Um modelo murino de Spinal Cord Injury do colo do útero para o Estudo de pós-lesional respiratória Neuroplasticidade

Resumo

A insuficiência respiratória é a principal causa de morte na sequência de uma lesão medular cervical. Ter um modelo animal pré-clínico reprodutível, quantificáveis ​​e confiável de insuficiência respiratória induzida por uma lesão cervical parcial vai ajudar a entender a neuroplasticidade respiratório e não-respiratório posterior e permite testar estratégias de reparo putativos.

Resumo

A lesão da medula espinhal cervical induz a paralisia permanente, e muitas vezes leva a problemas respiratórios. Até o momento, não houve terapêutica eficientes foram desenvolvidos para melhorar / amenizar a insuficiência respiratória após alta lesão medular cervical (SCI). Aqui propomos um modelo pré-clínico murino de alta SCI na cervical 2 (C2) nível metamérica estudar diversificada neuroplasticidade respiratória pós-lesional. A técnica consiste numa lesão parcial cirúrgica ao nível C2, que irá induzir uma hemiparalisia do diafragma devido a uma deaferentação dos motoneurónios frênicas dos centros respiratórios localizados no tronco cerebral. O lado contralateral da lesão permanece intacta e permite a recuperação dos animais. Ao contrário de outros SIC que afetam a função locomotora (no tórax e nível lombar), a função respiratória não requer motivação animal e à quantificação do déficit / recuperação pode ser realizada facilmente (diafragma e gravação do nervo frênicos, ventilação de todo o corpo). Este modelo pré-clínico C2 SCI é um modelo pré-clínico poderoso, útil e confiável para estudar vários eventos neuroplasticidade respiratórios e não respiratórios em diferentes níveis (molecular) para a fisiologia e para testar diferentes estratégias terapêuticas putativos que possam melhorar a respiração em pacientes com LM.

Introdução

Trauma medular é uma lesão comum observada na população humana com incidências dramáticas, tais como paralisia permanente. No entanto, a gravidade da lesão depende do grau e da extensão do trauma inicial. A insuficiência respiratória é a principal causa de mortalidade após lesão medular cervical superior (SCI) ^1. Atualmente, o único tratamento terapêutico é colocar o paciente sob assistência ventilatória. Desde alguns pacientes podem ser desmamados a assistência ventilatória ^2, devido à recuperação espontânea que ocorre com atraso pós-lesional, a necessidade de desenvolver novas terapias não-invasivas inovadores é urgente ^3. Tendo um bom modelo pré-clínico normalizado para investigar o efeito de um SCI cervical em insuficiência respiratória e por isso, para estudar a aplicação de estratégias terapêuticas putativos, é essencial.

Neste artigo técnico, nós descrevemos um modelo murino pré-clínico o específicocomprometimento respiratório f induzida por um SCI cervical parcial no nível C2. Este modelo é usado atualmente por vários laboratórios ao redor do mundo (para comentários: ^4-13). No entanto, ligeiras diferenças de procedimento cirúrgico pode ser observada entre os diferentes pesquisadores para gerar este modelo murino lesão cervical particular. O efeito de um C2 SCI na saída respiratória foi descrita pela primeira vez em 1895 por Porter ^14. Uma hemisecção cervical induz uma deaferentação dos motoneurónios frênicas da sua unidade central (localizado no rVRG no tronco cerebral, Figura 1A) no lado ipsilateral de lesão, levando a uma actividade do nervo frénico e silenciosa, o diafragma posterior paralisia. O lado contralateral permanece intacta e que permite ao animal sobreviver. Ao contrário diferente SCI localizado num segmento da coluna vertebral inferior (por exemplo, uma lesão contundente ao nível C4 ^15), a integridade do núcleo de motoneurónios frénico em ambos os lados é preservada. Após um CERVlesão C2 iCal, alguma atividade espontânea pode ser observado no lado ipsilateral (frênico e diafragma), devido a uma ativação de vias sinápticas silenciosas contralateral que cruzaram a linha média da coluna vertebral ao nível segmentar C3-C6 (caminhos cruzados frênico, CPP, Figura 1B) . A ativação do CPP, que é, por definição, um hemissecção C2 combinada com uma phrenicotomy contralateral que induzir uma recuperação parcial do nervo frênico ipsilateral, pode ocorrer de horas a semanas pós-lesão ^16-18. O efeito benéfico real deste caminho CPP na recuperação respiratória é limitada ¹⁹ e mais investigação e tratamento devem ser desenvolvidos para melhorar a magnitude da recuperação espontânea ^3.

