Citotóxicos Eficácia da Terapia Fotodinâmica no osteossarcoma Células<em&gt; In Vitro</em

Resumo

O protocolo relatado aqui permite a avaliação da eficácia da terapia fotodinâmica (PDT) em linhas de células e a optimização das condições de PDT, antes de aplicar a terapia em modelos animais.

Resumo

Nos últimos anos, tem sido a dificuldade em encontrar terapias mais eficazes contra o câncer com menos efeitos colaterais sistêmicos. Portanto Terapia Fotodinâmica é uma nova abordagem para um tratamento selectivo mais tumor.

Terapia Fotodinâmica (PDT) que faz uso de um fotossensibilizador não tóxico (PS), que, após a activação com luz de um comprimento de onda específico, na presença de oxigénio, gera radicais livres de oxigénio, que provocam uma resposta citotóxica ^1. Apesar de sua aprovação há quase vinte anos pelo FDA, PDT hoje é apenas usado para tratar um número limitado de tipos de câncer (de pele, bexiga) e doenças nononcological (psoríase, queratose actínica) ^2.

A principal vantagem da utilização da TFD é a capacidade de executar um tratamento local, o que evita os efeitos secundários sistémicos. Além disso, permite o tratamento de tumores em locais delicados (por exemplo, em torno de nervos ou vasos sanguíneos). Aqui, um intraoperataplicação ive do PDT é considerada no osteossarcoma (OS), um tumor do osso, para atingir satélites tumor primário deixado para trás em torno do tecido tumoral após a ressecção cirúrgica do tumor. O tratamento tem como objetivo diminuir o número de recidivas e na redução do risco de (pós-operatório) metástase.

No presente estudo, apresentamos in vitro procedimentos PDT para estabelecer as configurações PDT ideais para o tratamento eficaz de linhas de células do sistema operacional amplamente utilizados que são usados ​​para reproduzir a doença humana em modelos do rato OS intratibial bem estabelecidos. A captação do PS mTHPC foi examinada com um espectrofotómetro e fototoxicidade foi provocado com a luz laser de excitação de mTHPC em 652 nm para induzir a morte celular avaliada com um ensaio de WST-1 e pela contagem de células sobreviventes. As técnicas estabelecidas nos permitem definir as configurações PDT ideais para futuros estudos em modelos animais. Eles são uma ferramenta fácil e rápida para a avaliação da eficácia da TFD in vivo.

Introdução

Estado da arte do tratamento de osteossarcoma (OS) de hoje, um tumor ósseo primário, abrange uma combinação de quimioterapia adjuvante e neo cirurgia. Este regime de tratamento revelou um aumento na taxa de sobrevivência de pacientes com doença localizada a partir de cerca de 20% antes do uso de quimioterapia, a atualmente entre 60-70% ^{3, 4.} No entanto, nas últimas duas décadas, a sobrevida global dos pacientes com doença do sistema operacional local tem plateaued ^{4, 5.} Além disso, 30-40% dos pacientes com recaída no prazo de 3 anos após o diagnóstico e os pacientes com doença metastática continuam a ter uma fraca sobrevivência de 20-30% ^4,....

Protocolo

1. Comparação da absorção de mTHPC no Baixo respectiva e altamente metastático HOS e 143B OS linhas celulares

1. Prepare a meio de cultura celular contendo DMEM, F12 de Ham, e inactivado por calor soro fetal de vitelo numa 4.5:4.5:1 proporção.
   Nota: A formulação lipossomal do PS mTHPC foi dissolvido em água a uma concentração final de 1,5 mg / ml mTHPC.
2. Placa de 0,2 x 10 ⁶ e as células HOS 143B / poço em placas de 6 poços (triplica para cada condição) e deixar que as células aderir durante a noite.
   Nota: o número não tem de ser ajustada para as linhas de células individuais. A confluência de....

Resultados

Com as técnicas aqui relatadas, investigamos PDT-based mTHPC em células do sistema operacional humanos. Primeiro, o tempo e a dose de absorção dependente mTHPC foi investigada no baixo HOS metastático e nas linhas de células 143B OS altamente metastáticas. mTHPC absorção pode ser avaliada através da medição da fluorescência de mTHPC com um espectrofotómetro de fluorescência (Figura 2, reproduzida com a permissão do Reidy et al. ^11). Figura 2A ilustra a absorção de mT.......

Discussão

Para alcançar citotoxicidade ideal em resposta a PDT, é fundamental para escolher as configurações de luz de laser direita e tempos de incubação. Os procedimentos aqui descritos são consistentes e eficiente para determinar a absorção de PS e para quantificar a citotoxicidade induzida por PDT, in vitro. Usando os comprimentos de onda de absorção específicas do PS mTHPC, a absorção PS celular pode ser determinada de um modo directo, e o PS pode ser activada para gerar espécies reactivas de oxigénio citotóxicos. <.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
DMEM	PAA GmbH, Freiburg, Alemanha	E15-883
HAM F12	PAA GmbH, Freiburg, Alemanha	E15-817
Soro fetal de bezerro inativado por calor	GIBCO, Basel, Suíça	10500-064
mTHPC	biolitec Research GmbH, Jena, Alemanha		Como esta formulação lipossomal é originária da R& D nenhum número de catálogo está disponível no momento. Estoque: 1,5 mg/ml; fornecido em uma mistura 9:1 de dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) e dipalmitoilfosfatidilglicerol (DPPG; >99% de pureza)
Leitor de placas Spectramax Gemini XS	Molecular Devices, Sunnyvale, CA	ID# 861
Microscópio Zeiss Observer.Z1	Axio Observer, Axio Vision Release 4.6.3 SP1, Jena Alemanha
Ceralas PDT 652 nm Laser	biolitec AG, Jena, Alemanha	LD652nm2W400u
Reagente de tetrazólio solúvel em água (WST)	Roche Diagnostics AG, Rotkreuz, Suíça	1644807