Este relatório descreve uma técnica simples e rápida de punção intratecal para a transfecção localizada de siRNA na medula espinhal lombar em rato sob anestesia luz de curta duração.
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Artigo de método
In Vivo SiRNA transfecção e Gene Knockdown em Spinal Cord via rápida não invasiva lombar intratecal Injeções em Ratos
Neste artigo
Resumo
Resumo
Este relatório descreve um guia passo-a-passo para a técnica de injeção intratecal de agulhas agudas de forma não invasiva, ou seja, independente da implantação do cateter. A limitação técnica desta técnica cirúrgica encontra-se na delicadeza das mãos. A injeção é rápida, especialmente para um experimentador treinado, e desde rompimento do tecido com esta técnica é mínima, injeções repetidas são possíveis, além disso reação imune a ferramentas externas (. Eg cateter) não ocorre, dando assim uma melhor e mais específico LER de modulação da medula espinal. Uma vez que a aplicação da substância é essencialmente limitada à região alvo da medula espinal, as drogas não precisa de ser aplicado em grandes dosagens, e mais importante, os efeitos indesejados sobre outros tecidos, tal como observado com uma administração sistémica, pode ser contornado 1, 2. Além disso, combinar esta técnica com a transfecção in vivo de ácido nucleico, com a ajuda de polyethylenimine (PEI) de reagente 3, o qual proporciona uma enorme versatilidade para o estudo de funções da coluna vertebral através da administração de agentes farmacológicos, bem como do gene, RNA, e de moduladores de proteínas.
Introdução
A medula espinhal é um centro muito importante em uma variedade de processos biológicos fundamentais e as funções fisiológicas, incluindo o processamento e transmissão de dolorosas (nociceptivos) entradas 4-7. Foram desenvolvidas várias técnicas experimentais para facilitar a modulação farmacológica da medula espinal, tais como implantação crónica de cateteres intratecais 8, espinal medula microinjecção, e injecção intratecal de agulha 9. Cada técnica tem as suas próprias vantagens e desvantagens, e dependendo do paradigma experimental uma técnica podem ser mais adequados do que os outros. Considerando a implantação crônica de cateteres intratecal é facilmente viável em ratos, este método é muito difícil no mouse, dado as restrições de tamanho. A taxa de sucesso é muito baixo e os défices motores frequentemente ocorrer devido à presença de um volumoso cateter no espaço subdural severamente confinado no rato. Além disso, a entrega a longo prazo de drogas é processado devido a coagulação freqüentede cronicamente implantados cateteres. Finalmente, as reações imunológicas são comuns.
Estes problemas podem ser contornados utilizando o método de injecção intratecal aguda por meio de uma agulha, na ausência de um cateter preimplanted, o que permite uma aplicação rápida e anatomicamente limitado de medicamentos e reagentes para as medulas espinhais em ratinhos. Este método mantém totalmente os benefícios da entrega intratecal sobre outras vias de administração sistémica (por exemplo, oral, intravenosa, intraperitoneal, etc), tais como especificidade de modulação espinal, que permite doses reduzidas e limite de efeitos secundários, bem como a capacidade de fornecer substâncias não fazer normalmente não atravessam a barreira hematoencefálica, uma vez durante a injecção intratecal, a agulha é inserida entre a dura-máter e da medula espinhal. Importante, no entanto, em comparação com outros métodos de administração intratecal, o método de injecção intratecal agulha é o menos invasivos, permitindo numerosas aplicações namesmo animal, sem causar qualquer dano ao tecido considerável ou evocando reação imunológica devido à implantação de material estranho. No entanto, requer habilidades técnicas para uma segmentação muito preciso da agulha para permitir a eficácia.
Aqui, nós demonstrar visualmente o método para alcançar uma taxa ótima de sucesso para visando especificamente a medula espinhal lombar. O local de injecção que é escolhida nesta experiência é o sulco entre L5 e L6 coluna vertebrado, perto de onde a medula espinal termina, para minimizar a possibilidade de danificar a coluna. Além disso, demonstramos o uso desta técnica para derrubar genes na medula espinhal usando siRNAs.
