Citotóxicos Eficácia da Terapia Fotodinâmica no osteossarcoma Células<em&gt; In Vitro</em

Resumo

O protocolo relatado aqui permite a avaliação da eficácia da terapia fotodinâmica (PDT) em linhas de células e a optimização das condições de PDT, antes de aplicar a terapia em modelos animais.

Resumo

Nos últimos anos, tem sido a dificuldade em encontrar terapias mais eficazes contra o câncer com menos efeitos colaterais sistêmicos. Portanto Terapia Fotodinâmica é uma nova abordagem para um tratamento selectivo mais tumor.

Terapia Fotodinâmica (PDT) que faz uso de um fotossensibilizador não tóxico (PS), que, após a activação com luz de um comprimento de onda específico, na presença de oxigénio, gera radicais livres de oxigénio, que provocam uma resposta citotóxica ^1. Apesar de sua aprovação há quase vinte anos pelo FDA, PDT hoje é apenas usado para tratar um número limitado de tipos de câncer (de pele, bexiga) e doenças nononcological (psoríase, queratose actínica) ^2.

A principal vantagem da utilização da TFD é a capacidade de executar um tratamento local, o que evita os efeitos secundários sistémicos. Além disso, permite o tratamento de tumores em locais delicados (por exemplo, em torno de nervos ou vasos sanguíneos). Aqui, um intraoperataplicação ive do PDT é considerada no osteossarcoma (OS), um tumor do osso, para atingir satélites tumor primário deixado para trás em torno do tecido tumoral após a ressecção cirúrgica do tumor. O tratamento tem como objetivo diminuir o número de recidivas e na redução do risco de (pós-operatório) metástase.

No presente estudo, apresentamos in vitro procedimentos PDT para estabelecer as configurações PDT ideais para o tratamento eficaz de linhas de células do sistema operacional amplamente utilizados que são usados ​​para reproduzir a doença humana em modelos do rato OS intratibial bem estabelecidos. A captação do PS mTHPC foi examinada com um espectrofotómetro e fototoxicidade foi provocado com a luz laser de excitação de mTHPC em 652 nm para induzir a morte celular avaliada com um ensaio de WST-1 e pela contagem de células sobreviventes. As técnicas estabelecidas nos permitem definir as configurações PDT ideais para futuros estudos em modelos animais. Eles são uma ferramenta fácil e rápida para a avaliação da eficácia da TFD in vivo.

Introdução

Estado da arte do tratamento de osteossarcoma (OS) de hoje, um tumor ósseo primário, abrange uma combinação de quimioterapia adjuvante e neo cirurgia. Este regime de tratamento revelou um aumento na taxa de sobrevivência de pacientes com doença localizada a partir de cerca de 20% antes do uso de quimioterapia, a atualmente entre 60-70% ^{3, 4.} No entanto, nas últimas duas décadas, a sobrevida global dos pacientes com doença do sistema operacional local tem plateaued ^{4, 5.} Além disso, 30-40% dos pacientes com recaída no prazo de 3 anos após o diagnóstico e os pacientes com doença metastática continuam a ter uma fraca sobrevivência de 20-30% ^{4, 6, 7.} Para melhorar o resultado de esses pacientes, novas estratégias terapêuticas têm de ser desenvolvidas.

Terapia Fotodinâmica (PDT), uma terapia anticâncer em vez novela, usa a luz de um comprimento de onda específico para a excitação de um photosensiTizer (PS), que se acumula nas células tumorais após a sua injecção na corrente sanguínea. A luz do laser de excitação do PS gera radicais de oxigénio, na presença de oxigénio, os quais induzem a reacção citotóxica em células tumorais e a morte celular. Além deste mecanismo primário, dois PDT adicional evocado processos biológicos contribuir para o crescimento do tumor reduzido: TFD causa a vasoconstrição e a formação de trombos da microcirculação do tumor e, consequentemente, a hipóxia e anóxia locais no interior do tumor, levando a enfarte do tumor. Finalmente, PDT feridos e moribundos células tumorais desencadear uma resposta imune local, uma característica bastante singular do PDT. Isto envolve o sistema do complemento e a activação das células apresentadoras de antigénios dendríticas ^8. Assim, são criadas condições para a apresentação de antígenos tumorais com subsequente ativação de células linfóides, levando a imunidade específica do tumor.

