Imagem Através do Pupal Caso de<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Resumo

Este trabalho demonstra o uso de um microscópio confocal de varredura rápida para o comportamento das células de imagem diretamente através do pupário. Ao deixar o caso de pupa intacto, este método permite a observação e medição de processos celulares dinâmicos numa fase de desenvolvimento de Drosophila que é difícil de estudar directamente.

Resumo

A utilização prolongada de Drosophila como modelo para a biologia celular e de desenvolvimento produziu um conjunto de ferramentas. Em conjunto, estas técnicas têm permitido a análise de células e biologia do desenvolvimento de uma variedade de ângulos metodológicas. Imagens ao vivo é um método emergente para a observação de processos celulares dinâmicos, como a divisão celular ou motilidade celular. Tendo mutações em proteínas isoladas do ciclo celular putativos descaracterizados se tornou essencial para observar a mitose in situ usando imagens ao vivo. A maioria dos estudos de imagem ao vivo em Drosophila têm-se centrado sobre os estágios embrionários que são acessíveis à manipulação e observação por causa de seu pequeno tamanho e claridade óptica. No entanto, nestas fases do ciclo celular é incomum em que falta uma ou ambas as fases gap. Em contraste, as células da asa pupal de Drosophila têm um ciclo celular comum e passam por um período de mitose rápido que mede cerca de 20 horas de desenvolvimento de pupas. É fácil de identify e isolar pupas do palco apropriado para pegar mitose in situ. Montagem pupas intactas a melhor combinação de tratabilidade e durabilidade durante o exame, permitindo experiências de correr por várias horas com um impacto mínimo sobre a viabilidade celular e animal. O método permite a observação de estruturas tão pequenas quanto, ou menor do que, cromossomas voar. Ajuste das definições de microscópio e os detalhes de montagem, permitiu extensão da preparação para visualizar a dinâmica da membrana de células adjacentes e as proteínas marcadas com fluorescência, tais como a tubulina. Este método funciona para todas as proteínas fluorescentes testados e podem captar recursos escala submicrométricas sobre uma variedade de escalas de tempo. Embora limitado ao exterior 20 mM de pupa com um microscópio confocal convencional, esta abordagem para observar proteína e dinâmica celular em tecidos pupa in vivo podem ser geralmente úteis para o estudo da biologia celular e de desenvolvimento nestes tecidos.

Introdução

A mosca do vinagre, Drosophila melanogaster, é um modelo bem estabelecido para o estudo de vários aspectos da biologia. Pesquisa Drosophila tem uma história rica de experiências genéticas que permite formas sofisticadas de manipulação genética, incluindo expressão, knockdown e mutação. Com o advento de rótulos de proteína fluorescente, este repertório foi expandido para incluir estudos de células e proteínas em animais vivos. O embrião da mosca é um excelente sistema para tais estudos, pois é pequeno e opticamente clara permitindo profunda, de alta resolução de imagem in vivo ^1-3. Outros estágios de desenvolvimento da mosca....

Protocolo

1. Voar Trabalho

1. Manter moscas em meio padrão fubá-ágar-melaço de levedura à temperatura ambiente ^10.
2. Para cruzes, isolar virgens dentro de 6 horas de eclosão. Depois de atravessar a machos do genótipo desejado, mudança voa para novos frascos a cada 3-4 dias.

Nota: Para estas experiências, linha Gal4 A9 foi usado para conduzir a expressão de transgenes na asa. Fly ações podem ser obtidos a partir do centro de estoque em Bloomington. Ações usadas nestes experimentos incluem A9-Gal4 (Bl # 8761), His2Av-GFP (Bl # 5941), Sco / cyo HsCre (Bl # 1092), UAS-ChRFP-Tub (Bl # 25773), lollibow ^11.

....

Resultados

As células em epitélio pseudo, tais como o olho de Drosophila em desenvolvimento, ou a camada do ventrículo do sistema nervoso central em desenvolvimento de vertebrados, são submetidos a movimentos nucleares, denominado migração nuclear interkinetic, no tempo, com o ciclo celular. A replicação do ADN ocorre quando os núcleos são em ou perto da superfície da célula basal e introduzir a mitose quando os núcleos de atingir a superfície apical ^15,16. As células asa pupa formar um epitélio monocamada divi.......

Discussão

Para visualizar, medir e quantificar características de células em divisão, necessário o desenvolvimento de uma preparação simples para a observação de mitose na ala de pupa vivo de Drosophila por meio de análise confocal de His2AvGFP expressando células. Este método foi utilizado para demonstrar que o ciclo celular na asa de pupa tem semelhanças fortes para célula no epitélio pseudo ciclos em que se movem os núcleos para a superfície apical do epitélio, onde eles entram em mitose. Após telófase, núcleos cair d.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Fly stuff fly pad	Genesee Scientific	59-114	para anestesia de moscas
CO2 gás	Airgas South	CD50	Para anestesia de moscas
Regulador	Airgas South		CO2 regulador
Frascos para moscas	Genesee Scientific	32-113RLBF	Cultura
de moscasDrosophila linhas:A9-Gal4 (Bl#8761), His2Av-GFP (Bl#5941), Sco/CyO HsCre (Bl#1092), UAS-ChRFP-Tub (Bl#25773)	Bloomington Stock Center
Pratos com fundo de vidro #1 1/2	WillCo Wells BV		Para microscopia
Tiodietilenoglicol	Fluka	88559	mountant
	de arte	em argila de modelagem	Suporte para posicionar pupas contra
Pincéis	loja		Para manipular moscas
Pinças Finas, Inox #5	Ferramentas de Belas Ciências	11252-20	Dumont #5
computador	qualquer		8 Gb RAM para análise de imagem/filme
Software		Software de análise de imagem http://fiji.sc/Fiji	de análise de imagem
Microscópio			Qualquer confocal de varredura rápida deve ser suficiente
20X seco e 40X ou 63X lentes de imersão em óleo	qualquer		Para imagens de tecidos
, celulares e recursos subcelularesÓleo de imersão (não fluorescente)
Estereomicroscópio	qualquer		Para manipulação de moscas

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