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Summary

Tráfico de membrana neuronal controla dinamicamente membrana disponibilidade de proteína plasmática e significativamente impactos neurotransmissão. Até à data, tem sido um desafio para medir tráfico endocítico neuronal em neurônios adultos. Aqui, descrevemos um método altamente eficaz, quantitativo para medir as mudanças rápidas na expressão de proteínas de superfície ex vivo em fatias cerebrais agudas.

Abstract

Tráfico endocítico Regulamentado é o mecanismo central facilitar uma variedade de eventos neuromoduladores, controlando dinamicamente receptor, canal iônico, e transportador de apresentação da superfície celular em uma escala minutos tempo. Há uma grande diversidade de mecanismos que controlam o tráfico endocítica de proteínas individuais. Estudos que investigam as bases moleculares do tráfico têm dependido principalmente sobre biotinilaï superfície para medir quantitativamente mudanças na proteína da membrana expressão de superfície em resposta a estímulos exógenos e manipulação genética. No entanto, esta abordagem tem sido limitado principalmente para cultura de células, o que pode não refletir fielmente os mecanismos fisiologicamente relevantes em jogo em neurônios adultos. Além disso, as abordagens de células cultivadas podem subestimar as diferenças específicas da região em mecanismos de tráfico. Aqui, descrevemos uma abordagem que se estende biotinilaï superfície celular para a preparação fatia cerebral aguda. Nósdemonstrar que este método fornece uma abordagem de alta fidelidade para medir rápidas mudanças nos níveis de superfície de proteínas de membrana em neurônios adultos. Esta abordagem é provável que tenha ampla utilidade no domínio do tráfico de endocítico neuronal.

Introduction

Tráfico endocítico é um mecanismo celular ubíquo que ajusta a apresentação da membrana plasmática de uma variedade de proteínas de membrana integrais. Endocitose fornece nutrientes vitais para o ambiente intracelular e ^um dessensibiliza a sinalização do receptor em resposta à activação do receptor ^2. Endocítica reciclagem de volta para a membrana plasmática pode adicionalmente melhorar a sinalização celular, aumentando os níveis de expressão de proteínas na superfície da célula ^3. Além disso, as perturbações de tráfico de membrana estão implicados em inúmeras doenças e condições patológicas ^4,5, salientando a necessidade de investigar os mecanismos moleculares que governam proteína tráfico endocítica. Embora muitas proteínas utilizar mecanismos de internalização clássicos dependente de clatrina, a evidência de montagem ao longo dos últimos anos demonstra que vários mecanismos de endocitose independente de clatrina governar o potencial endocítica de uma crescente variedade deproteínas de ^6,7. Assim, a necessidade de investigar os mecanismos de endocitose que facilitam o tráfico de sistemas relevantes fisiológicas tem crescido consideravelmente.

No cérebro, o tráfico de endocitose de receptores, canais iônicos e transportadores de neurotransmissores tem um papel primordial no estabelecimento de plasticidade sináptica ^8-11 e resposta a drogas de abuso ^12-15, em última análise, que impactam a excitabilidade neuronal e respostas sinápticas. Até à data, a maioria dos estudos de tráfico neuronal dependem tanto sistemas de expressão heterólogos ou neurônios primários em cultura, nenhum dos quais pode refletir de forma confiável mecanismos em jogo em neurônios adultos. Aqui, apresentamos uma abordagem que usa biotinilaï superfície para medir quantitativamente os níveis da proteína de superfície em fatias cerebrais agudas derivadas de roedores adultos. Usando essa abordagem, apresentamos dados que demonstram que o mouse do transportador de dopamina no estriado internaliza rapidamente em reposta de forbol de éster mediada por proteína-quinase C (PKC) a activação.

Protocol

Todo o manuseio de animais e colheita de tecidos foi efetuada de acordo com as diretrizes da Universidade do Institutional Animal Care Massachusetts Medical School Comitê de Uso (IACUC), seguindo o protocolo de número A1506 aprovado (Melikian, PI).

