, o que é altamente expressa, mas redundante, o que resulta em um recombinante vírus que expressa rato kindlin-3, como parte do ciclo de vida do vírus ^28. Identificamos estamétodo para a produção de kindlin-3 após tentativas de expressar e purificar-lo em outros hosts de expressão provou proibitivamente difícil (observações não publicadas), mas também devido à versatilidade da suíte vetor Popin, que foi utilizado para clonagem e que podem implantado em muitos expressão hospeda ^29.

Protocolo

Este protocolo assume que o rato kindlin-3 do gene (FERMT3) tem sido clonado com êxito para um vector a jusante do promotor p10 muito tarde e que possui o vector que flanqueiam as sequências de baculovirus para permitir a recombinação com o bacmid BAC10 _{KO: 1629} desenvolvido por IM e Jones colegas ^28. Para este protocolo, o gene kindlin-3 foi clonado em pOPINE ²⁹ e os iniciadores e a estratégia de clonagem utilizados podem ser encontradas descritas em outros lugares ^12. O plasmídeo foi concebido de modo a que o gene FERMT3 (kindlin-3) está sob o controle do promotor p10 de baculovírus e o vector contém 5 'UTR/ORF603 e ORF de 1629 e codifica uma sua _6-tag no terminal C para a purificação a jusante ^29.

1. Cultura de Células de insetos e Manutenção

1. Antes da amplificação de baculovírus recombinante, as células de Spodoptera frugiperda adaptados para cultura em suspensão (células Sf 9) deveser cultivado e mantido. Células de insetos devem sempre ser tratadas com técnicas de assepsia em uma cultura de tecidos de fumos capô dedicado.
2. As culturas em suspensão de células de insectos são incubadas em Sf-900 II (SFM) meio líquido isento de soro suplementado com penicilina 100 ug / ml e 100 ug / ml de estreptomicina, em frascos de 27 ° C com agitação a 100 rpm.
3. Manter o celular inseto faixa de densidade cultural entre 1 X 10 ⁶ - 1 x 10 ⁷ células / ml por dividir e diluir a cultura de células com frescos Sf-900 II mídia.
   Nota: saudável As células devem parecer uniforme em tamanho e deve ser de forma esférica.
4. Contar as células num volume de amostra, utilizando um hemocitómetro e microscopia de luz para calcular a densidade das células de cultura.

2. Geração de Baculovirus Recombinante

1. Cultura e manter as células em suspensão utilizando Sf9 Sf-900 II, meio suplementado com 100 ug / ml penicillin e 100 ug / ml de estreptomicina. Para a geração de baculovírus, células de insectos devem ser cultivadas a uma gama de densidades de 5 x ^05-01 outubro x 10 ⁶ células / ml.
2. Semente de aproximadamente 1 x 10 ⁶ células Sf9 por poço de uma placa de cultura estéril de tecidos de 6 cavidades em 2 ml de Sf-900 II meios suplementados com penicilina 100 ug / ml e 100 ug / ml de estreptomicina. Deixar as células Sf9 à RT, na hotte de aderir à base dos poços de plástico e, assim, formar uma monocamada.
3. Realizar geração de baculovirus recombinante por cotransfecção de ADN de bacmid e de DNA plasmídeo em cultura em monocamada.
   1. Para cada transfecção, misturar 1-2 ug de purificado pOPINE-mFERMT3, que possui os elementos de baculovírus ORF1629, com 0,5 ug de purificado BAC10 _{KO: 1629} em 100 ml de Sf-900 SFM II sem antibióticos (solução A).
   2. Num tubo separado, dilui-se 6 mL de reagente de Cellfectin II com 100 ml de Sf-900 SFM II sem antiantibióticos para cada reacção de transfecção (Solução B). A 'mix master' pode ser criado aqui, para manipulação de líquidos reduzida, se forem necessárias muitas transfections.
   3. Misturar as duas soluções (A e B, a cerca de 200 uL) e incubar a temperatura ambiente durante 20 minutos para formar um complexo de ADN-lípido.
   4. Dilui-se os complexos de ADN-lipido com 800 ul de Sf-900 SFM II sem antibióticos. Aspirar cuidadosamente a mídia monocamada de células Sf9 e pipetar cuidadosamente a solução A / B e da mídia em cima da monocamada Sf9.
   5. Incubar as células transfectadas em um incubador humidificado a 27 ° CO / N e adicionar mais 1 ml de Sf-900 SFM II sem antibióticos para cada cultura em monocamada ao dia seguinte. Incube as células a 27 ° C durante mais 5 dias.
4. Recolher os baculovírus recombinante directamente a partir do meio de cultura (cerca de 2 ml no total) e transferir para um tubo de centrífuga limpo (por exemplo um tubo Falcon de 15 ml).
   1. Esclareça qualquer debr célula Sf9é por centrifugação a 1000 xg durante 5 min à temperatura ambiente. Transferir o vírus, que está no sobrenadante resultante e denotado P1, para um tubo limpo e armazenar a 4 ° C no escuro até serem utilizadas. Nesta fase, a monocamada Sf9 restante pode ser utilizado para avaliar a produção de vírus recombinante através da avaliação da presença de recombinante kindlin-3 nas células de insectos.
5. Ressuspender a monocamada com 0,5 mL de PBS e diluir uma amostra de 10 ul, com iguais volumes de tampão de carga de SDS-PAGE 2x. Aquecer as amostras a> 95 ° C durante pelo menos 10 min.
   1. Sonicar a amostra durante 1 s a amplitude de 10%, utilizando uma ponta de micro-sonicador se for demasiado viscoso para o carregamento de gel adequada.

