Monitorando a montagem de um fator de virulência bacteriana secretado usando reticulação específica do local

Muitas vezes é essencial identificar e caracterizar interações entre uma proteína de interesse e outros componentes celulares para definir seu papel em uma via biológica, entender sua montagem ou elucidar seu mecanismo de ação. Uma ampla variedade de abordagens é comumente usada para estudar as interações proteína-proteína, mas todas têm suas limitações. O método imparcial mais simples para identificar proteínas que se ligam a uma proteína de interesse é a copurificação (ou coimunoprecipitação), mas essa abordagem requer que um complexo proteico permaneça intacto durante o procedimento de purificação. Interações proteicas fracas ou transitórias podem ser estabilizadas por meio de reticulação química, mas esse método normalmente requer o uso de compostos que ligam proteínas por meio de aminas primárias que estão amplamente espalhadas na sequência de proteínas. Padrões complicados de reticulação que são difíceis de interpretar podem ser gerados, especialmente quando proteínas de interesse são componentes de complexos multiproteicos. Além disso, como os braços espaçadores dos reticuladores químicos geralmente excedem 10 Å de comprimento, as ligações covalentes podem ser formadas com proteínas localizadas nas proximidades, mas não interagem diretamente com a proteína de interesse. Métodos como cromatografia de afinidade e telas de dois híbridos também são frequentemente úteis para identificar interações proteína-proteína. A primeira abordagem, no entanto, requer condições de reprodução que promovam interações fisiologicamente significativas e não pode ser usada para detectar interações fracas. A última abordagem requer que as interações de ligação possam ser replicadas no organismo hospedeiro e sejam mantidas quando uma proteína de interesse e seus parceiros de ligação são colocados no contexto de uma proteína de fusão. Os métodos de dois híbridos também tendem a gerar resultados falso-positivos². Uma vez que uma interação proteína-proteína tenha sido estabelecida, muitas vezes é necessário um trabalho considerável para mapear o local da interação. Talvez a desvantagem mais significativa das abordagens tradicionais seja que elas não fornecem nenhuma informação sobre a sequência temporal das interações intermoleculares ou a cinética de ligação.

Este artigo descreve um método simples que supera algumas das limitações de outras abordagens usadas para estudar as interações proteína-proteína. Inicialmente, uma única mutação âmbar é introduzida no gene que codifica uma proteína de interesse. O mutante âmbar é então coexpresso com um tRNA supressor de âmbar e uma amino acil-tRNA sintetase derivada de Methanococcus jannaschii que foram projetados para incorporar o análogo de aminoácido fotoativável p-benzoilfenilalanina (Bpa) apenas em códons âmbar³. A irradiação de células com luz ultravioleta (UV) de comprimento de onda longo (~ 365 nm) facilita a formação de uma ligação covalente entre Bpa e proteínas que estão dentro de ~ 3-8 Å^4,5. Em alguns contextos experimentais, também podem ser formadas ligações cruzadas entre o Bpa ativado e componentes não proteicos das células, como lipídios e ácidos nucléicos⁶. As moléculas que terminam no códon âmbar geralmente devem ser facilmente distinguíveis da proteína de comprimento total no SDS-PAGE e não podem ser reticuladas com outras proteínas. Ao submeter as células à radiomarcação de pulso antes da reticulação e, em seguida, imunoprecipitação ou produtos de reticulação purificadores de afinidade, a sequência e a duração das interações proteína-proteína podem ser estabelecidas. A capacidade de gerar informações temporais sobre interações intermoleculares é especialmente valiosa para estudar a progressão de uma proteína de interesse através de qualquer via ordenada de montagem, tráfego ou sinalização em várias etapas e para identificar intermediários da via. Assim como a reticulação química, a reticulação específica do local detecta interações proteína-proteína que ocorrem em condições fisiológicas, mas a introdução de um reticulador em uma única posição facilita a análise das interações entre segmentos individuais de uma proteína e outros fatores. Essa característica única de reticulação específica do local é especialmente vantajosa quando a proteína de interesse tem vários segmentos ou domínios que têm o potencial de interagir com parceiros de ligação distintos. Além disso, a reticulação específica do local pode ser usada em combinação com métodos como espectrometria de massa para mapear os resíduos que medeiam as interações proteína-proteína com precisão. Embora esse método seja otimizado para uso em E. coli, a incorporação de análogos de aminoácidos fotaciváveis em proteínas por supressão de âmbar tem sido relatada em células de Mycobacterium, leveduras e mamíferos^7-11. Assim, em princípio, nosso método pode ser usado em outros sistemas.