Soluções necessárias

Artificial líquido cefalorraquidiano (ACSF) – Faça fresco diariamente

NaCl 125 mM, KCl 2,5 mM, 1,2 mM de NaH ₂ PO _4, 1,2 mM de _MgCl2, 2,4 mM de _CaCl2, 26 mM de NaHCO _3, e 11 mM de glicose

Nota: Preparar ACSF como uma solução estoque de 10x, com exclusão de _NaHCO3 e glicose. Faça soluções de trabalho 1x diariamente a partir do estoque de 10x, completando com fresco glicose _NaHCO3 e.

Suplementados com sacarose ACSF (SACSF) – Faça fresco diariamente

250 mM sucessoaumentou, KCl 2,5 mM, 1,2 mM de NaH ₂ PO _4, 1,2 mM de _MgCl2, 2,4 mM de _CaCl2, 26 mM de NaHCO _3, e 11 mM de glucose

Nota: Preparar SACSF como uma solução estoque de 10x, com exclusão de _NaHCO3 e glicose. Faça soluções de trabalho 1x diariamente a partir do estoque de 10x, completando com fresco glicose _NaHCO3 e.

Sulfo-N-hydroxysuccinyl-SS-Biotina (sulfo-NHS-SS-biotina, Pierce Chemical Company)

As soluções de reserva deve ser de 200 mg / ml em DMSO e são resistentes a múltiplos ciclos de congelação / descongelação. Alíquotas são armazenadas a -20 ° C. O éster succinilo é rapidamente hidrolisado em solução aquosa, pelo que as soluções de trabalho deve ser preparado imediatamente antes de aplicar a fatias.

Fatia Solução Quench

ACSF suplementado com 100 mM de glicina

A lise RIPA Buffer

10 mM Tris, pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 1,0 mM, 1% Triton-X-100, 0,1% SDS, 1% de desoxicolato de Na

RIPA com Inibidores da Protease (RIPA / PI) – Faça fresco diariamente

RIPA suplementado com 1 fiM de leupeptina, 1 jiM de pepstatina, 1 uM de aprotinina, e 1 mM de fluoreto de fenilmetil sulfonilo.

1. Prepare fatias cerebrais

1. Faça SACSF 1x fresco e 1x ACSF
2. Refrigerar SACSF em gelo num copo pequeno. Isto irá ser utilizado para segurar o cérebro do rato recém-colhido.
3. Saturar o ACSF e SACSF com oxigénio fazendo borbulhar com 95% / 5% de O ₂ / CO _2, 20 min em gelo.
4. P30-38 ratinhos devem ser usadas para a viabilidade do tecido óptima. Sacrifício de animais por deslocamento cervical e decapitação, e remover rapidamente os cérebros em pré-arrefecido, SACSF oxigenado.
5. Usando um micrótomo vibrando, fazer 300 seções mM cerebrais na região de interesse.
6. Se desejar, fatias pode ser ainda mais dissecado anterior à recuperação de enriquecer para regiões cerebrais particulares ou direito distinto e hemisférios esquerdo para usar como controle e fatias experimentais, respectivamente.
7. Usando uma pipeta Pasteur polida-fogo, transfira as fatias de malha de fundo câmaras definidas em placas de 24 poços.
8. Permitir fatias a recuperar durante 40 min, 31 ° C em ACSF oxigenado, com contínua, borbulhamento suave.

2. Tratamento de Drogas (se for o caso) e Slice Biotinilação

1. Após a recuperação, lavagem 3x em fatias pré-aquecido (37 ° C), oxigenado ACSF borbulhar constantemente com 95% / 5% de O ₂ / CO _2.
2. Adicionar os compostos de teste e incuba-se com oxigenação constante.
   1. Por conveniência, adicionar um ^1/10 de volume de 10x droga concentrada e misturar invertendo suavemente.
   2. Agitar suavemente as placas num banho de água à temperatura desejada.
3. Após o tratamento de drogas, rapidamentefatias frio por lavar 3x no gelo ACSF frio.