3. A amplificação de Baculovirus Recombinante

1. Para a amplificação de vírus em suspensão, utilizar uma densidade de células de 1,4 x 10 ⁶ células / ml, o que deve ocupar de 1/20 do volume total do frasco (ou seja, 50 ml de cultura emNum balão de 2 L).
2. Alcançar a amplificação do vírus recombinante por infectar a cultura de células de insecto com o estoque viral P1 a uma multiplicidade de infecção (MOI) de 0,1 usando a seguinte fórmula;
   
   Nota: A geração de vírus P1 pode ser assumida como tendo um título viral esperado de 1 x 10 ⁷ pfu / ml. No entanto, um ensaio de placa pode ser executada antes desta fase.
3. Incubar a cultura de insectos P1-infectadas a 27 ° C com agitação a 100 rpm durante 3 dias (72 h).
4. Recolher o vírus através da separação das células a partir dos meios de comunicação social através de centrifugação a 1000 xg durante 5 min à temperatura ambiente. Guardar o sedimento celular resultante nesta fase para a confirmação da produção de vírus recombinante através da avaliação kindlin-3 a expressão da proteína por SDS-PAGE e Western blotting.
5. Transfira os meios enriquecidos com vírus esclarecidas para um tubo limpo e armazenar a 4 ° C emno escuro até serem utilizadas. Este estoque viral é denotado como P2.
   Nota: A título viral de 2 x 10 ⁸ pfu / ml (ou de uma taxa de amplificação de 100 ufp / célula), pode ser antecipado.

4. Expressão de kindlin-3 em infectadas com baculovírus Sf9

1. Crescer num volume adequado de Sf9 culturas de células em suspensão de Sf-900 SFM II suplementado com 100 ug / ml de penicilina e 100 ug / ml de estreptomicina, antes da expressão recombinante de larga escala kindlin-3 para a purificação. Incubar as culturas em suspensão a 27 ° C com agitação a 100 rpm e com um volume total da cultura: Garrafa proporção em volume de 1:5.
2. Infectar culturas em suspensão de Sf9, a uma densidade de 2 x 10 ⁶ células / ml.
3. Suplemento culturas de Sf9 com uma concentração final de 1% (v / v) de soro fetal bovino (FBS), seguida com vírus recombinante amplificado (estoque P2-viral) para se obter um MOI de 1. Incubar as culturas infectadas a 27 ° C com agitação a 100 rpm.
4. Colheita recombinaçãont _{kindlin-3-6-CHIS} expressando células Sf9 72 horas após a infecção por centrifugação a 1000 xg   e o sedimento celular resultante armazenado a -20 ° C até à sua utilização, ou -80 ° C para armazenamento a longo prazo.