Até agora, a terapia fotodinâmica tem sido utilizada para tratar diversos tipos de tumores de tecidos moles e hyperplásia de, como a ceratose actínica, esôfago de Barrett, tumores endobrônquica, câncer de bexiga, carcinomas basocelulares e tratamento paliativo de câncer de cabeça e pescoço ^2. O tratamento é conhecido por induzir a necrose de grande escala local com apenas pequenos efeitos secundários, e, portanto, tem o potencial para eliminar selectivamente o tecido do tumor. Apesar destas vantagens, a aplicação de PDT permanece tecnicamente mais exigente do que a administração de fármacos quimioterapêuticos. A fim de atingir a eficácia máxima, a concentração de PS, o tempo de exposição à luz e de transferência total de energia de luz têm de ser optimizados. Isto pode ser feito em experiências in vivo, mas, por causa do grande número relativo de parâmetros que têm de ser optimizados, é mais eficiente para determinar inicialmente a condições óptimas in vitro.

Nas experiências descritas em seguida, testou-se a eficácia in vitro de PDT utilizando o PS 5,10,15,20-tetraquis-(meta-hidroxifenil) chlorin, abreviado mTHPC (Figura 1A). mTHPC é a substância activa do medicamento Foscan, que é usado atualmente na clínica para o tratamento paliativo de câncer de cabeça e pescoço. É um dos PS mais potente, induzindo enormes danos celulares já em baixas concentrações, e demonstrou-se ser superior a outras PS em termos de penetração do tecido ^{9, 10.} O seu espectro de absorção de luz (Figura 1B) mostra dois picos proeminentes, uma em 417 nm e um segundo de 652 nm, que são utilizados para a localização de tecido de acumulação de PS e para a indução de PDT, respectivamente.

Atualmente, uma formulação lipossomal para mTHPC está em desenvolvimento. Aqui, descrevemos os procedimentos para quantificar a absorção desta formulação lipossomal, e para realizar PDT em duas linhas de células do sistema operacional humanos, o baixo HOS metastático e as células metastáticas 143B altos. Alguns dos dados aqui apresentados foram relatados anteriormente ^11. The abordagem aqui descrita permite-nos estudar o efeito de um fenótipo metastático em PDT eficácia. Células 143B, ortotopicamente injetadas nos membros posteriores de ratos SCID imunodeficientes causar tumores primários metástase intratibial, um modelo que imita de perto a doença metástase humana. Assim, as experiências in vitro propostos são perfeitamente adequados para avaliar os ajustes de PDT óptimas para ser usado mais tarde em experiências in vivo.