Usamos esse método extensivamente para identificar interações intermoleculares que facilitam a biogênese de EspP, um fator de virulência O157:H7 de E. coli. EspP é um membro de uma superfamília de proteínas conhecidas como "autotransportadores" que contêm um grande domínio extracelular N-terminal ("domínio passageiro") e domínio aC-terminal ("domínio b") que se dobra em uma estrutura cilíndrica de barril b e ancora a proteína à membrana externa (MO) ¹² . O mecanismo pelo qual o domínio do passageiro é translocado através do OM tem sido um mistério de longa data. Como todas as proteínas da superfície celular bacteriana, o EspP deve ser transportado através da membrana interna, transportado através do periplasma (o espaço entre as membranas interna e externa) e direcionado para o OM em uma série de eventos ordenados. Após sua translocação através do OM, o domínio passageiro EspP também é separado do domínio b por uma clivagem proteolítica e liberado da superfície celular. Ao combinar a reticulação específica do local com a radiomarcação de perseguição de pulso, mostramos que ambos os domínios da proteína interagem inicialmente com a chaperona molecular Skp no periplasma⁶. Posteriormente, segmentos discretos do domínio b interagem de forma estereoespecífica com componentes de um heterooligômero chamado complexo Bam, que catalisa a integração de proteínas do barril b na MO bacteriana por um mecanismo desconhecido. Talvez o mais interessante seja que descobrimos que o domínio do passageiro está em contato com uma das subunidades do complexo Bam (BamA) à medida que atravessa o OM¹³. Nossos resultados nos permitiram construir um modelo detalhado para a montagem do autotransportador¹⁴ e implicaram o complexo Bam no transporte do domínio de passageiros através do OM.

1. Construção de plasmídeo

1. Depois de clonar um gene que codifica uma proteína de interesse em um vetor de expressão apropriado, introduza mutações âmbar nos locais desejados usando um kit de mutagênese dirigida ao local.
   NOTA: Informações estruturais e previsões de exposição à superfície podem servir como guias úteis para determinar as posições das mutações. Como a eficiência da supressão e reticulação do âmbar pode variar consideravelmente, as mutações do âmbar devem ser introduzidas em várias posições. Além disso, como o Bpa é um análogo da tirosina e da fenilalanina, tente introduzir mutações âmbar em posições que normalmente codificam grandes aminoácidos hidrofóbicos para minimizar as perturbações da estrutura e função das proteínas. Finalmente, ao escolher um vetor de expressão, lembre-se de que a superprodução de uma proteína de interesse em um nível muito alto pode limitar a eficiência da incorporação de Bpa.

2. Preparação da cultura

1. Use eletroporação para transformar uma cepa apropriada de E. coli com um plasmídeo que codifica o sistema de supressão âmbar (pDULE-p Bpa; ver referência⁴) e um plasmídeo compatível que codifica a proteína de interesse com uma mutação âmbar.
2. Células em placas em ágar LB contendo antibióticos apropriados (use 5 μg/ml de tetraciclina para selecionar pDULE-p Bpa). Incubar as placas O/N a 37 °C.
3. No dia seguinte, iniciar as culturas O/N a partir de colónias únicas em 3-5 ml de meio M9¹⁴ contendo 0,2% de glicerol, todos os L-aminoácidos, exceto metionina e cisteína (40 μg/ml) e antibióticos. Incubar a 37 °C.
4. No dia seguinte, centrifugue culturas O/N a 2.500 x g por 5 min em RT para granular células. Ressuspender as células em 5 ml de meio M9 fresco e repetir a centrifugação.
   NOTA: Esta etapa de lavagem é crítica para manter os plasmídeos que codificam a resistência à ampicilina porque pequenas quantidades de b lactamase presentes no meio das culturas O/N degradam a ampicilina recém-adicionada antes que ocorra um crescimento celular significativo.
5. Ressuspender as células em 2 ml de meio fresco e medir a concentração celular num espectrofotómetro (OD₅₅₀).
6. Adicionar células a um frasco de Erlenmeyer de 250 ml contendo 50 ml de meio M9 e antibióticos a OD₅₅₀=0,03. Incubar as culturas a 37 °C em banho-maria agitado.