3. Proteínas de superfície biotinilar

1. Prepare a 1,0 mg / ml de sulfo-NHS-SS-biotina em gelo ACSF frio imediatamente antes da marcação.
2. Adicionar 0,75 ml sulfo-NHS-SS-biotina para fatias e fatias incubar no gelo, 45 min.
3. Lave as fatias três vezes rapidamente com o frio do gelo ACSF, em seguida, incubar por 10 min no gelo ACSF frio no gelo.
4. Lave as fatias três vezes com tampão de fatia de têmpera gelada e incubar com 0,75 ml de tampão de têmpera fatia duas vezes, 25 min, no gelo para saciar livre sulfo-NHS-SS-biotina.

4. Prepare Lysates Tecido

1. Lavar as fatias de três vezes em gelo ACSF gelado e transferir cada fatia para um tubo de microcentrífuga utilizando uma pipeta de Pasteur polidas ao fogo.
2. Gentilmente pelota fatia por centrifugação de 200 xg, 1 min e ACSF cuidadosamente aspirado restante.
3. Adicionar 400 mL de gelo frio RIPA / PI e romper o tecido pipetando cima e para baixo uma vez através de um pip P200ette.
4. Transferência dissociado fatia / RIPA para um novo tubo e incubar 30 min, 4 ° C, em rotação, para completar a lise.
5. Sedimentar os detritos celulares por centrifugação, 18.000 xg, 15 min, 4 ° C.
6. Determinar a concentração de proteína de lisado usando o ensaio de proteína BCA, com albumina de soro bovino (BSA) como padrão.

5. Isolar Biotinylated Proteínas

1. Otimizar relação proteína do grânulo / total.
   Nota: os níveis de expressão de proteínas individuais podem variar muito entre diferentes regiões cerebrais. A não ser que toda a proteína biotinilada de uma dada quantidade de tecido ligado é capturado, não é possível detectar com precisão todas as mudanças potenciais na expressão à superfície. Portanto, é imperativo para determinar empiricamente a relação ideal talão / total de proteína para uma determinada região de proteína / cérebro antes de embarcar em um novo estudo fatia biotinilaï.
   1. Incubar 25 ul estreptavidina-agarose com uma quantidade cada vez maiors de lisado de tecido (intervalo aproximado de 25-200 mg), e em seguida, proceder conforme descrito a seguir para a ligação, lavagem e eluição passos.
   2. Quantificar as bandas imunorreactivas resultantes e escolher um rácio de grânulo / lisado na gama linear de ligação que irá permitir a quantificação exacta de qualquer aumento ou diminuição da expressão da proteína de superfície.
2. Preparar contas de estreptavidina-agarose
   1. Determinar o volume total talão necessário para todas as amostras. Prepare um volume talão suficiente para que a quantidade mais um extra (ou seja, 4 amostras de 25 mL / amostra = 100 contas ul + um extra = 125 contas mL.
   2. Vortex Streptavidin estoque talão e pipeta fora desejado volume. Se for utilizada uma pipeta de P200, cortar a extremidade da ponta para impedir o bloqueio ou grânulo danos.
   3. Lave contas 3 vezes em 0,5-1,0 ml RIPA / PI para remover conservantes, vórtex após cada adição RIPA e coleta de contas entre lavagens por centrifugação 18.000 xg, 1 min, na sala de temperamentoature.
   4. Aspirar fora tampão entre lavagens utilizando uma pipeta de Pasteur de vidro ligada a um frasco de vácuo. Uma dica P200 plástico preso à extremidade da pipeta Pasteur de vidro proporciona um controle mais preciso quando aspiração. Não é necessário remover completamente todo o tampão para as duas primeiras lavagens, uma vez que os riscos de aspiração grânulos para a pipeta. Após a lavagem final, remover tanto excesso de tampão quanto possível sem aspirar os grânulos.
   5. Adicionar RIPA / PI para trazer contas de volta ao seu volume original, pipetando para cima e para baixo para voltar a suspender. Evitar vórtice nesse ponto, como grânulos vão ficar à parede do tubo.
   6. Contas Alíquota em microtubos usando um P200 com a ponta cortada. Pipeta cima e para baixo várias vezes entre a amostragem para garantir contas permanecem uniformemente suspenso e disperso entre os tubos.
3. Proteínas biotiniladas Bind para estreptavidina contas
   1. Distribuir os lisados ​​celulares para os tubos contendo as pérolas de agarose. Para experiências whe re várias amostras estão sendo comparados, certifique-se de usar a mesma quantidade de proteína para cada amostra para comparações precisas.
   2. Adicionar RIPA / PI adicional para levar a amostras de um volume mínimo de 200 ul. Isto assegura que as amostras se misturar adequadamente durante a incubação e também unifica as concentrações de proteína através de amostras.
   3. Colocar os tubos num rotor tubo e misturar durante a noite a 4 ° C.
   4. Em tubos separados, dispensar um equivalente do volume de lisado total utilizado para cada amostra. Alternativamente, se os volumes de amostra são elevados, uma fracção do volume total de lisado pode ser reservado em vez disso, para acomodar volumes de carga máxima em géis de SDS-PAGE. Estas serão usadas para normalizar a expressão de superfície para a quantidade total de proteína.
   5. Adicionar ou um volume igual de 2x ou 1/5 do volume de tampão de amostra de SDS-PAGE de 6x e ou incubar a 4 ° C, em paralelo com as amostras de grânulo, ou armazenar a -20 ° C até serem analisadas amostras.