Este protocolo fornece um tipo poderoso de modelo murino pré-clínico para estudar a plasticidade pós-lesional respiratória em vários níveis (fisiologia respiratória de motoneurônios pré e frênico, interneurônios, molecular e cellular, a locomoção do membro dianteiro, por exemplo), bem como um modelo para testar as estratégias terapêuticas invasivas e não invasivas destinados a melhorar os sistemas respiratório e recuperação locomotora seguinte C2 lesão medular cervical parcial.

Protocolo

Este protocolo foi aprovado pelo comitê de ética da cadeira RBUCE-UP de Excelência (Universidade de Paris Sud, convenção de subvenção n º 246556) e da Université de Versailles Saint-Quentin-en-Yvelines.

1. Preparação de instrumentos cirúrgicos esterilizados

1. Limpe os instrumentos cirúrgicos com detergente de laboratório.
2. Autoclave os instrumentos antes da cirurgia.
3. Numa sessão cirúrgica, esterilizar as ferramentas, colocando as pontas de um esterilizador talão quente durante 10 minutos a 180 ° C entre as duas operações.

2. Preparação de Drogas

1. Prepare 2 x 1 ml seringas para drogas pré-anestésica drogas cocktail e pós-operação.
2. De acordo com o peso do rato, preparar uma seringa com medicamentos pré-anestésicos: carprofeno (5 mg / kg), buprenorfina (50 ug / kg), Baytril (5 mg / kg) e dexmedetomidina (0,5 mg / kg). Completar o volume para 1 ml com solução de Ringer.
3. Prepare-seuma outra seringa para a reversão das drogas pré-anestésicos: atipamezol (500 ug / kg).

3. Anestesia do Rato

1. Administrar por via subcutânea ao animal, a solução de drogas pré-anestésicos descritos no passo 2.2. Em seguida, coloque o animal de volta na gaiola e espere até que o efeito sedativo aparece.
2. Coloque o rato em uma câmara fechada preenchida com 5% de isoflurano em 100% O _2, e esperar até que o ritmo respiratório diminui (cerca de 30 seg.) Em seguida, retire o rato da câmara e coloque-a sobre a mesa de intubação.

4. Intubação orotraqueal

1. Deite o animal de costas, em seguida, segura a cabeça, colocando uma alça ligada a seus dentes da frente para a mesa.
2. Com uma luz de fibra óptica, iluminar o espaço torácico. Em seguida, coloque um laringoscópio (ou uma custom made ​​um, Jou et al. ²⁰ para mais detalhes) na boca do animal. Visualize as cordas vocais.
3. Deslizoue e colocar um guia orotraqueal na traqueia (entre as cordas vocais). Deslize o tubo orotraqueal (16 G tamanho do cateter) na guia.
4. Remover o guia e verificar com um espelho de laringe colocado na extremidade do tubo orotraqueal para a presença de humidade, o que confirma a posição apropriada do tubo na traqueia e não no esófago.
5. Ligar o tubo de um ventilador de roedor (683 roedor ventilador, Harvard Apparatus) e ajustar a concentração de isoflurano a 2% (em 100% _de O2).
6. Fixe o tubo orotraqueal com esparadrapo.

5. Cirurgia da Coluna Vertebral

1. Colocar o animal em decúbito ventral em uma placa cirúrgica aquecida, com o nariz apontando para ângulo de 90 ° com o cirurgião. Manter a temperatura do corpo de cerca de 37,5 ° C durante a cirurgia.
2. Raspar o cabelo com tesouras entre as escápulas e remover o cabelo com uma gaze.
3. Limpar a pele com betadine e em seguida com 70% de álcool. Repita este passo 3x.
4. Uma pitada do dedo do pé é realizada antes do início da cirurgia para garantir profundidade anestésica adequada.   Em seguida, faça uma incisão na pele rostro-caudal lateral com tesoura entre as escápulas.
5. Corte o músculo acromiotrapezius rostro-caudal, seguindo o tendão para evitar qualquer sangramento. Então dissociar o músculo rombóide para acessar os músculos spinalis (em torno da vértebra).
6. Recolha o músculo spinalis de C1 a C3 vértebra. A vértebra C2 é o único com uma apófise proeminente.
7. Limpe o músculo ao redor da parte dorsal da vértebra usando cotonetes estéreis.
8. Comece para remover cuidadosamente a apófise do C2 com um rongeur. Em seguida, continue meticulosamente até o dorsal da medula espinhal está exposto. Certifique-se que laminectomia é uma laminectomia hemi dorsal. Preste muita atenção para a dura-máter que envolve a medula espinhal e as artérias nas imediações da área.
9. Com # 55 fórceps, dissecar rostro-caudal da dura juntamente C2, ao lado continuam lateralmente de cada lado rostral e caudal.
10. Esponja o líquido cefalorraquidiano.
11. Faça uma secção lateral sob o número cervical da raiz dorsal 2 com a microtesoura. Verifique com um bisturi micro que a extensão da lesão é perto o suficiente para chegar à linha média da medula espinhal (ver Figura 2A para uma vista dorsal da lesão). Se não, então um outro corte pode ser feito para completar a lesão. Em caso de hemorragia, use cotonetes estéreis. Tenha cuidado para não ir para o lado contralateral, caso contrário, o animal não vai se recuperar da lesão e terá uma insuficiência respiratória.
12. Suturar os músculos como uma camada protetora e sutura de volta a pele. Limpe o ferimento com gaze esterilizada Betadine saturada.
13. Vire-off o vaporizador isoflurano e injetar as drogas Reversão (Atipamezole [500 mg / kg, im]), verifique a temperatura do corpo.
14. Quando o animal começa a respirar contra o ventilador,desconectar o tubo traqueal do ventilador, em seguida, remover o tubo orotraqueal. Colocar o animal numa gaiola aquecida para recuperação.