3. Incorporação de BPA e Preparação para Fotocrosslinking

NOTA: O protocolo descrito abaixo é para um curso de tempo de amostra que tem três pontos de tempo (0, 1 e 5 min). Ajuste os volumes de acordo se desejar um número diferente de pontos de tempo. Um esboço do procedimento é ilustrado na Figura 1.

1. Enquanto as culturas estão crescendo, prepare uma solução fresca de 1 M (1.000x) de Bpa em NaOH 1 M (27 mg de Bpa em 100 μl de NaOH 1 M). Use um tubo de paredes escuras para manter a solução no escuro.
2. Quando as culturas atingirem a fase inicial a intermediária (OD₅₅₀ = 0,2), adicione 50 μl 1 M Bpa a cada cultura. Adicione Bpa uma gota de cada vez enquanto gira o frasco para evitar precipitação. Em seguida, adicione quaisquer indutores necessários para impulsionar a expressão do mutante âmbar. Continue a incubar as culturas a 37 °C por mais 30 min.
3. Durante o período de indução de 30 minutos, rotule seis tubos de centrífuga descartáveis de 15 ml com o ponto de tempo (0 min, 1 min, 5 min) e "+ UV" ou "- UV". Coloque os tubos no gelo.
4. Encha um segundo balde de gelo com gelo e coloque uma placa de cultura de tecidos de 6 poços em cima do gelo.
5. Descongele a alta atividade específica (1.000 mCi / mmol) ³⁵S-metionina e ³⁵S-cisteína (ou uma mistura pré-fabricada dos dois compostos) para a marcação do pulso e prepare (ou descongele) uma solução de L-cisteína e L-metionina não radioativas (100 mM cada) para a perseguição.
6. Ligue a lâmpada UV cinco minutos antes da radiomarcação.
   NOTA: A lâmpada deve ser ajustável para que possa ser posicionada a ~3-4 cm das amostras na placa multipoços.
7. Adicione gelo (~ 2 ml) a cada tubo rotulado como "- UV" e a dois dos poços na placa multipoços.
   NOTA: O gelo deve ser adicionado a um terceiro poço imediatamente antes do ponto de tempo de 5 minutos. É essencial colocar gelo diretamente nos tubos e poços para interromper as reações intracelulares imediatamente em cada ponto de tempo e, assim, obter "instantâneos" precisos de uma via bioquímica específica.
8. No final do período de indução de 30 minutos, transferir 25 ml da cultura para um Erlenmeyer descartável de 125 ml pré-aquecido. Colocar o balão no banho-maria agitado a 37 °C.

4. Rotulagem de perseguição de pulso e irradiação UV

NOTA: O protocolo de rotulagem de perseguição de pulso e irradiação UV tem muitas etapas que devem ser executadas em tempo hábil e que exigem considerável organização e preparação antecipada. Todos os reagentes e tubos devem ser facilmente acessíveis. Um protocolo para um experimento que tem pontos de tempo de 0, 1 e 5 minutos é apresentado abaixo.