ove_title "> 6. Elute e analisar amostras

1. Granulado de grânulos por centrifugação de 18.000 x g, 2 minutos, à temperatura ambiente.
2. Sobrenadante Aspirar e lavar contas três vezes com 0,75 ml RIPA. Para minimizar a perda de talão, deixe um pequeno volume de tampão cabeça acima contas entre lavagens. Após a lavagem final, retirar o máximo RIPA quanto possível, sem perturbar o sedimento talão.
3. Eluir proteínas a partir de contas de estreptavidina biotinilados através da redução da ligação dissulfureto. Adicionam-se 25 ul de SDS-PAGE 2x tampão de amostra redutora, de vórtice e assim rodar as amostras 30 min, temperatura ambiente.
   Nota: Muitas proteínas da membrana têm uma elevada tendência para se agregar quando fervidos em tampão de amostra de SDS-PAGE, prejudicando gravemente a sua mobilidade electroforética. Se este é o caso para a proteína a ser investigado, evitar aquecimento das amostras e, em vez disso, eluir-se lentamente à temperatura ambiente. Se ferver é absolutamente necessário (por exemplo, se uma outra proteína avaliada em paralelo requer ebulição), sample tampão pode ser suplementado com ureia 2 M (concentração final) para minimizar a agregação. Embora eficaz na redução da agregação, em alguns casos, ureia frequentemente compromete a aparência da banda.
4. Analisar amostras por immunoblot.
5. Descongele as amostras totais lisado e rodar em paralelo com amostras de talão, 30 min, a temperatura ambiente.
6. Proteínas separadas em géis de SDS-PAGE.
7. Identificar proteína (s) de interesse por immunoblotting.
   1. Esteja certo de que as bandas são detectados na faixa linear de detecção para a quantificação adequada.
   2. Para garantir que o reagente biotinilaï não teve acesso a proteínas intracelulares via células danificadas / comprometidos. Isto é melhor realizado por imunotransferência em paralelo para uma proteína intracelular específica para o tipo de célula a ser investigado.
   3. Quantificar densidades banda e calcular relativa densidade de superfície da proteína como um por cento do nível total de expressão da proteína.

Representative Results

Discussion

Apesar do conhecimento de longa data que o tráfico endocítico criticamente impactos sinalização sináptica no cérebro, tem-se revelado difícil de medir quantitativamente mudanças na expressão da proteína de superfície em neurônios adultos. Neste trabalho, relatamos uma abordagem confiável para rotular proteína de superfície ex vivo em fatias cerebrais agudas. Preparações fatia do cérebro têm uma longa história de utilidade para registros eletrofisiológicos, que mantenham conexões sinápticas e viabilidade celular até horas após a sua preparação. Além disso, as estratégias de corte pode ser otimizado para preservar conexões sinápticas específicas entre várias regiões do cérebro de interesse.