5. A purificação da proteína recombinante Kindlin-3

1. Thaw congelado células de inseto infectadas com o baculovírus (Sf9) pelotas expressando recombinante kindlin-3 no gelo.
2. Ressuspender o sedimento de células descongelado com tampão de lise (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, NaCl 500 mM, 1% (v / v) de Tween-20), suplementado com um cocktail inibidor da protease livre de EDTA e de 1.000-2.000 U DNase1.
   Nota: Em alternativa, uma solução salina tamponada de fosfato modificado (PBS) também pode ser utilizado, em que a concentração de NaCl é ajustada a 500 mM para evitar interacções não específicas entre proteínas endógenas de células Sf9 e a coluna de afinidade com metal imobilizado utilizado para a purificação a jusante (ver abaixo).
3. Lisar as células por incubação das células ressuspensas com o detergente e vortexing. Sonicar (40% de amplitude, 10 ciclos de 10 segundos de pulsos seguido de 10 segundos de arrefecimento), a amostra para posterior ruptura celular em um banho de gelo ou, em alternativa utilizar um homogeneizador de Dounce.
4. Clarificar o lisado por centrifugação a 48.000 xg durante 1 hora a 4 ° C. Carrega-se o sobrenadante resultante para uma coluna HisTrap (5 ml de volume de coluna), pré-equilibrada com tampão de lise, a 4 ° C a uma taxa de 1 ml / min.
   Nota: Em alternativa, o lisado clarificado pode ser incubada com um 1-5 ml de volume de leito de pérolas de Sepharose níquel pré-equilibradas (por exemplo, Ni Sepharose 6 fluxo rápido) a 4 ° C durante 1-2 horas. Uma coluna de Ni-Sepharose pode ser formada após o passo de ligação, utilizando uma coluna de fluxo por gravidade.
5. Lavar a coluna com 10 volumes de coluna de tampão de lavagem (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, NaCl 500 mM, imidazol 10 mM) para remover as proteínas não ligadas.
6. Usar um gradiente linear de imidazol 10-500 mM a uma velocidade de 10 mm / ml (ou, em 10 volumes de coluna) utilizando uma Äkta FPLC para eluiro limite recombinante kindlin-3-CHIS _6.
7. Fraccionar a eluição em 0,5-1 ml de fracções usando o Äkta FPLC, com as fracções contendo kindlin-3-CHIS ₆ geralmente eluindo a uma concentração de 300 mM de imidazole.
8. Avaliar a composição de proteína do eluente por SDS-PAGE e por purificações primeira vez confirmar por western blotting utilizando um anticorpo anti-His ₆ de anticorpo ou anticorpo anti-ratinho kindlin-3.
9. Reunir as fracções contendo kindlin-3 e troca de tampão para 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, NaCl 200 mM por meio de uma série de diluições em tampão de amostra e as concentrações de proteína utilizando um concentrador centrífugo com um peso molecular de 50 kDa de corte (MWCO) a 4 ° C.
   Nota: Em alternativa, dialisar a solução de proteína utilizando Slide-A-Lyzer cassete de diálise com um MWCO de 30 kDa, a 4 ° C durante 4 horas a O / N em 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, NaCl 200 mM.
   Nota: por permuta iónica (ver abaixo) de uma menor concentração de NaCl, isto é, 50 mM, pode ser e tem sido utilizado para este passo.
10. Aplicar a solução de proteína-tampão trocado numa coluna HiTrap heparina HP previamente equilibrada (5 ml de volume de coluna) utilizando uma Äkta de FPLC com um caudal de 0,5 ml / min.
    Nota: O limite kindlin-3 é eluída usando um gradiente linear de NaCl (NaCl 0,2 M a NaCl 1 M) no mesmo tampão, a aumentar a uma taxa de 10 mM / ml. Kindlin-3-CHIS6 é esperado para eluir a ~ 0,6 M de NaCl.
11. Fraccionar a eluição em 0,5-1 ml de fracções e avaliar a composição de proteína por SDS-PAGE e Western blotting, se for caso disso.
    Nota: pode-se esperar que um grau de pureza de proteína de cerca de 95%, como avaliado por SDS-PAGE.
12. Piscina fracções contendo kindlin-3 e concentra-se utilizando um concentrador de centrífuga com uma proteína de 50 kDa MWCO para um volume final de 0,5-2 ml.
13. Num passo final, polir a proteína concentrada e troca de tampão a proteína utilizando a cromatografia de exclusão de tamanho (SEC).
    1. Aplique a proteína purificada em uma Superdex S200 (16/60) ou (10/30) pré-equilibrada em 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, NaCl 200 mM, DTT 1 mM, com um caudal de 1 ml / min ou 0,5 ml / min, dependendo do tamanho da coluna utilizado.
       Nota: cromatografia de exclusão de tamanho, também pode ser realizada em solução salina tamponada com fosfato (PBS), se necessário.
    2. Purifica-se as proteínas de acordo com o tamanho através da aplicação de tampão para a coluna a uma taxa de 1 ml / min ou 0,5 ml / min, dependendo do tamanho da coluna.
       Nota: A proteína que elui da coluna é fraccionado e controlada por meio da absorvência a 280 nm.
    3. Um único pico de absorvância deve ser esperado a partir de SEC, que é fraccionado e avaliada por SDS-PAGE para determinar a homogeneidade, e é tipicamente> 95% de pureza após este passo.
14. Concentra-se a purificou kindlin-3-CHIS ₆ usando um concentrador de centrífuga com uma proteína de 50 kDa MWCO de ~ 15 mg / ml, tal como avaliado espectrofotometricamente usando um coeficiente de extinção calculado (ε) de 109,320 ^{M-1cm-1 <}/ Sup> (assumindo que todos os resíduos de cisteína são reduzidas).
15. Para o armazenamento a -20 ° C e armazenagem a longo prazo a -80 ° C, a alíquota de proteína nos tubos de flash e congelar as amostras em azoto líquido de PCR. Alternativamente, a proteína pode ser utilizada directamente para a investigação utilizando um número de técnicas bioquímicas e biofísicas.