Protocolo

1. Comparação da absorção de mTHPC no Baixo respectiva e altamente metastático HOS e 143B OS linhas celulares

1. Prepare a meio de cultura celular contendo DMEM, F12 de Ham, e inactivado por calor soro fetal de vitelo numa 4.5:4.5:1 proporção.
   Nota: A formulação lipossomal do PS mTHPC foi dissolvido em água a uma concentração final de 1,5 mg / ml mTHPC.
2. Placa de 0,2 x 10 ⁶ e as células HOS 143B / poço em placas de 6 poços (triplica para cada condição) e deixar que as células aderir durante a noite.
   Nota: o número não tem de ser ajustada para as linhas de células individuais. A confluência de 80-90% é o mais adequado para o tempo da experiência.
3. No dia seguinte, incubar as células com uma concentração fixa de mTHPC para diferentes períodos de tempo (tempo de absorção dependente), ou com concentrações crescentes de mTHPC durante um período de tempo fixo (dose de absorção dependentes).
4. Incubar as células com mTHPC por tempo específico pontos ou concentrações de mTHPC.
   Nota: Neste estudo, ambas as linhas de células HOS e 143B foram incubadas com 0,6 ug / ml mTHPC para 0, 2,5, 5, ou 10 horas, ou com 0, 0,6, 2,5, e 10 ug / ml mTHPC durante 5 horas. Os períodos de tempo aplicados e as dosagens podem variar dependendo da linha de células que é utilizado.
5. Lembre-se de trabalhar sempre no escuro ou em condições de iluminação se apagaram para evitar a exposição à luz direta das células.
6. Após incubação das células com as condições indicadas, aspirar o meio e lava-se as células três vezes com PBS. Em seguida, retire as células com 0,5 ml de tripsina / EDTA e contar as células.
7. Depois de descolamento, centrifugar as células a 400 xg durante 5 min, aspirar o meio e ressuspender as células em PBS para uma densidade final de 200.000 células / ml.
8. Pipete 100 pi da suspensão de células obtida (ou seja, 20.000 células) em uma placa de 96 poços e medir a fluorescência destas células em um espectrofotómetro de fluorescência. A definiçãos para medições de fluorescência mTHPC são: 417 nm para a excitação e 652 nm para a emissão.
9. A fim de calcular a quantidade de mTHPC interiorizada por célula, a unidade de normalizar a fluorescência relativa (RFU) para o número de células e volume de células como se segue:
10. Prepara-se uma curva padrão, utilizando diferentes concentrações de mTHPC em PBS 0-4 ug / ml (medidas em triplicado) utilização. Pipetar 100 l de cada diluição numa placa de 96 poços e medir a fluorescência dos poços, utilizando as definições descritas no passo 1.6.
11. Dividir a RFU (obtido por 20000 células) pela inclinação da curva de calibração linear de mTHPC, que dá a concentração de mTHPC (em ug / ml) no poço.
12. Dividir esta concentração mTHPC por 10 para obter a quantidade total de mTHPC num poço (em ug, representando 100 ul de suspensão de células) e dividir esse valor, o volume de 20000 células.
13. Calcular o volume com a fórmula para uma esfera: (4/3 x π) xr ^3. Obter o raio r medindo o diâmetro de 20 células tratadas com tripsina sob um microscópio, e dividindo esse valor por 2.
14. Finalmente, normalizar todos os valores para os obtidos para as células HOS após 10 horas de incubação (dose de absorção dependente) ou tratadas com 10 ug / ml mTHPC (tempo de absorção dependente), que foram definidos como 100%.

2. Medição da fototoxicidade do PS In Vitro

1. Semente de 3.000 células / poço numa placa de 96 cavidades (triplicados para cada concentração de mTHPC utilizado) e deixá-los aderir durante a noite. Similarmente preparar uma placa de 96 poços adicional e tratar as células, tal como descrito abaixo, mas, em seguida, colocá-los de lado para a imagem de contraste de fase.
   Nota: o número tem que ser ajustada para cada linha celular individual. A confluência de 50-60% no tempo da experiência é ideal.
   1. Tenha em mente para adicionar o correspondente controlo de toxicidade no escuro de células para cada uma das concentrações mTHPC. Ose, são as células que irão ser incubadas na ausência ou na presença de concentrações seleccionadas de mTHPC, mas não irá ser iluminada.
2. No dia seguinte, incubar as células com diferentes concentrações de mTHPC (0, 0,0001, 0,001, 0,01, 0,03, 0,075, 0,15, 0,3, 0,6, 1,25, 2,5, 5, e 10 ug / ml), dependendo das linhas de células e mantê-los no escuro por 5 horas.
   1. Consulte a Seção 1.3.2
      Nota: O tempo de incubação antes da iluminação depende da linha celular e do PS usado, por conseguinte, é aconselhável para testar diferentes concentrações e em diferentes pontos de tempo em experiências separadas.
3. Após a incubação para o período de tempo indicado, lavar as células duas vezes com PBS e adicionar novo meio fresco sem mTHPC.
4. Iluminar as células com um diodo laser de 652 nm, específico para o espectro de absorção mTHPC (ver Figura 1).
   1. Defina a laser para 21,88 mW / cm ² poder a uma altura de 13,5 centímetros distance a partir das células, a fim de obter uma dose de energia de 5 J / cm ^2. Iluminar as células para 230 seg. Não iluminar as células controle toxicidade escuras (com e sem mTHPC).
      Nota: Use sempre óculos para proteger os olhos da luz do laser usado para a excitação do PS.
5. Depois de iluminação, manter as células no escuro a 37 º C por 24 horas. Posteriormente, adicione água de tetrazólio solúvel (WST-1) reagente (10 μl/100 mL de meio).
6. Três horas após a adição do reagente WST-1, mede-se a absorvância dos poços individuais da placa de 96 poços a 415 nm.
7. A fim de calcular a percentagem de células sobreviventes, definir a média dos valores obtidos para as células não tratadas mTHPC para cada condição de 100% (ou seja iluminado, sem mTHPC e nonilluminated, sem mTHPC).

