Monitorando a montagem de um fator de virulência bacteriana secretado usando reticulação específica do local

Resumo

Este artigo ilustra o uso de marcação de rádio de perseguição de pulso em combinação com fotocrosslinking específico do local para monitorar as interações entre uma proteína de interesse e outros fatores em E. coli. Ao contrário dos métodos tradicionais de reticulação química, essa abordagem gera "instantâneos" de alta resolução de uma via de montagem ordenada em uma célula viva.

Resumo

Este artigo descreve um método para detectar e analisar interações dinâmicas entre uma proteína de interesse e outros fatores in vivo. Nosso método é baseado na tecnologia de supressão de âmbar que foi originalmente desenvolvida por Peter Schultz e colegas¹. Uma mutação âmbar é introduzida pela primeira vez em um códon específico do gene que codifica a proteína de interesse. O mutante âmbar é então expresso em E. coli junto com genes que codificam um tRNA supressor de âmbar e uma amino acil-tRNA sintetase derivada de Methanococcus jannaschii. Usando este sistema, o análogo de aminoácido fotoativável p-benzoilfenilalanina (Bpa) é incorporado no códon âmbar. As células são então irradiadas com luz ultravioleta para ligar covalentemente o resíduo de Bpa a proteínas localizadas dentro de 3-8 Å. A fotoreticulação é realizada em combinação com a marcação de pulso e imunoprecipitação da proteína de interesse, a fim de monitorar as mudanças nas interações proteína-proteína que ocorrem em uma escala de tempo de segundos a minutos. Otimizamos o procedimento para estudar a montagem de um fator de virulência bacteriana que consiste em dois domínios independentes, um domínio que é integrado à membrana externa e um domínio que é translocado para o espaço extracelular, mas o método pode ser usado para estudar muitos processos de montagem e vias biológicas diferentes em células procarióticas e eucarióticas. Em princípio, fatores de interação e até mesmo resíduos específicos de fatores de interação que se ligam a uma proteína de interesse podem ser identificados por espectrometria de massa.

Introdução

Muitas vezes é essencial identificar e caracterizar interações entre uma proteína de interesse e outros componentes celulares para definir seu papel em uma via biológica, entender sua montagem ou elucidar seu mecanismo de ação. Uma ampla variedade de abordagens é comumente usada para estudar as interações proteína-proteína, mas todas têm suas limitações. O método imparcial mais simples para identificar proteínas que se ligam a uma proteína de interesse é a copurificação (ou coimunoprecipitação), mas essa abordagem requer que um complexo proteico permaneça intacto durante o procedimento de purificação. Interações proteicas fracas ou transitórias podem ser estabilizadas por meio de reticulação química, mas esse método normalmente requer o uso de compostos que ligam proteínas por meio de aminas primárias que estão amplamente espalhadas na sequência de proteínas. Padrões complicados de reticulação que são difíceis de interpretar podem ser gerados, especialmente quando proteínas de interesse são componentes de complexos multiproteicos. Além disso, como os braços espaçadores dos reticuladores químicos geralmente excedem 10 Å de comprimento, as ligações covalentes podem ser formadas com proteínas localizadas nas proximidades, mas não interagem diretamente com a proteína de interesse. Métodos como cromatografia de afinidade e telas de dois híbridos também são frequentemente úteis para identificar interações proteína-proteína. A primeira abordagem, no entanto, requer condições de reprodução que promovam interações fisiologicamente significativas e não pode ser usada para detectar interações fracas. A última abordagem requer que as interações de ligação possam ser replicadas no organismo hospedeiro e sejam mantidas quando uma proteína de interesse e seus parceiros de ligação são colocados no contexto de uma proteína de fusão. Os métodos de dois híbridos também tendem a gerar resultados falso-positivos². Uma vez que uma interação proteína-proteína tenha sido estabelecida, muitas vezes é necessário um trabalho considerável para mapear o local da interação. Talvez a desvantagem mais significativa das abordagens tradicionais seja que elas não fornecem nenhuma informação sobre a sequência temporal das interações intermoleculares ou a cinética de ligação.