Resultados

A expressão em larga escala de rato recombinante kindlin-3 utilizando células Sf 9 infectadas com baculovírus pode levar menos de duas semanas, para atingir quantidades de miligramas, tal como ilustrado na Figura 1A esquemática e requer apenas uma pequena quantidade de DNA de plasmídeo a partir de um kit QIAprep Miniprep, para exemplo. A geração de baculovirus recombinante é conseguida por cotransfecção de células Sf9 com o rato kindlin-3 (FERMT3) contendo, juntamente com um plasmídeo linearizado baemídeo preparado (BAC10: KO ₁₆₂₉₎ e recolhendo as partículas virais recém-formados, após 5-7 dias, tal como mostrado na figura 1A. Este método de geração de resultados de baculovírus em 100% de vírus recombinantes e, essencialmente, dispensa a necessidade de purificação de placa ^28,30. Uma em pequena escala (2 ml monocamada) cultura representativa irá gerar uma solução que contém o vírus recombinante com um título viral esperado de unidades formadoras de 1 x 10 ⁷ de placa (pfu) por ml decultura. Pode-se realizar um ensaio de placas para determinar o título virai efectiva, mas esta é, talvez, demasiado trabalhoso quando um grande número de construções são testados para estudos estruturais. O êxito do passo de geração de vírus pode ser avaliada através da utilização de um plasmídeo contendo eGFP em paralelo, ou, para este kindlin-3 construto, a monocamada Sf9 pode ser ressuspenso em PBS e avaliou-se por SDS-PAGE e Western blotting, o que demonstra tipicamente uma banda clara correspondente a uma proteína de 75 kDa marcada com His, como mostrado na Figura 1B. O vírus é posteriormente amplificado para gerar quantidades suficientes para grande escala (volumes litros) infecção de células de inseto e isolamento de proteínas recombinantes. A segunda passagem do vírus (P2) é gerado por infectar culturas de suspensão com um MOI estimado de 0,1 (ver protocolo). É vital que a amplificação Sf9 cultura suspensão ocupa apenas um vigésimo do volume total de frasco. Esta aeração adicional garante que o vir resultandonós contendo mídia, colhida após 3 dias (72 horas) pós-infecção, irá gerar quantidades suficientes de kindlin-3 no subseqüente expressão da cultura. O estoque de vírus amplificado (P2) é assumido como possuir um título viral esperado de 2 x 10 ⁸ pfu / ml com base numa estimativa conservadora de 100 ufp / célula usando uma densidade de células de 2 x 10 ⁶ células / ml, durante a amplificação ^31. Geralmente, para a amplificação de baculovirus óptima e produção de proteína, as células Sf 9 deve ser uniforme em tamanho e esférico, como mostrado na Figura 1C. Além disso, a amplificação e expressão de proteínas virais é máxima a 72 h após a infecção, e ambos são significativamente reduzida às 96 h pós-infecção.