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Protocolo
Todos os procedimentos de uso de animais estavam de acordo com as diretrizes éticas estabelecidas pelo órgão local (Regierungspräsidium Karlsruhe, Karlsruhe, Alemanha).
1. Preparação de siRNA / PEI Complexo
A solução complexa siRNA / PEI é preparada com as instruções do fabricante da seguinte forma:
- Solução A: Dilui-se a quantidade desejada de siRNA com água estéril (se necessário) até um quarto do volume final e diluir este ainda com solução de glicose a 10% até a metade do volume final. Vortex suavemente ou misture pipetando cima e para baixo. A quantidade ideal de siRNA precisa ser determinada empiricamente, mas 1 mg siRNA em 10 mL solução complexa por animal é um bom ponto de partida para a otimização.
- Solução B: Diluir o volume necessário de reagente PEI com água estéril até um quarto do volume final e diluir esta ainda mais com solução de glicose a 10% até a metade do volume final. Vortex gently ou misture pipetando cima e para baixo.
Nota: A quantidade de reagente de PEI determina o equilíbrio iónico no complexo, o que influencia a eficiência da transfecção. Do mesmo modo a quantidade óptima de solução de PEI tem que ser determinado empiricamente. Em nossas mãos, a quantidade ideal é de 0,12 ml de solução de PEI por 1 mg siRNA. - Misture a solução A com a solução B de uma só vez, vortex suavemente.
- Incubar a solução da mistura durante 15 min à temperatura ambiente antes da sua utilização. Este complexo é estável durante 2 horas à temperatura ambiente e durante 24 horas a 4 ° C.
2. Injeção intratecal
- Anestesiar o mouse com 3% de isoflurano, até que ele não mostra sinais de reflexo de endireitamento. Além disso, verificar a existência de cauda e / ou pata pitada reflexo para garantir ainda mais o estado de anestesia.
- Raspar a cerca de 2 cm 2 de pele na parte posterior do animal, perto da base da cauda, para facilitar uma melhor visualização durante a inserção da agulha.
- Coloque o mouse emum cone de nariz para uma administração contínua de isoflurano durante o procedimento, reduzir o isoflurano a 1,5%, e cobrir os olhos do rato com lubrificante ocular.
- Prepare o pronto para usar solução mista siRNA usando um 25 mL Hamilton seringa ligada a um 30 G 0,5 na agulha.
- Localize o processo espinhoso da L6, que deve ser um dos mais proeminentes e fixar a coluna de vertebrados em torno desta área, pressionando-o suavemente.
- Insira com cuidado a agulha entre o sulco de L5 e L6 vértebras e observar um movimento de cauda como este signo indica uma entrada bem sucedida da agulha no espaço intradural.
Dica: Usando unha, deve-se ser capaz de localizar o sulco também. - Depois da retirada da cauda é observada, de imediato, mas com cuidado, proteger a posição da agulha com uma mão e injetar o volume desejado de substância com a outra mão lentamente.
Dica: um volume entre 5-10 mL é o ideal como o volume de menos de 5 &# 181; l não é confiável e um volume maior que 10 ml leva a muita pressão. - Uma vez que a injeção é feita, mova o mouse de volta para a jaula para se recuperar da anestesia.
- Repetir esta injecção de, pelo menos, mais duas vezes a cada 24 horas para se conseguir a regulação negativa óptima do gene alvo.
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Resultados
A fim de ilustrar uma injecção bem sucedida, foi realizada utilizando a técnica rápida de corante verde FCF em adultos ratinhos C57Bl6 (8-10 semanas de idade). O animal foi deixado a recuperar durante alguns minutos após a injecção, para dar tempo suficiente para que o corante de espalhar e em seguida sacrificados com uma dose excessiva de CO2. Subsequentemente, a coluna foi dissecado vertebrado e a medula espinhal foi exposta. O puncta azul correspondente ao corante difusa, marcado no local da injecção. Nenh...