3. Estimativa de número de celular por contagem celular

1. Semente 20.000 células / nósll em uma placa de 24 poços e deixá-los a aderir durante a noite.
2. Incubar as células durante 5 horas com mTHPC (0,001, 0,003, 0,15, 0,6 e 1,25 ug / ml) e iluminá-los, tal como descrito acima.
3. Recolhe-se o meio, lavar as células uma vez com PBS, trypsinize los e recolhê-las por centrifugação a 400 xg durante 5 min.
4. Após a centrifugação, aspirar o meio e ressuspender as células em 200 ul de meio fresco.
5. Contar as células em uma câmara de Neubauer.

Resultados

Com as técnicas aqui relatadas, investigamos PDT-based mTHPC em células do sistema operacional humanos. Primeiro, o tempo e a dose de absorção dependente mTHPC foi investigada no baixo HOS metastático e nas linhas de células 143B OS altamente metastáticas. mTHPC absorção pode ser avaliada através da medição da fluorescência de mTHPC com um espectrofotómetro de fluorescência (Figura 2, reproduzida com a permissão do Reidy et al. ^11). Figura 2A ilustra a absorção de mT...

Discussão

Para alcançar citotoxicidade ideal em resposta a PDT, é fundamental para escolher as configurações de luz de laser direita e tempos de incubação. Os procedimentos aqui descritos são consistentes e eficiente para determinar a absorção de PS e para quantificar a citotoxicidade induzida por PDT, in vitro. Usando os comprimentos de onda de absorção específicas do PS mTHPC, a absorção PS celular pode ser determinada de um modo directo, e o PS pode ser activada para gerar espécies reactivas de oxigénio citotóxicos. <...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
DMEM	PAA GmbH, Freiburg, Alemanha	E15-883
HAM F12	PAA GmbH, Freiburg, Alemanha	E15-817
Soro fetal de bezerro inativado por calor	GIBCO, Basel, Suíça	10500-064
mTHPC	biolitec Research GmbH, Jena, Alemanha		Como esta formulação lipossomal é originária da R& D nenhum número de catálogo está disponível no momento. Estoque: 1,5 mg/ml; fornecido em uma mistura 9:1 de dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) e dipalmitoilfosfatidilglicerol (DPPG; >99% de pureza)
Leitor de placas Spectramax Gemini XS	Molecular Devices, Sunnyvale, CA	ID# 861
Microscópio Zeiss Observer.Z1	Axio Observer, Axio Vision Release 4.6.3 SP1, Jena Alemanha
Ceralas PDT 652 nm Laser	biolitec AG, Jena, Alemanha	LD652nm2W400u
Reagente de tetrazólio solúvel em água (WST)	Roche Diagnostics AG, Rotkreuz, Suíça	1644807