Uma vez que o vírus foi amplificado e usado para infectar as células Sf9 em experiências em grande escala recombinante kindlin-3 é parcialmente purificado por virtude da sua engenharia C-terminal Sua _6-tag utilizando cromato de afinidade com metal imobilizadotografia, como mostrado na Figura 2. É importante levar a cabo a purificação, a 4 ° C e que os inibidores da protease suficientes foram adicionados para evitar a proteólise. O kindlin-3 parcialmente purificada é ainda purificada a quase homogeneidade por cromatografia de permuta iónica (IEC), utilizando uma coluna de heparina, como se mostra na Figura 3. Aplicou-se o uso de uma coluna de heparina, em vez de uma coluna de troca iónica convencional, como se previu que o grande número de resíduos básicos, incluindo um trecho de poli-lisina no domínio F1 kindlin-3, que interagem fortemente com os grupos sulfato negativamente carregados da coluna. Esta estratégia é particularmente útil para as proteínas de ligação a ARN-ADN e com manchas de base de ligação de ácidos nucleicos, por exemplo o terminal de ligação de ARN-Uridililtransferase Cid1 ^32. Finalmente kindlin-3 pureza é "polida" por cromatografia de exclusão de tamanho para remover agregados e conseguir homogeneidade, como mostrado naFigura 4. Os buffers especificados nos protocolos são buffers padrão freqüentemente utilizados em purificação de proteínas para análise estrutural. Geralmente, tampões à base de fosfato são evitados para a purificação de proteínas para estudos estruturais, especialmente a cristalização de triagem devido à formação de cristais de fosfato nas gotas de cristalização (em particular para as experiências, a 4 ° C). No entanto, foi realizado um teste de desvio térmico baseado em Thermofluor para determinar quais os tampões foram estabilizador para kindlin-3, como mostrado na Figura 5. Resumidamente, uma solução de proteína purificada é diluída em tampões que cobrem uma gama de concentrações de cloreto de sódio de pH e, por conseguinte, a formação de uma tela de duas dimensões. A fusão da proteína é medida por observação da fluorescência do corante laranja Sypro (sondas moleculares), que se liga aos resíduos hidrófobos no interior do núcleo da proteína dobrada, ao longo da gama de temperaturas 20-95 ° C (293-368 K). O ponto médio da temperatura em que the proteína se desdobra (temperatura de transição, T _m) foi calculada utilizando o software Opticon monitor e é descrito em outro lugar ^33. Kindlin-3 foi observado para ser estável a concentrações elevadas de cloreto de sódio (500 mM) no intervalo de pH 7,0-9,0, com uma temperatura de transição consistente (T _m) de 55 ° C. Observou-se também que a T _m de Kindlin-3 foi cerca de 55 ° C dentro do intervalo de pH de 7,0-7,5, independentemente da concentração de cloreto de sódio.