Este artigo descreve um método simples que supera algumas das limitações de outras abordagens usadas para estudar as interações proteína-proteína. Inicialmente, uma única mutação âmbar é introduzida no gene que codifica uma proteína de interesse. O mutante âmbar é então coexpresso com um tRNA supressor de âmbar e uma amino acil-tRNA sintetase derivada de Methanococcus jannaschii que foram projetados para incorporar o análogo de aminoácido fotoativável p-benzoilfenilalanina (Bpa) apenas em códons âmbar³. A irradiação de células com luz ultravioleta (UV) de comprimento de onda longo (~ 365 nm) facilita a formação de uma ligação covalente entre Bpa e proteínas que estão dentro de ~ 3-8 Å^4,5. Em alguns contextos experimentais, também podem ser formadas ligações cruzadas entre o Bpa ativado e componentes não proteicos das células, como lipídios e ácidos nucléicos⁶. As moléculas que terminam no códon âmbar geralmente devem ser facilmente distinguíveis da proteína de comprimento total no SDS-PAGE e não podem ser reticuladas com outras proteínas. Ao submeter as células à radiomarcação de pulso antes da reticulação e, em seguida, imunoprecipitação ou produtos de reticulação purificadores de afinidade, a sequência e a duração das interações proteína-proteína podem ser estabelecidas. A capacidade de gerar informações temporais sobre interações intermoleculares é especialmente valiosa para estudar a progressão de uma proteína de interesse através de qualquer via ordenada de montagem, tráfego ou sinalização em várias etapas e para identificar intermediários da via. Assim como a reticulação química, a reticulação específica do local detecta interações proteína-proteína que ocorrem em condições fisiológicas, mas a introdução de um reticulador em uma única posição facilita a análise das interações entre segmentos individuais de uma proteína e outros fatores. Essa característica única de reticulação específica do local é especialmente vantajosa quando a proteína de interesse tem vários segmentos ou domínios que têm o potencial de interagir com parceiros de ligação distintos. Além disso, a reticulação específica do local pode ser usada em combinação com métodos como espectrometria de massa para mapear os resíduos que medeiam as interações proteína-proteína com precisão. Embora esse método seja otimizado para uso em E. coli, a incorporação de análogos de aminoácidos fotaciváveis em proteínas por supressão de âmbar tem sido relatada em células de Mycobacterium, leveduras e mamíferos^7-11. Assim, em princípio, nosso método pode ser usado em outros sistemas.

Usamos esse método extensivamente para identificar interações intermoleculares que facilitam a biogênese de EspP, um fator de virulência O157:H7 de E. coli. EspP é um membro de uma superfamília de proteínas conhecidas como "autotransportadores" que contêm um grande domínio extracelular N-terminal ("domínio passageiro") e domínio aC-terminal ("domínio b") que se dobra em uma estrutura cilíndrica de barril b e ancora a proteína à membrana externa (MO) ¹² . O mecanismo pelo qual o domínio do passageiro é translocado através do OM tem sido um mistério de longa data. Como todas as proteínas da superfície celular bacteriana, o EspP deve ser transportado através da membrana interna, transportado através do periplasma (o espaço entre as membranas interna e externa) e direcionado para o OM em uma série de eventos ordenados. Após sua translocação através do OM, o domínio passageiro EspP também é separado do domínio b por uma clivagem proteolítica e liberado da superfície celular. Ao combinar a reticulação específica do local com a radiomarcação de perseguição de pulso, mostramos que ambos os domínios da proteína interagem inicialmente com a chaperona molecular Skp no periplasma⁶. Posteriormente, segmentos discretos do domínio b interagem de forma estereoespecífica com componentes de um heterooligômero chamado complexo Bam, que catalisa a integração de proteínas do barril b na MO bacteriana por um mecanismo desconhecido. Talvez o mais interessante seja que descobrimos que o domínio do passageiro está em contato com uma das subunidades do complexo Bam (BamA) à medida que atravessa o OM¹³. Nossos resultados nos permitiram construir um modelo detalhado para a montagem do autotransportador¹⁴ e implicaram o complexo Bam no transporte do domínio de passageiros através do OM.

Protocolo

1. Construção de plasmídeo

1. Depois de clonar um gene que codifica uma proteína de interesse em um vetor de expressão apropriado, introduza mutações âmbar nos locais desejados usando um kit de mutagênese dirigida ao local.
   NOTA: Informações estruturais e previsões de exposição à superfície podem servir como guias úteis para determinar as posições das mutações. Como a eficiência da supressão e reticulação do âmbar pode variar consideravelmente, as mutações do âmbar devem ser introduzidas em várias posições. Além disso, como o Bpa é um análogo da tirosina e da fenilalanina, tente introduzir mutações âmbar em posições que normalmente codificam grandes aminoácidos hidrofóbicos para minimizar as perturbações da estrutura e função das proteínas. Finalmente, ao escolher um vetor de expressão, lembre-se de que a superprodução de uma proteína de interesse em um nível muito alto pode limitar a eficiência da incorporação de Bpa.