Grande parte do trabalho antes investigando o tráfico de proteína neuronal em preparações derivadas do cérebro tem dependido principalmente sobre sinaptossomas e neurônios cultivados primários. O método slice abordagem biotinilaï aguda possui várias vantagens sobre qualquer um dos these: sinaptosomas estão fisicamente removido do axônio e não pode conter os fatores moleculares necessárias para recapitulam fielmente tráfico proteína neuronal intacta. Além disso, as preparações sinaptosomais são muitas vezes contaminados com fragmentos de membrana que pode distorcer os resultados experimentais. Culturas neuronais primárias são tipicamente derivados de neurónios developmentally imaturas que não pode ter apropriadamente diferenciadas em seus fenótipos neuronais maduros expressam mecanismos de tráfico específicos de células. Em contraste, as fatias agudas apresentam elevado grau de viabilidade da célula e são derivadas de animais adultos. Além disso, o tráfico de superfície pode ser comparado seguinte in vivo manipulações moleculares, como o gene de entrega / knockdown, optogenetic neuronal estimulação / inibição, ou seguir em tratamentos com drogas vivo ou adaptações comportamentais.

Embora haja muitas vantagens para o ex vivo spiolhos abordagem, existem várias limitações bem. Aguda (noncultured) fatias de cérebro tem viabilidade limitada e não são, portanto, adequados para os tratamentos com drogas crônicos. Além disso, observou-se que eles não permanecem viáveis ​​durante as experiências de mudança de temperatura, onde fatias são rapidamente refrigerados e reaquecido. Além disso, as fatias são mais viável, quando preparado a partir de ratinhos P21-P35, o que pode limitar a quantidade de tempo que os tratamentos in vivo pode ser realizada antes de se efectuar as experiências. De fato, usando uma solução de corte de alta sacarose, descobrimos que o tráfico de DAT é menos reprodutível observada em fatias preparadas a partir de ratos P35-P42 (Gabriel e Melikian, dados não publicados). No entanto, observa-se nitidamente melhor viabilidade fatia em animais mais velhos usando a preparação fatia modificado como descrito em ²⁴ Zhao et al. Esta abordagem é uma excelente alternativa onde os parâmetros metodológicos exigir o uso de animais mais velhos (ou seja. Seguinte eitsua expressão viral mediada por proteína / RNA, estabelecendo comportamentos, ou crônica em tratamentos com drogas in vivo).

Há vários fatores técnicos adicionais que podem influenciar o resultado experimental. É imperativo para determinar empiricamente a relação ideal talão / total de proteína necessária para capturar toda a proteína biotinilado em uma determinada quantidade de proteína total lisado antes de tentar experimentos quantitativos. Esta questão é muitas vezes esquecido, mas pode ser o fator decisivo na capacidade de detectar mudanças na expressão da proteína de superfície. Se toda a proteína não é biotinilado quantitativamente recuperadas, as alterações dos níveis de superfície vai ser indetectável ou imprecisa medido. Outra variável que pode influenciar os resultados é o volume de tampão de lise utilizada para dissociar as fatias de tecido. A massa de tecido absoluto usado dependerá da região de interesse a ser investigado, e vai likely necessitar de mais ou menos de tampão de lise, a fim de atingir a solubilização completa dos tecidos. Como tal, as concentrações finais de proteína lisado podem também variar entre regiões do cérebro. Portanto, as condições de lise deve ser determinada empiricamente para uma dada região do cérebro e mantido constante entre experiências independentes.

Em resumo, nós fornecemos um protocolo detalhado para medir o tráfico de proteína neuronal em neurônios adultos usando fatias de cérebro ex vivo agudas. A utilização desta abordagem é susceptível de conduzir a uma compreensão mais aprofundada dos mecanismos de tráfico endocíticas que fundamentam a função neuronal.

Materials

sulfo NHS-SS-biotin	Pierce	21331
Streptavidin agarose	Pierce	20347
IgG-free, Protease-free bovine serum albumin	Sigma	A3059
Vibrating microtome sectioner	various
Shaking water bath	various
Millicell mesh-bottomed inserts (8 µm pore size)	Millipore	PI8P 012 50	These can be washed by hand and reused