Observou-se que havia a proteólise limitada de kindlin-3 durante a purificação, mas a análise de SDS-PAGE da proteína altamente concentrada (~ 15 mg / ml) demonstrou contaminação limitada com dois polipéptidos adicionais de igual intensidade. Estranhamente, no entanto não há nenhuma indicação de espécies adicionais de cromatografia de exclusão de tamanho, tal como mostrado na Figura 4. É, assim, pensou que a proteína é cortado por proteases, mas permanece dobrada e hydrodynamically indistinguível de proteína de corpo inteiro. Curiosamente, calpaína é uma protease que cliva conhecido kindlin-3 em Tyrosine373, o qual está no ciclo β1-β2 da homologia plecstrina (PH) do domínio ³⁴ e pode explicar as observações. Além disso, a transferência de western revelou que um dos dupletos polipeptídicas possui um His-Tag de terminal-C e o peso molecular aparente da dupleto, quando somadas, é igual a 75 kDa, o mesmo peso molecular que a proteína nativa. O rendimento do purificada recombinante kindlin-3 por litro de células Sf9 (~ 2 g de peso de células) é, na melhor das hipóteses, 5 mg.

Figura 1. Visão geral Visão geral da expressão da proteína heteróloga células de inseto infectadas com baculovírus. (A) A esquematizado de generatio baculovírusn e expressão de kindlin-3 em células Sf9. Nos esquemas de vetores de DNA, 5'UTR / ORF603 é colorida em vermelho, a ORF1629 é colorido em verde e, o gene da proteína de interesse (POI) é de cor azul. (B) Western blot, utilizando um anticorpo anti-His anticorpo _6, de seis em pequena escala (2 ml) culturas de monocamada (pistas marcadas de acordo com a cultura) de células Sf9 produzindo baculovírus recombinante e recombinante murino kindlin-3. (C) Imagem de microscopia de luz de células Sf9 saudáveis ​​cultivadas em suspensão de Sf-900 SFM II suplementado com antibióticos e transferida para uma cultura de 35 mm de tecido bem prato (ver protocolo). Imagem ampliação 20X.

Figura 2. Represepurificação ntative de kindlin-3 por cromatografia de afinidade com metal imobilizado (IMAC). SDS-PAGE de afinidade de níquel purificada recombinante murino kindlin-3 expressa em baculovírus infectadas células Sf9 (~ 2 g de peso de células). Proteína adsorvida foi eluida utilizando um gradiente de imidazol (mostrado acima o gel). Lanes são rotulados como segue; MW, marcador de peso molecular; Lys, lisado de células inteiras; FT, fluir através de (não ligada); WI, lave 1; WII, lave 2. Análise de Western blot (abaixo) também foi realizada utilizando as frações de eluição para confirmar a presença da His-tag engenharia da proteína recombinante. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3. Reprepurificação representativa de kindlin-3 por cromatografia de afinidade de heparina. (A) perfil de eluição observada a 280 nm (azul) mostrando um único pico simétrico eluição sob um gradiente de cloreto de sódio linear (verde), utilizando a faixa de concentração de NaCl de 0,05-1,0 M. ( B) Análise de SDS-PAGE da eluição fracionado demonstrando a presença da proteína kDa 75, kindlin-3 (K3 rotulado). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4. Representativas de cromatografia de filtração em gel e (A) perfil de filtração em gel concentrado kindlin-3. Eluição de purificado kindlin-3 usandoum S200 Superdex (16/60) em Tris-HCl, pH 7,5, NaCl 150 mM e DTT a 1 mM a 20 ° C. Com base no volume de eluição, kindlin-3 migra como esperado para uma proteína de 75 kDa, sugerindo que é predominantemente monomérico. (B) SDS-PAGE de altamente concentrado recombinante purificada kindlin-3 em 14,5 mg / ml. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Baseado no Thermofluor Figura 5. Teste de desvio térmico para tampão de rastreio. Kindlin-3 foi diluído em vários tampões que compreendem um ecrã bidimensional de pH em função da concentração de cloreto de sódio. As temperaturas de transição de temperatura (pontos médios) foram observados por fluorescência de ocorante hidrofóbico obrigado, Sypro laranja (sondas moleculares) e calculados usando o software Opticon Monitor. (A) Um histograma 3D das temperaturas de transição é representada em conjunto com (B) a modificação na temperatura de transição a partir da média calculada de 50,4 ° C. Para maior clareza as barras são coloridas de acordo com o intervalo de temperaturas a que eles correspondem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Os sistemas de expressão de baculovirus estão a tornar-se cada vez mais popular e uma ferramenta importante para a produção de quantidades de miligrama de proteína recombinante para a caracterização da proteína por meio de estudos biofísicos, incluindo a cristalografia de raios-X. Apesar de ser mais exigente experimentalmente os sistemas de expressão de baculovírus oferecem várias vantagens sobre E. coli uma das quais é um ambiente quase-nativos para as proteínas de origem eucariótica, por exemplo a presença de acompanhantes e oportunidade para modificação pós-tradução apropriados. Em nossos próprios esforços para expressar kindlin-3, expressão hospedeiros alternativos foram utilizados, incluindo linhas de células de mamíferos e as tensões de expressão bacteriana (observações não publicadas). Geralmente, o número de E. coli estirpes testadas produziram quantidades muito pequenas de recombinante kindlin-3 (~ 0,5 mg / L de cultura, observações não publicadas). No entanto, a expressão controlado por baculovírus em células de insectos foi particularmente eficaz e, em comparison a expressão transitória em células de mamíferos, mais favorável para a geração de grande biomassa necessária para o isolamento de um miligrama de proteína citoplasmática recombinantes (observações não publicadas). Especulamos que a presença chaperonas eucarióticas pode permitir a produção eficiente de kindlin-3.