1. No momento 0:00 (min:seg), transferir 25 ml de cultura para um balão de 125 ml.
2. No tempo 0:30, adicionar 30 μCi/ml de aminoácidos radioactivos; agitar rapidamente para misturar. Colocar o balão no banho-maria agitado a 37 °C.
3. No tempo 1:00, adicionar 250 μl da solução de metionina-cisteína a 100 mM; agitar rapidamente para misturar.
   1. Pipetar imediatamente 4 ml da cultura para um dos alvéolos da placa multipoços refrigerada que contém gelo. Pipetar uma segunda alíquota de 4 ml para o tubo de 15 ml identificado como "0 min - UV". Volte a colocar o balão no banho-maria.
4. Às 2:00, pipetar 4 ml da cultura para o segundo poço da placa multipoços refrigerada que contém gelo. Pipetar mais uma alíquota de 4 ml para o tubo de 15 ml identificado como "1 min - UV". Voltar a colocar o balão no banho-maria.
5. Às 6:00, pipetar 4 ml da cultura para o terceiro poço da placa multipoços gelada que contém gelo. Pipetar outra alíquota de 4 ml para o tubo de 15 ml identificado como "5 min - UV".
6. Coloque o balde de gelo com a placa multipoços sob a lâmpada UV pré-aquecida e irradie cada amostra individualmente por 4 min.
   NOTA: Em experimentos em que os pontos de tempo são espaçados pelo menos 4 min, cada amostra deve ser irradiada assim que for pipetada na placa multipoços.
7. Transfira as células para os tubos refrigerados de 15 ml rotulados como "0 min + UV", 1 min + UV ", etc.
8. Centrifugue as células a 2.500 x g por 10 min a 4 °C.
9. Ressuspender cada amostra em 300 μl de meio M9 ou PBS e adicionar 33 μl de ácido tricloroacético (TCA) 100% frio para precipitar as proteínas. Centrifugue os precipitados de TCA em uma microcentrífuga em velocidade máxima por 10 min e remova o sobrenadante. Neste ponto, as amostras podem ser armazenadas a - 20 °C.

5. Imunoprecipitação e Detecção de Produtos de Reticulação

1. Adicione 50 μl de tampão de solubilização (15% de glicerol, 200 mM de Trisbase, 15 mM de EDTA, 4% de SDS, 2 mM de PMSF) a cada amostra e aqueça com agitação a 95 ° C por 5 min para solubilizar a proteína precipitada.
2. Adicione 1 ml de tampão de ensaio de radioimunoprecipitação (RIPA) (50 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCl, 1,0% Igepal CA-630, 0,5% desoxicolato, 0,1% SDS) e execute imunoprecipitações padrão¹⁵ usando um quinto a metade de cada amostra.
   NOTA: Igepal CA-630 (octilfenil-polietilenoglicol) é usado no lugar do NP-40, que não está mais disponível comercialmente. Os dois compostos são quimicamente indistinguíveis.
3. Resolva proteínas imunoprecipitadas por SDS-PAGE. Colora, desmancha e seca géis.
4. Exponha os géis a uma tela de fósforo O/N e detecte proteínas radioativas (incluindo produtos de reticulação) com um gerador de imagens de fósforo.

Usamos fotoreticulação específica do local para identificar proteínas que interagem com EspP durante sua jornada para o MO. Nos experimentos mostrados aqui, os códons de fenilalanina nos resíduos 1113 e 1214 foram substituídos por códons âmbar. Ambas as posições estão localizadas no bdomínio, que se integra ao MO e serve como âncora de membrana. A estrutura cristalina do domínio EspPβ16 mostra que os dois resíduos estão no lado periplasmático do barril b, mas estão separados por ~ 120 ° (ver estrutura nas Figuras 2 e 3). A cepa AD20217de E. coli foi transformada com pDULE-p Bpa e um plasmídeo (pRI22) que codifica um dos dois mutantes âmbar EspP13. Depois que o IPTG foi adicionado para induzir a síntese de EspP, a marcação de perseguição de pulso foi realizada e as amostras foram coletadas em pontos de tempo de 0, 1 e 5 minutos. Metade de cada alíquota foi irradiada por UV, enquanto a outra metade foi usada como controle não irradiado. As imunoprecipitações foram então conduzidas usando anti-soros gerados contra um peptídeo EspP C-terminal e contra outras proteínas, conforme descrito abaixo. As proteínas imunoprecipitadas foram resolvidas por SDS-PAGE.