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Discussão
Assim, a técnica de injecções intratecais agulhas acima descrito é eficaz, rápida, especificamente localizada, e não destrutivos. Tecnicamente, o aspecto mais importante deste processo é o ponto de inserção da agulha para dentro da ranhura. É fundamental que este procedimento é feito com as mãos e paciência muito calmas. Como muitos procedimentos cirúrgicos, a formação melhora a taxa de injecção com sucesso. Isso também é importante porque durante um experimento real, esta técnica não fornece um indicador óbvio para con...
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Divulgações
Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| In Vivo-jetPEI | Polyplus | 201-10G | |
| WAVE1 siRNA | Santa Cruz | sc-36832 | |
| Controle siRNA-A | Santa Cruz | sc-37007 | |
| Anticorpo anti-tubulina III | Sigma | T2200 | |
| Anticorpo anti-WAVE1 | R& D Systems | AF5514 | |
| Corante verde rápido | Sigma | F-7252 | |
| Isoflurano | Baxter | ||
| Isoflurano configura | Drä ger Lü beck | ||
| Shaver | Wella | ||
| Seringa Hamilton Gastight 1702 | Hamilton | ||
| 30 G 1/2 in 13 mm Agulha | BD Microlance | 304000 | |
| Microscópio Leica MS5 | Leica | ||
| Primer direto WAVE1 para qRT-PCR | Sigma | cacagagcctcaggacagg | |
| WAVE1 primer reverso para qRT-PCR | Sigma | cttttcaccaacggcatctt | |
| FastStart Essential DNA Green Master | Roche | 6402712001 |
Referências
- Hylden, J. L., Wilcox, G. L. Intrathecal morphine in mice: a new technique. Eur. J. Pharmacol. 67, 313-316 (1980).
- Stokes, J. A., Corr, M., Yaksh, T. L. Transient tactile allodynia following intrathecal puncture in mouse: contributions of Toll-like receptor signaling. Neurosci. Lett. 504, 215-218 (2011).
- Goula, D., et al. Polyethylenimine-based intravenous delivery of transgenes to mouse lung. Gene Ther. , 1291-1295 (1998).
- Fairbanks, C. A. Spinal delivery of analgesics in experimental models of pain and analgesia. Adv. Drug. Deliv. Rev. 55, 1007-1041 (2003).
- Hohmann, A. G., Tsou, K., Walker, J. M. Cannabinoid modulation of wide dynamic range neurons in the lumbar dorsal horn of the rat by spinally administered WIN55,212-2. Neurosci. Lett. 257, 119-122 (1998).
- Song, Z. H., Takemori, A. E. Involvement of spinal kappa opioid receptors in the antinociception produced by intrathecally administered corticotropin-releasing factor in mice. J. Pharmacol. Exp. Ther. 254, 363-368 (1990).
- Trang, T., Sutak, M., Jhamandas, K. Involvement of cannabinoid (CB1)-receptors in the development and maintenance of opioid tolerance. Neuroscience. , 1275-1288 (2007).
- Yaksh, T. L., Rudy, T. A. Chronic catheterization of the spinal subarachnoid space. Physiol. Behav. 17, 1031-1036 (1976).
- Tappe, A., et al. Synaptic scaffolding protein Homer1a protects against chronic inflammatory pain. Nat. Med. , 677-681 (2006).
- Bourinet, E., et al. Silencing of the Cav3.2 T-type calcium channel gene in sensory neurons demonstrates its major role in nociception. EMBO J. 24, 315-324 (2005).
- Wang, X., et al. Gene transfer to dorsal root ganglia by intrathecal injection: effects on regeneration of peripheral nerves. Mol. Ther. 12, 314-320 (2005).
- Wigdor, S., Wilcox, G. L. Central and systemic morphine-induced antinociception in mice: contribution of descending serotonergic and noradrenergic pathways. J. Pharmacol. Exp. Ther. 242, 90-95 (1987).
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Reimpressões e permissões