6. Cuidados pós-cirúrgica

Após a cirurgia, os animais são monitorados continuamente para garantir o melhor ambiente possível para a recuperação. Antibióticos (Baytril, 5 mg / kg), anti-inflamatório (Carprofeno, 5 mg / kg) e buprenorfina (50 ug / kg) as drogas são dadas a cada 12 horas durante os primeiros dois dias pós-cirurgia para evitar infecções e reduzir a ocorrência da dor pós-operatória. Os ratos têm acesso ad libitum ao alimento macio e água (ou água rebuçados em gel para o 1 º dia de pós-operatório). Fluídos subcutâneos pode ser usado para evitar a desidratação nos primeiros dias de pós-operatório. O peso corporal e a ingestão de alimentos são monitorizados diariamente. Seu ambiente é enriquecido ao longo da experiência e do tempo pós-lesão (dual habitação, tubos em suas gaiolas).

Resultados

Extensão da lesão

O sucesso ea reprodutibilidade deste modelo experimental específico dependem da experiência de cada manipulador / cirurgião. A quantidade subseqüente de recuperação respiratória (atividade do nervo frênico e atividade do diafragma), após uma lesão no C2 está correlacionada com o restante ventrolateral poupado substância branca ^21. Uma vez que a lesão é "handmade" e requer um pouco de prática do cirurgião, a extensão de cada lesão tem de...

Discussão

Dificuldades técnicas de fazer o ferimento Modelo C2

O modelo murino lesão C2 é uma ferramenta interessante para estudar respiratória neuroplasticidade pós-lesional. No entanto, os passos necessários para produzir um modelo reproduzível e confiável são numerosos e cada um pode ter um impacto sobre o resultado do estudo. Por exemplo, durante o processo de intubação, o maior cuidado deve ser tomado uma vez que o tubo orotraqueal pode produzir uma inflamação da traqueia, que po...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Animal
Macho Sprague Dawley Rat	Janvier		225-250 g
Instrumentos Cirúrgicos
Student Dumont #5 fórceps	Ferramenta de Ciências Finas	91150-20
Estudantes		91100-12
Mayo-Stille Tesoura	Fine Science Tool	14013-15
Curvado Estudante Vannas Spring Scissors	Fine Science	91500-09	Tesoura de
Mola Reta - Lâminas de 8 mm	Fine Science Tool	15025-10	Reta Blunt/Blunt
Friedman Pearson Rongeur	Fine Science Tool	16121-14
Faca de Dissecção Curva - Fine Tip	Fine Science Tool	10055-12	Ferramenta de
Ciência Fina	de Suporte de Agulha Olsen-Hegar	12002-14	Afastador
Weitlaner-Locktite	Ferramenta de Ciência Fina	17012-11	2x3 Suturas cirúrgicas absorvíveis sem corte
	Centravet	BYO001	Tamanho da sutura 4-0
Equipment
Hot Bead Steriliser	Fine Science Cateter Tool	18000-45
	Centravet	CAT188	16 G
Laringoscópio
Fio
Espelho laríngeo	Centravet	MIR011
Ringers com lactato	Centravet	RIN020
Seringa	Centravet
Agulha	Centravet
O2	Air Liquid	I1001M20R2A001
683 Ventilador RodentT 115/230V	Harvard Apparatus	55-0000
Vaporizador autônomo	WPI	EZ-155
Cama aquecida de linha fina	WPI	EZ-211
Recipiente de ar	WPI	EZ-258
Drugs
Carprofeno	Centravet
Rimadyl	Centravet	RIM011
Buprenorfina	Centravet	BUP001
Baytril	Centravet	BAY001
Dexmedetomidina	Centravet	DEX010
Atipamezol	Centravet	ANT201
Solução	de BetadineCentravet	VET002
Isoflurano	Centravet	VET066

Ferramenta de Ciências Finas Padrão para Tool Reta Serrilhado guia