Este trabalho demonstra o uso de um microscópio confocal de varredura rápida para o comportamento das células de imagem diretamente através do pupário. Ao deixar o caso de pupa intacto, este método permite a observação e medição de processos celulares dinâmicos numa fase de desenvolvimento de Drosophila que é difícil de estudar directamente.
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Resumo
Resumo
A utilização prolongada de Drosophila como modelo para a biologia celular e de desenvolvimento produziu um conjunto de ferramentas. Em conjunto, estas técnicas têm permitido a análise de células e biologia do desenvolvimento de uma variedade de ângulos metodológicas. Imagens ao vivo é um método emergente para a observação de processos celulares dinâmicos, como a divisão celular ou motilidade celular. Tendo mutações em proteínas isoladas do ciclo celular putativos descaracterizados se tornou essencial para observar a mitose in situ usando imagens ao vivo. A maioria dos estudos de imagem ao vivo em Drosophila têm-se centrado sobre os estágios embrionários que são acessíveis à manipulação e observação por causa de seu pequeno tamanho e claridade óptica. No entanto, nestas fases do ciclo celular é incomum em que falta uma ou ambas as fases gap. Em contraste, as células da asa pupal de Drosophila têm um ciclo celular comum e passam por um período de mitose rápido que mede cerca de 20 horas de desenvolvimento de pupas. É fácil de identify e isolar pupas do palco apropriado para pegar mitose in situ. Montagem pupas intactas a melhor combinação de tratabilidade e durabilidade durante o exame, permitindo experiências de correr por várias horas com um impacto mínimo sobre a viabilidade celular e animal. O método permite a observação de estruturas tão pequenas quanto, ou menor do que, cromossomas voar. Ajuste das definições de microscópio e os detalhes de montagem, permitiu extensão da preparação para visualizar a dinâmica da membrana de células adjacentes e as proteínas marcadas com fluorescência, tais como a tubulina. Este método funciona para todas as proteínas fluorescentes testados e podem captar recursos escala submicrométricas sobre uma variedade de escalas de tempo. Embora limitado ao exterior 20 mM de pupa com um microscópio confocal convencional, esta abordagem para observar proteína e dinâmica celular em tecidos pupa in vivo podem ser geralmente úteis para o estudo da biologia celular e de desenvolvimento nestes tecidos.
Introdução
A mosca do vinagre, Drosophila melanogaster, é um modelo bem estabelecido para o estudo de vários aspectos da biologia. Pesquisa Drosophila tem uma história rica de experiências genéticas que permite formas sofisticadas de manipulação genética, incluindo expressão, knockdown e mutação. Com o advento de rótulos de proteína fluorescente, este repertório foi expandido para incluir estudos de células e proteínas em animais vivos. O embrião da mosca é um excelente sistema para tais estudos, pois é pequeno e opticamente clara permitindo profunda, de alta resolução de imagem in vivo 1-3. Outros estágios de desenvolvimento da mosca provaram ser menos tratável, exigindo anestesia 4, dissecção e cultura de curto prazo de 5,6, ou a criação de janelas na cutícula para imagens 7,8. Estas manipulações geralmente comprometer o desenvolvimento dos animais no longo prazo ou afectar o animal de modo a limitar de imagem para períodos curtos.
ent "> Para estudar novas mutações em genes que se assemelham a reguladores do ciclo celular, é essencial para encontrar uma preparação adequada para estudar o tempo e a fidelidade do ciclo celular. Como a maioria dos ciclos de células embrionárias são truncados (SM ou S-G2-M) e os mutantes em estudo não apresentam defeitos, até estágios mais avançados, foi importante para observar o ciclo celular em tecidos fase de pupa. células epiteliais na pupa tem um ciclo mais típico celular G1-S-G2-M e pupas desta fase são não é capaz de movimentos musculares 9. O ponto de partida inicial para manipulações incluído todo intacta pupas expressando Histone2AV-GFP. Apesar da opacidade aparente do processo de pupa, esta preparação intacta mostrou ser excelente para a longo prazo in vivo de imagens. Essa técnica é simples o suficiente para que pesquisadores de graduação rotineiramente usá-lo para estudar aspectos da biologia celular e de desenvolvimento em Drosophila e ainda a resolução é bom o suficiente para permitir a discriminação de recursos em escala micrométrica. Com este método, as observações dos eventos mais horas, minutos ou segundos são possíveis simplesmente ajustando os parâmetros de séries temporais. Vídeos usando o azul, proteínas fluorescentes verde, amarelo, laranja e vermelho, ou combinações destes, foram feitas. Mais importante, se o cuidado de minimizar a intensidade do laser, mesmo a longo prazo de imagem não tem nenhum efeito sobre o desenvolvimento ou a viabilidade dos animais.Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
1. Voar Trabalho
- Manter moscas em meio padrão fubá-ágar-melaço de levedura à temperatura ambiente 10.
- Para cruzes, isolar virgens dentro de 6 horas de eclosão. Depois de atravessar a machos do genótipo desejado, mudança voa para novos frascos a cada 3-4 dias.
Nota: Para estas experiências, linha Gal4 A9 foi usado para conduzir a expressão de transgenes na asa. Fly ações podem ser obtidos a partir do centro de estoque em Bloomington. Ações usadas nestes experimentos incluem A9-Gal4 (Bl # 8761), His2Av-GFP (Bl # 5941), Sco / cyo HsCre (Bl # 1092), UAS-ChRFP-Tub (Bl # 25773), lollibow 11.
2. Seleção e montagem de pupas
- Estágio de pupa, quer por coletá-los como prepupas branco (WPP) e mantê-los a 25 ° C até atingirem a idade apropriada ou usando critérios morfológicos 12.