Dois polipeptídeos diferentes foram imunoprecipitados de células irradiadas e controle pelo anti-EspPantiserum C-terminal (Figuras 2 e 3, pistas 2-4 e 9-11). Inicialmente, predominou uma forma precursora de ~ 135 kD da proteína que contém domínios passenger e b covalentemente ligados (proEspP). Em momentos posteriores, o nível de proEspP diminuiu e o domínio b livre começou a predominar à medida que o domínio passageiro foi translocado através do OM e separado do domínio b por uma clivagem proteolítica. As amostras irradiadas com UV, no entanto, claramente tinham faixas de peso molecular mais altas que não estavam presentes nas amostras de controle (Figuras 2 e 3, pistas 9-11; ver também referências6,14). Essas bandas resultam da reticulação de proEspP com proteínas que interagem. Com base na mobilidade desses polipeptídeos, estimamos o tamanho das proteínas que interagem e, em seguida, determinamos se elas podem corresponder a fatores de montagem de proteínas MO conhecidos. Para testar nossas previsões, realizamos imunoprecipitações adicionais usando anti-soros gerados contra os supostos parceiros de interação. Descobrimos que um polipeptídeo de ~ 150 kD que foi observado quando o Bpa foi incorporado em ambos os resíduos 1113 e 1214 poderia ser imunoprecipitado com um anti-soro contra a chaperona periplasmática de 17 kD Skp (Figuras 2 e 3, pista 8). Além disso, descobrimos que polipeptídeos maiores que foram observados quando o Bpa foi incorporado em apenas uma das duas posições poderiam ser imunoprecipitados com anti-soros contra as subunidades do complexo Bam BamB e BamD, respectivamente (Figuras 2 e 3, pistas 12-14).

Esses experimentos fornecem informações temporais e espaciais sobre as interações EspP durante sua montagem. A observação de que as interações entre as proteínas do complexo proEspP e Bam atingiram o pico mais tarde e persistiram por mais tempo do que as interações com Skp sugere que o proEspP interage primeiro com Skp e depois se liga ao complexo Bam. Além disso, a reticulação de dois resíduos localizados em lados opostos do domínio b para subunidades discretas do complexo Bam sugere que o barril b interage com o complexo Bam de forma estereoespecífica durante sua integração no MO. Essa observação tem implicações importantes para a compreensão do mecanismo pelo qual o complexo Bam catalisa a integração da membrana das proteínas do barril b.

Figura 1. Esboço da rotulagem de perseguição de pulso e protocolo de fotoreticulação específico do local. Bpa e quaisquer indutores necessários para conduzir a expressão do mutante âmbar são adicionados quando as culturas de E. coli estão na fase logarítmica (OD550 = 0,2). A radiomarcação por pulso é realizada 30 minutos depois. Em momentos apropriados, as alíquotas são removidas, colocadas em uma placa de vários poços e submetidas à irradiação UV individualmente. Uma alíquota adicional é removida em cada momento, mas não é irradiada. A proteína de interesse é imunoprecipitada e executada em SDS-PAGE. As bandas que são observadas em amostras irradiadas ("+ UV"), mas não de controle ("-UV"), surgem da reticulação da proteína de interesse para uma proteína em interação.

Figura 2. Interação do resíduo EspP 1113 com Skp e BamB. E. coli transformada com pDULE-p Bpa e um plasmídeo que codifica o autotransportador EspP com uma mutação âmbar no resíduo 1113 foram cultivadas em meio M9 e submetidas a radiomarcação de perseguição de pulso. Uma alíquota da cultura foi irradiada por UV em cada ponto de tempo e uma alíquota igual não foi tratada. As imunoprecipitações foram então conduzidas com os anti-soros indicados. A posição do resíduo 1113 no domínio EspPβ é mostrada à direita.

Figura 3. Interação do resíduo EspP 1214 com Skp e BamD. O experimento descrito na Figura 2 foi repetido, exceto que as células foram transformadas com pDULE-p Bpa e um plasmídeo que codifica o autotransportador EspP com uma mutação âmbar no resíduo 1214. Conforme mostrado à direita, o resíduo 1214 está localizado a ~120° de distância do resíduo 1113.

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.