Os Baculoviridae infectar células de insectos e para a expressão da proteína recombinante de baculovírus usado neste trabalho baseia-se na Autographa californica vírus da poliedrose nuclear (AcNPV). Na natureza o AcNPV, que infecta o Autographa californica (alfafa lopper) larvas de insetos, requer a proteína poliedrina para formar oclusões em que os virons são encapsulados em uma matriz de proteína cristalina proporcionando a proteção necessária para a sua libertação. Em células em cultura não é necessária a formação de corpos de oclusão para a replicação e é, portanto, dispensável. No caso de expressar proteínas estranhas no gene da proteína poliedrina pode ser replaced em um AcNPV recombinante com o gene para a proteína de interesse. AcNPV pode infectar outras espécies de lepidópteros e para os efeitos de minhoca proteína recombinante expressão exército Spodoptera frugiperda são usadas células de ovário de pupa. Na abordagem aqui descrita, o bacmid AcNPV (BAC10) foi concebido de modo a que um gene virai essencial, ORF1629, é inactivado pela inserção de cloranfenicol acetil-transferase que resulta em um bacmid knock-out (BAC10: KO _1629), de tal modo que é incapaz de formar baculovirions infecciosas ^28. A cotransfecção de células Sf9 com BAC10 linearizado: KO ₁₆₂₉ e os FERMT3 contendo repara vector de transferência a ORF1629 inactiva, por meio de transposição, resultando em um genoma viável que também tem incorporado o gene FERMT3 sob o controlo do promotor da poliedrina ^28.

Descreve-se um protocolo de purificação para o isolamento de elevada pureza rato recombinante kindlin-3 através de um tridimee passo abordagem cromatográfica. Os métodos usados ​​aqui podem ser facilmente aplicados a outras proteínas His-tag. Nós empregamos um passo de troca iónica para purificar kindlin-3, mas acreditamos que este é mais um passo pseudo-afinidade como kindlin-3 possui um grande número de resíduos básicos, incluindo um trecho de poli-lisina dentro de seu domínio F1. Além disso, é considerado kindlin-3 ao ligar-se e interagir com a face citoplasmática da membrana de plasma, onde funciona, e por conseguinte, podemos prever que o agrupamento de resíduos básicos vai permitir que a proteína de contrariar a membrana carregada negativamente.