- Para observar divisões celulares, selecione pupa que passaram recentemente por cabeça eversão.A partir deste momento até pouco antes da eclosão (em> 96 h), pupas são imóveis permitindo a observação prolongada de lapso de tempo.
- Remover pupas dos frascos pelo primeiro tocá-los com um pincel umedecido em água, à espera de um minuto para permitir que a água para soltar o adesivo e em seguida, delicadamente estimulando-os para o pincel.
- Delicadamente, lave pupas selecionados por cutucando-os com um pincel em água para remover as salivares adesivas glândula e partículas de alimento.
- Transferir pupas limpa para um prato de 25 milímetros Petri com um fundo de lamela (número 1 ½ lamelas).
- Usando tiras finas de massa de modelar ou cera dental ou como um suporte, montar pupas de modo que o tecido de interesse está mais próximo da lamela.
Nota: Nos estudos aqui descritos, foram observados asas, pernas, pupa histoblasts abdominais ou notum dorsal. Na prática, todo o tecido dentro de 20 mM da superfície da caixa de pupa é observável. - Pupas Oriente com cuidado para que o tissue de interesse é paralela à superfície da lamela de vidro.
- Uma vez pupas são montados, usar um pincel para transferir uma camada fina de tiodietilenoglicol (TDG) para o espaço entre a pupa e a lamela.
Nota: TDG reduz a dispersão de superfície, corresponde ao índice de refração do óleo, e permite que o oxigênio a permear o tecido 13. O uso de óleos não é recomendado, já que tendem a privar os tecidos de oxigênio, causando a cessação rápida de comportamentos celulares.
3. Imagem
Nota: Para imagens, um microscópio confocal é provável que seja essencial que o confocalidade remove a maior parte do fundo obscurecimento causada por iluminação intensa do processo de pupas.
- Ajuste as configurações do confocal para minimizar o impacto da iluminação no desenvolvimento de pupas e viabilidade. Para isso, encontrar um equilíbrio entre a intensidade da excitação e da sensibilidade da coleta. Uma configuração típica para wi imagiologiaª a Leica SP5 utilizado o scanner de ressonância (8.000 Hz), potência do laser ajustado para 2% (10% de transmitância de 20% de energia), conjunto de pinhole a 120 micrômetros, linha Média definida a 8. Definições irá variar, dependendo das condições experimentais.
Nota: Para resolver escala fina apresenta 40X e 63X lentes de imersão em óleo (até 0,1 mm de distância de trabalho) também têm sido utilizados com sucesso neste método, apesar de limitar a profundidade de foco.
4. Análise
Para analisar quadros, z-pilhas ou filmes importar os arquivos de dados para FIJI, que tem ferramentas eficazes para a visualização, medição e modificar arquivos para apresentação 14. Por exemplo tempo para concluir a mitose foi medido utilizando o intervalo de amostragem e navegador de imagem multidimensional para percorrer quadros, enquanto observa uma célula de prófase para telophase. x, y, e z, as dimensões podem ser medidos utilizando a ferramenta de medição. Para instruções detalhadas sobre o software e seu usover: http://fiji.sc/Fiji.
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Resultados
As células em epitélio pseudo, tais como o olho de Drosophila em desenvolvimento, ou a camada do ventrículo do sistema nervoso central em desenvolvimento de vertebrados, são submetidos a movimentos nucleares, denominado migração nuclear interkinetic, no tempo, com o ciclo celular. A replicação do ADN ocorre quando os núcleos são em ou perto da superfície da célula basal e introduzir a mitose quando os núcleos de atingir a superfície apical 15,16. As células asa pupa formar um epitélio monocamada divi...
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Discussão
Para visualizar, medir e quantificar características de células em divisão, necessário o desenvolvimento de uma preparação simples para a observação de mitose na ala de pupa vivo de Drosophila por meio de análise confocal de His2AvGFP expressando células. Este método foi utilizado para demonstrar que o ciclo celular na asa de pupa tem semelhanças fortes para célula no epitélio pseudo ciclos em que se movem os núcleos para a superfície apical do epitélio, onde eles entram em mitose. Após telófase, núcleos cair d...
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Os autores gostariam de agradecer Akira Chiba para apoio intelectual, apoio material, e ações. Graças à Julia Dallman para comentários.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Fly stuff fly pad | Genesee Scientific | 59-114 | para anestesia de moscas |
| CO2 gás | Airgas South | CD50 | Para anestesia de moscas |
| Regulador | Airgas South | CO2 regulador | |
| Frascos para moscas | Genesee Scientific | 32-113RLBF | Cultura |
| de moscasDrosophila linhas:A9-Gal4 (Bl#8761), His2Av-GFP (Bl#5941), Sco/CyO HsCre (Bl#1092), UAS-ChRFP-Tub (Bl#25773) | Bloomington Stock Center | ||
| Pratos com fundo de vidro #1 1/2 | WillCo Wells BV | Para microscopia | |
| Tiodietilenoglicol | Fluka | 88559 | mountant |
| de arte | em argila de modelagem | Suporte para posicionar pupas contra | |
| Pincéis | loja | Para manipular moscas | |
| Pinças Finas, Inox #5 | Ferramentas de Belas Ciências | 11252-20 | Dumont #5 |
| computador | qualquer | 8 Gb RAM para análise de imagem/filme | |
| Software | Software de análise de imagem http://fiji.sc/Fiji | de análise de imagem | |
| Microscópio | Qualquer confocal de varredura rápida deve ser suficiente | ||
| 20X seco e 40X ou 63X lentes de imersão em óleo | qualquer | Para imagens de tecidos | |
| , celulares e recursos subcelularesÓleo de imersão (não fluorescente) | |||
| Estereomicroscópio | qualquer | Para manipulação de moscas |
Referências
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Reimpressões e permissões