2. Preparação da cultura

1. Use eletroporação para transformar uma cepa apropriada de E. coli com um plasmídeo que codifica o sistema de supressão âmbar (pDULE-p Bpa; ver referência⁴) e um plasmídeo compatível que codifica a proteína de interesse com uma mutação âmbar.
2. Células em placas em ágar LB contendo antibióticos apropriados (use 5 μg/ml de tetraciclina para selecionar pDULE-p Bpa). Incubar as placas O/N a 37 °C.
3. No dia seguinte, iniciar as culturas O/N a partir de colónias únicas em 3-5 ml de meio M9¹⁴ contendo 0,2% de glicerol, todos os L-aminoácidos, exceto metionina e cisteína (40 μg/ml) e antibióticos. Incubar a 37 °C.
4. No dia seguinte, centrifugue culturas O/N a 2.500 x g por 5 min em RT para granular células. Ressuspender as células em 5 ml de meio M9 fresco e repetir a centrifugação.
   NOTA: Esta etapa de lavagem é crítica para manter os plasmídeos que codificam a resistência à ampicilina porque pequenas quantidades de b lactamase presentes no meio das culturas O/N degradam a ampicilina recém-adicionada antes que ocorra um crescimento celular significativo.
5. Ressuspender as células em 2 ml de meio fresco e medir a concentração celular num espectrofotómetro (OD₅₅₀).
6. Adicionar células a um frasco de Erlenmeyer de 250 ml contendo 50 ml de meio M9 e antibióticos a OD₅₅₀=0,03. Incubar as culturas a 37 °C em banho-maria agitado.

3. Incorporação de BPA e Preparação para Fotocrosslinking

NOTA: O protocolo descrito abaixo é para um curso de tempo de amostra que tem três pontos de tempo (0, 1 e 5 min). Ajuste os volumes de acordo se desejar um número diferente de pontos de tempo. Um esboço do procedimento é ilustrado na Figura 1.

1. Enquanto as culturas estão crescendo, prepare uma solução fresca de 1 M (1.000x) de Bpa em NaOH 1 M (27 mg de Bpa em 100 μl de NaOH 1 M). Use um tubo de paredes escuras para manter a solução no escuro.
2. Quando as culturas atingirem a fase inicial a intermediária (OD₅₅₀ = 0,2), adicione 50 μl 1 M Bpa a cada cultura. Adicione Bpa uma gota de cada vez enquanto gira o frasco para evitar precipitação. Em seguida, adicione quaisquer indutores necessários para impulsionar a expressão do mutante âmbar. Continue a incubar as culturas a 37 °C por mais 30 min.
3. Durante o período de indução de 30 minutos, rotule seis tubos de centrífuga descartáveis de 15 ml com o ponto de tempo (0 min, 1 min, 5 min) e "+ UV" ou "- UV". Coloque os tubos no gelo.
4. Encha um segundo balde de gelo com gelo e coloque uma placa de cultura de tecidos de 6 poços em cima do gelo.
5. Descongele a alta atividade específica (1.000 mCi / mmol) ³⁵S-metionina e ³⁵S-cisteína (ou uma mistura pré-fabricada dos dois compostos) para a marcação do pulso e prepare (ou descongele) uma solução de L-cisteína e L-metionina não radioativas (100 mM cada) para a perseguição.
6. Ligue a lâmpada UV cinco minutos antes da radiomarcação.
   NOTA: A lâmpada deve ser ajustável para que possa ser posicionada a ~3-4 cm das amostras na placa multipoços.
7. Adicione gelo (~ 2 ml) a cada tubo rotulado como "- UV" e a dois dos poços na placa multipoços.
   NOTA: O gelo deve ser adicionado a um terceiro poço imediatamente antes do ponto de tempo de 5 minutos. É essencial colocar gelo diretamente nos tubos e poços para interromper as reações intracelulares imediatamente em cada ponto de tempo e, assim, obter "instantâneos" precisos de uma via bioquímica específica.
8. No final do período de indução de 30 minutos, transferir 25 ml da cultura para um Erlenmeyer descartável de 125 ml pré-aquecido. Colocar o balão no banho-maria agitado a 37 °C.

4. Rotulagem de perseguição de pulso e irradiação UV

NOTA: O protocolo de rotulagem de perseguição de pulso e irradiação UV tem muitas etapas que devem ser executadas em tempo hábil e que exigem considerável organização e preparação antecipada. Todos os reagentes e tubos devem ser facilmente acessíveis. Um protocolo para um experimento que tem pontos de tempo de 0, 1 e 5 minutos é apresentado abaixo.