Os buffers descritos nos protocolos de purificação são considerados padrão e são freqüentemente usados ​​em biologia estrutural. O ensaio thermofluor (Figura 5) demonstra que kindlin-3 é estável na maior parte das condições de tampão com pH acima de 6,0. Isto foi particularmente útil e importante para informar nossas experiências quando se estuda kinldin-3: β1A interacção da cauda por RMN, que produziu excelente espectros a pH 6,1 com baixas concentrações de NaCl a ^12.

Antes de qualquer estudo biofísico pode ser realizado, é importante demonstrar que a proteína purificada de interesse é de facto correctamente dobrada e é funcionalmente activo. Numa publicação anterior, foi demonstrado que a recombinante kindlin-3 expressa e purificada usando este método foi um monómero e monodisperso em solução, tal como avaliado por cromatografia de exclusão de tamanho, dispersão dinâmica de luz, ultracentrifugação analítica e pequeno ângulo de dispersão de raios-X, e foi também capazes de se ligar e reconhecendo a NPxY-membrana distal ea montante conjunto serina / treonina de β _1A caudas citoplasmáticas ^14, confirmando assim que ele se comporta como a proteína nativa, o que está em linha com estudos celulares e fisiológicos anteriores ^14,20,22. O uso de um ensaio de estabilidade térmica é uma forma adicional de sugerindo the a dobragem correcta da proteína de interesse, como a proteína incorrectamente dobrada irá resultar em um fundo elevado de fluorescência devido à presença de resíduos hidrofóbicos expostos.

A família kindlin de proteínas tem sido o foco de muita atenção, uma vez que o seu papel inesperado coativadores essenciais de integrinas in vivo foi descoberto. Isso provocou muito esforço para expressá-las de modo recombinante e resolver suas estruturas. Até à data, sucesso limitado tem sido relatada em expressando quantidades de miligramas de proteína recombinante de comprimento total, mas que têm aqui descrito o uso de um sistema de baculovírus, que permite a expressão em larga escala em níveis em que estudos estruturais tornam-se possíveis. Ao gerar grandes quantidades de recombinante kindlin-3 prevemos que isso vai ajudar mais estudos desta proteína. O método de purificação e o fluxo de trabalho controlado por baculovírus descrito aqui para murino recombinante kindlin-3 também pode ser utilizado para expressar e purificar as outras isoformas kindlin, Que também são difíceis de expressar e também possuem extensões poli-lisina, e podem ser ainda adaptado para outras proteínas citoplasmáticas, tais como proteínas de ligação de ácido nucleico, que não conseguem expressar em estirpes bacterianas.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Sf-900 II meio livre de soro (SFM) 1x líquido	Life Technologies	10902-096	armazenar em 4 ° C e aqueça para RT antes de usar
Reagente Cellfectin II	Invitrogen	10362-100	Alternativamente, o reagente de transfecção GeneJuice (EMD) pode ser usado
Sulfato de estreptomicina (sólido)	Melford	S0148	Filtro de esterilização (0,22 μ m) antes de usar
Penicilina G, sal de potássio (sólido)	Melford	P0580	Filtro de esterilização (0,22 μ m) antes de usar
CELLSTAR Placa de Cultura Estéril de 6 poços	Greiner Bio-One	657160
Fetal Bovine Serum (FBS)	Life Technologies	10100-147
Inibidor de Protease Cocktail		Sigma P8849	Cuidado: Os inibidores de protease são dissolvidos em DMSO
Pancrease desoxirribonuclease bovina (Dnase) I	Sigma	D5025
HisTrap FF (5 ml)	GE Heathcare	17-5286-01	Requer um Ä Máquina FPLC kta
HiTrap Heparina (5 ml)	GE Heathcare	17-0407-01	Requer um Ä Máquina FPLC kta
Unidades de filtro centrífugo Amicon Ultra-15 (com membrana Ultracel-50)	Millipore	UFC905024	capacidade de 15 ml e um MWCO de concentrador de proteína de 50 kDa