1. No momento 0:00 (min:seg), transferir 25 ml de cultura para um balão de 125 ml.
2. No tempo 0:30, adicionar 30 μCi/ml de aminoácidos radioactivos; agitar rapidamente para misturar. Colocar o balão no banho-maria agitado a 37 °C.
3. No tempo 1:00, adicionar 250 μl da solução de metionina-cisteína a 100 mM; agitar rapidamente para misturar.
   1. Pipetar imediatamente 4 ml da cultura para um dos alvéolos da placa multipoços refrigerada que contém gelo. Pipetar uma segunda alíquota de 4 ml para o tubo de 15 ml identificado como "0 min - UV". Volte a colocar o balão no banho-maria.
4. Às 2:00, pipetar 4 ml da cultura para o segundo poço da placa multipoços refrigerada que contém gelo. Pipetar mais uma alíquota de 4 ml para o tubo de 15 ml identificado como "1 min - UV". Voltar a colocar o balão no banho-maria.
5. Às 6:00, pipetar 4 ml da cultura para o terceiro poço da placa multipoços gelada que contém gelo. Pipetar outra alíquota de 4 ml para o tubo de 15 ml identificado como "5 min - UV".
6. Coloque o balde de gelo com a placa multipoços sob a lâmpada UV pré-aquecida e irradie cada amostra individualmente por 4 min.
   NOTA: Em experimentos em que os pontos de tempo são espaçados pelo menos 4 min, cada amostra deve ser irradiada assim que for pipetada na placa multipoços.
7. Transfira as células para os tubos refrigerados de 15 ml rotulados como "0 min + UV", 1 min + UV ", etc.
8. Centrifugue as células a 2.500 x g por 10 min a 4 °C.
9. Ressuspender cada amostra em 300 μl de meio M9 ou PBS e adicionar 33 μl de ácido tricloroacético (TCA) 100% frio para precipitar as proteínas. Centrifugue os precipitados de TCA em uma microcentrífuga em velocidade máxima por 10 min e remova o sobrenadante. Neste ponto, as amostras podem ser armazenadas a - 20 °C.

5. Imunoprecipitação e Detecção de Produtos de Reticulação

1. Adicione 50 μl de tampão de solubilização (15% de glicerol, 200 mM de Trisbase, 15 mM de EDTA, 4% de SDS, 2 mM de PMSF) a cada amostra e aqueça com agitação a 95 ° C por 5 min para solubilizar a proteína precipitada.
2. Adicione 1 ml de tampão de ensaio de radioimunoprecipitação (RIPA) (50 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCl, 1,0% Igepal CA-630, 0,5% desoxicolato, 0,1% SDS) e execute imunoprecipitações padrão¹⁵ usando um quinto a metade de cada amostra.
   NOTA: Igepal CA-630 (octilfenil-polietilenoglicol) é usado no lugar do NP-40, que não está mais disponível comercialmente. Os dois compostos são quimicamente indistinguíveis.
3. Resolva proteínas imunoprecipitadas por SDS-PAGE. Colora, desmancha e seca géis.
4. Exponha os géis a uma tela de fósforo O/N e detecte proteínas radioativas (incluindo produtos de reticulação) com um gerador de imagens de fósforo.

Resultados

Usamos fotoreticulação específica do local para identificar proteínas que interagem com EspP durante sua jornada para o MO. Nos experimentos mostrados aqui, os códons de fenilalanina nos resíduos 1113 e 1214 foram substituídos por códons âmbar. Ambas as posições estão localizadas no bdomínio, que se integra ao MO e serve como âncora de membrana. A estrutura cristalina do domínio EspPβ¹⁶ mostra que os dois resíduos estão no lado periplasmático do barril b, mas estão separados por ~ 120 ° (ver e...

Discussão

Este artigo descreve um método que combina fotoreticulação específica do local com marcação de perseguição de pulso para examinar a dinâmica das interações entre uma proteína de interesse e outros componentes de uma célula viva. O método é especialmente útil para estudar processos de várias etapas nos quais a proteína interage sequencialmente com outros fatores. Ao contrário das abordagens tradicionais de reticulação química, a fotoreticulação específica do local fornece informações detalhadas sobre o status de segmentos...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Kit de Mutagênese Dirigida ao Local QuikChange II	Agilent	200521
BPA (H-p-Bz-Phe-OH)	Bachem	F-2800
TRAN35S-LABEL, Reagente de Marcação Metabólica (35S-L-metionina e 35S-L-cisteína, >1.000 Ci/mmol)	MP Biomedicals	51006
Spectroline SB-100P Lâmpada UV de Intensidade Super-Alta, 365 nm	Spectroline SB-110P		Spectronics Corporation
100S	11-992-15		Spectronics Corporation
, 6 poços	Becton Dickinson	Labware 353046
Frasco Erlenmeyer Descartável	Corning	430421
Innova 3100 banho-maria agitado	Novo Brunswick Scientific	n.a.